CD133阳性/阴性肺癌细胞的分选、鉴定及差异基因的筛选

背景与目的研究表明多种实体肿瘤中存在肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs),肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞的生物学特性存在已有的明显差异,而CD133被认为是肿瘤干细胞的标记物,因此CD133阳性细胞与CD133阴性细胞可能存在明显差异。本研究通过分选人肺腺癌A549细胞中的CD133阳性及CD133阴性细胞,鉴定两组细胞的生物学特性并在人组织标本进行验证,利用基因芯片筛选转移相关差异基因。方法采用磁式分选(magnetic activated cell sorting,MACS)的方法对人肺腺癌A549中CD133阳性细胞、CD133阴性细胞进行分选,通过无血清条件培养、平板克隆、血清诱导分化及基因芯片等实验,比较两组细胞"sphere"形成、细胞增殖、细胞分化以及差异基因,并在人组织标本进行CD133表达与临床特性的验证分析。结果 CD133阳性细胞能在无血清培养基中悬浮生长并形成"sphere";其平均克隆形成率(57.1%)明显高于CD133阴性细胞(3.3%);CD133阳性细胞能被血清诱导分化、表达腺癌标志物CK7;两组细胞中的19个转移基因表达水平相差两倍或以上,差异最高达12倍;肺癌组织中CD133阳性细胞主要分布于癌巢周边,数量稀少,其表达与肿瘤组织学分型、分级及临床分期无关。结论 CD133阳性肺腺癌A549细胞具有CSCs特性;两组细胞在转移相关基因的表达存在明显差异,其中CD82可能在CD133阳性细胞的转移机制中起重要作用。     

血清中晚期糖基化终产物及其受体对妊娠期糖尿病围产儿结局的预测价值

目的探讨妊娠期糖尿病孕妇(GDM)血清中晚期糖基化终产物(AGEs)-晚期糖基化终产物受体(RAGE)轴所介导的氧化应激反应与围产儿结局间的关系。方法选择2011年1月至12月在广州市妇女儿童医疗中心产科检查,孕24～28周产前检查被诊断患有GDM的孕妇100例为研究对象(GDM组),另选择同期、相应年龄的正常妊娠妇女50例作为正常对照组。抽取两组孕妇的血样,测量空腹血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)和AGEs、可溶性RAGE(sRAGE)水平。分娩后收集胎盘,分析组织中RAGE蛋白的表达。并收集母婴临床信息,根据围产儿结局异常与否分为GDM正常围产儿结局组和GDM不良围产儿结局组。结果 GDM组治疗前孕妇血清AGEs水平(50.44±16.21)ng/L,明显高于正常对照组(32.69±10.13)ng/L(P<0.01)。GDM组经干预治疗后其空腹血糖和HbA1c水平与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);但血清AGEs水平仍然高于正常对照组(P<0.01)。GDM组孕母血清AGEs与sRAGE水平呈负相关(r=-0.582,P<0.01)。GDM不良围产儿结局组孕妇血清AGEs水平(67.39±14.75)ng/L明显高于GDM正常围产儿结局组(41.59±12.26)ng/L(P<0.05)。Logistic回归分析显示高AGEs水平是GDM不良围产儿结局的危险因子(OR=6.197,P<0.01,95%CI2.514～15.453);低sRAGE水平也是GDM不良围产儿结局的危险因子(OR=0.498,P<0.05,95%CI0.217～0.925)。GDM不良围产儿结局组(0.993±0.085)高于GDM正常围产儿结局组(0.611±0.047)和正常对照组(0.247±0.018)(P均<0.01)。结论血清高AGEs水平是GDM围产儿结局的一个不利因素,高AGEs水平可作为GDM不良围产儿结局的预测指标。血循环中sRAGE可通过竞争结合方式中和AGEs,抑制其下游信号的传递,血清低sRAGE水平可作为GDM病变中AGEs-RAGE轴过度活跃的生物标记。     

探讨NOS-NO系统在糖尿病足患者发病机制中的作用

30例DF患者,23例单纯糖尿病患者,以及25例非糖尿病正常人血浆标本和足部皮肤组织标本。进行血浆NO的测定,皮肤组织iNOS、eNOS采用免疫组化的方法进行观察。结果血浆NO浓度各组差异无显著性(P0.05)。iNOS、eNOS表达。单纯糖尿病组较对照组表达减弱(P0.05),DF病组较单纯糖尿病组表达进一步减弱(P0.05)。结论DF患者血浆NO浓度有下降趋势,足部组织中iNOS、eNOS的表达明显降低,提示NOS-NO系统表达的下调与DF的发生发展有密切关系。     

妊娠期糖尿病母胎并发症分析及相关因子VEGF的表达

目的探讨妊娠期糖尿病孕妇(GDM)常见母胎并发症与孕母血清、胎盘组织中血管内皮生长因子(VEGF)表达的变化,并阐述其意义。方法在孕龄24～28周之间被诊断患有GDM的孕妇中收集产前检查提示存在母胎并发症的孕妇,为病例组,总数为264例;随机选择GDM无母胎并发症的孕妇,作为对照组,30例;采用酶联免疫法检测孕母血清VEGF水平,分娩后收集胎盘,采用反转录-聚合酶链反应方法检测胎盘组织中VEGF的mRNA表达。结果①GDM合并胎儿生长受限(FGR)组孕母血清VEGF水平明显低于其他组(P<0.05);②GDM合并妊娠期高血压疾病组孕母血清VEGF水平明显高于其他组(P<0.05);③GDM合并胎儿FGR组胎盘组织中VEGF的mRNA表达明显低于其他组(P<0.05);④GDM合并妊娠期高血压疾病组胎盘组织中VEGF的mRNA表达明显高于其他组(P<0.05)。结论①GDM孕母血清低VEGF水平可作为GDM产前预测合并FGR的筛查指标之一。②GDM孕母血清高VEGF水平可作为GDM产前预测合并妊娠期高血压疾病的筛查指标之一。     

靶向血管内皮生长因子C短发夹式RNA对人乳腺癌MCF-7细胞生物学特性的影响

目的 研究重组质粒表达载体介导的短发夹式RNA(shRNA)对乳腺癌MCF-7细胞株中血管内皮生长因子C(VEGF-C)的表达及乳腺癌细胞增殖、侵袭能力的影响.方法 脂质体介导重组质粒pSIREN-VEGF-C转染乳腺癌MCF-7细胞株,嘌呤酶素筛选阳性克隆;荧光定量PCR及Western blot检测转染前后乳腺癌MCF-7细胞中VEGF-C基因的表达;MTT法及Transwell体外侵袭实验检测转染前后乳腺癌MCF-7细胞的增殖及侵袭能力.结果 转染重组质粒后乳腺癌MCF-7细胞中VEGF-C mRNA及蛋白表达均明显下调,抑制率分别为95%及100%(P<0.05);MTT法和 Transwell体外侵袭实验显示,与阴性质粒组和空白对照组比较,转染重组质粒后各时间段乳腺癌MCF-7细胞增殖均明显受抑制(P<0.05),同时穿膜的肿瘤细胞数也明显减少[(29.0±1.9)个与(59.0±2.1)个和(61.0±2.2)个相比,P<0.05].结论 表达VEGF-C shRNA的重组质粒载体pSIREN-VEGF-C在乳腺癌MCF-7细胞中能高效、特异地发挥靶基因沉默作用,并对乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力有显著抑制作用.     

扩散峰度与扩散张量成像对比评估兔周围神经急性挤压伤

目的:对比扩散峰度成像(DKI)与扩散张量成像(DTI)评估兔周围神经挤压伤的价值。方法:选取新西兰大白兔27只，于右后肢建立坐骨神经损伤与修复模型，左后肢为假手术侧。分别于术前、1、3天、1、2、4、6、8周行DTI及DKI扫描，测量各时间点定量参数，并于各时间点随机取2只兔子行电镜检查。结果:DKI参数中平均峰度(MK)值在损伤后第1天明显下降并在较低水平波动，自第2～8周逐渐上升，损伤侧与假手术侧MK值于2～8周差异均有统计学意义(P<0.05);损伤后1天各向异性分数(FADKI)值明显下降至最低点；3天～8周持续上升，各时间点差异均有统计学意义(P<0.005);径向峰度(RK)值仅在6周时双侧差异有统计学意义(P=0.018);而轴向峰度(AK)值于各时间点均无显著差异(P>0.05)。DTI参数中FADTI与FADKI变化趋势一致且各时间点差异均有统计学意义(P<0.001);ADC值仅在第8周差异有统计学意义(P=0.038)。结论:DKI可用于周围神经急性挤压伤的评估，但与DTI相比，DKI在评估急性周围神经损伤时可能并不能提供额外价值。     

扩散峰度与扩散张量成像对比评估兔周围神经急性挤压伤

目的:对比扩散峰度成像(DKI)与扩散张量成像(DTI)评估兔周围神经挤压伤的价值.方法:选取新西兰大白兔27只,于右后肢建立坐骨神经损伤与修复模型,左后肢为假手术侧.分别于术前、1、3天、1、2、4、6、8周行DTI及DKI扫描,测量各时间点定量参数,并于各时间点随机取2只兔子行电镜检查.结果:DKI参数中平均峰度(MK)值在损伤后第1天明显下降并在较低水平波动,自第2～8周逐渐上升,损伤侧与假手术侧MK值于2～8周差异均有统计学意义(P<0.05);损伤后1天各向异性分数(FADKI)值明显下降至最低点;3天～8周持续上升,各时间点差异均有统计学意义(P<0.005);径向峰度(RK)值仅在6周时双侧差异有统计学意义(P=0.018);而轴向峰度(AK)值于各时间点均无显著差异(P>0.05).DTI参数中FADTI与FADKI变化趋势一致且各时间点差异均有统计学意义(P<0.001);ADC值仅在第8周差异有统计学意义(P=0.038).结论:DKI可用于周围神经急性挤压伤的评估,但与DTI相比,DKI在评估急性周围神经损伤时可能并不能提供额外价值.     

胰岛素样生长因子-Ⅰ受体与糖尿病足溃疡的相关性研究

目的探讨胰岛素样生长因子-Ⅰ(Insulin-like Growth Factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)受体两亚基(α,β)在糖尿病足患者(DF组)足溃疡创面、单纯糖尿病患者(DM组)皮肤和非糖尿病患者(NC组)正常皮肤中的分布和表达特征,旨在阐明其表达水平变化与糖尿病足溃疡创面的内在联系。方法 DF组30例,DM组23例,NC组25例,用免疫组织化学观察其足部组织的IGF-ⅠRα、IGF-ⅠRβ的表达。结果在IGF-ⅠRα和IGF-ⅠRβ的阳性细胞率和表达强度上,DM组较NC组表达减弱(p<0.05),DF组较DM组表达进一步减弱(p<0.05)。结论糖尿病足患者足溃疡创面IGF-ⅠRα和IGF-ⅠRβ表达减少,提示IGF-ⅠRα和IGF-ⅠRβ的表达下调可能参与了糖尿病足的发病。     

靶向人血管内皮生长因子-C基因的shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建靶向人血管内皮生长因子-C(VEGF-C)基因的shRNA真核表达载体并检测其对靶基因的沉默效应.方法:根据靶基因VEGF-C序列,设计、合成编码其shRNA的互补寡核苷酸序列,克隆至线性化的pSIREN-RetroQ载体中并对重组质粒进行酶切分析及测序鉴定;脂质体介导重组质粒转染乳腺癌MCF-7细胞株,荧光定量PCR及Westen-blot检测其对靶基因VEGF-C表达的影响.结果:酶切及测序鉴定重组质粒pSIREN-VEGF-C的序列正确;转染重组质粒后乳腺癌MCF-7细胞中VEGF-C mRNA及蛋白表达均明显下调,抑制率分别为95%及100%(P＜0.05).结论:成功构建了靶向人VEGF-C基因的shRNA真核表达载体,并在乳腺癌MCF-7细胞中高效、特异地发挥靶基因沉默作用.