细胞周期蛋白25A在非小细胞肺癌中的表达及与Let-7关系

目的 明确细胞周期蛋白25A（CDC25A）在NSCLC组织中的表达及与临床病理特征的关系,并探讨其与miRNA let-7a1、let-7c表达的相关性。方法 收集53例肺组织手术标本,其中包括NSCLC组织44例,收集其癌组织和癌旁正常组织（病理证实）,和良性肺疾病组织9例。免疫组化Elivision法检测CDC25A蛋白的表达;用Trizol法提取总RNA,采用荧光定量RT-PCR检测CDC25A mRNA的表达,加尾法荧光定量RT-PCR检测let-7a1和let-7c mRNA的表达。结果 CDC25A蛋白表达的阳性率在NSCLC组织明显高于癌旁正常组织和良性肺疾病组织（P<0.05）。NSCLC组织中CDC25A蛋白的表达与年龄、性别、病理类型、肿瘤分化程度、临床分期无关（P>0.05）,与吸烟、淋巴结转移相关（P<0.05）。CDC25A mRNA在NSCLC组织中的表达量明显高于癌旁正常组织和良性肺疾病组织（F=6.33,P<0.05）,在癌旁正常组织和良性肺疾病组织中表达无明显差异（P>0.05）。Pearson 相关分析显示CDC25A与let-7c在NSCLC组织和癌旁正常组织中表达均呈明显负相关（r 癌组织=-0.42,r 癌旁正常组织=-0.40）,与let-7a1之间无明显相关。结论 CDC25A在NSCLC组织表达水平明显增高,且与let-7c表达呈明显负相关,推测CDC25A可能是let-7c的下游靶基因。     

let-7a1和let-7c在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的探讨人类微小RNA let-7a1和let-7c在肺癌组织中的表达及与临床病理特征之间的关系。方法收集53例肺组织手术标本及临床资料,其中包括肺癌组织44例（收集其癌组织和癌旁正常组织）和良性肺疾病组织9例。并收集病人吸烟史、肿瘤TNM分期、病理分化程度及有无淋巴结转移等。采用Trizol法提取总RNA,采用荧光定量PCR检测let-7a1和let-7c的表达,分析其在肺癌组织、癌旁正常组织及良性肺疾病组织中的表达差异及与临床特征的关系。结果肺癌组织中let-7a1和let-7c的相对表达量均低于癌旁正常组织和良性肺疾病组织（P < 0.05）;癌旁正常组织中let-7a1和let-7c的相对表达量均低于良性肺疾病组织（P < 0.05）。let-7a1表达与分化程度、吸烟和TNM分期有关（P < 0.05~P < 0.01）,与淋巴结有无转移无关（P>0.05）。let-7c表达与淋巴结转移、分化程度有关（P < 0.01）,与吸烟、TNM分期无关（P>0.05）。结论let-7a1和let-7c基因在肺癌组织中相对表达量降低,并且随临床分期进展、淋巴结转移呈明显下降趋势,提示两者与肺癌的发生、发展及转移密切相关,let-7a1和let-7c可能成为肺癌早期诊断生物标志因子,并可能成为肺癌的靶向治疗新的靶点,为高危人群的早期干预提供实验依据。     

miRNA let-7a靶向抑制ACVR1B表达

目的：探讨miRNA let-7a对ACVR1B表达的影响。方法：生物信息学分析表明activin receptor type 1B（ACVR1B）是一个let-7a的潜在靶基因。构建ACVR1B 3’UTR野生型（ACVR1B 3’UTR-WT）和ACVR1B 3’UTR突变型（ACVR1B 3’UTR-MUT）双荧光素酶报告载体,分别与let-7a模拟物（let-7a mimic）或let-7a阴性对照（let-7a NC）共同转染HEK293T细胞,通过双荧光素酶报告系统检测各组细胞的荧光素酶活性。分别转染let-7a mimic、let-7a inhibitor和let-7a NC至HEK293T细胞,采用qRT-PCR和Western blot分别检测ACVR1B的mRNA和蛋白表达水平。结果：ACVR1B 3’UTR含有let-7a潜在的高度保守的结合靶点（77～83位点）。在HEK293T细胞中共转染ACVR1B 3’UTR-WT报告载体的let-7a mimic组比let-7a NC组荧光素酶活性组明显降低（P＜0.05）;而共转染ACVR1B 3’UTR-MUT报告载体的let-7a mimic与let-7a NC组其荧光素酶活性差异无统计学意义（P＞0.05）。在HEK293T细胞中let-7a mimic转染组中ACVR1B的mRNA和蛋白水平均低于let-7a NC组和let-7a inhibitor组（P＜0.05）。结论：ACVR1B是let-7a潜在调控的靶基因,miRNA let-7a可以直接抑制HEK293T细胞中ACVR1B基因的表达。     

let-7和HMGA2在肺癌发生发展中作用的Meta分析

目的：采用Meta分析方法评价let-7低表达在肺癌预后中的作用及高迁移率旋蛋白A2（HMGA2）表达与肺癌关系的临床意义。方法：计算机检索PubMed、Web of Science、Medline、Cochrane Library、Google、Scholar、CNKI、CBM、万方和维普等数据库,收集关于let-7低表达与肺癌预后及HMGA2与肺癌发生发展的关联性研究,采用StataSE12.0软件进行Meta分析。结果：共纳入10篇关于let-7低表达与肺癌预后关系的文献用于Meta分析,均为非小细胞肺癌患者。let-7低表达预示着肺癌患者较差的总生存率,风险比（HR）的合并值为1.55（95% CI：1.16~2.09,P<0.05）。共纳入9篇关于HMGA2表达与非小细胞肺癌发生发展关系的病例对照研究用于Meta分析,肺癌组织中HMGA2表达阳性率明显高于癌旁正常组织（OR=5.92,95% CI：3.96~8.85,P=0.000）。HMGA2在肺癌组织的表达与肺癌TNM分期、有无淋巴结转移有明显关联（OR=0.26,95% CI：0.16~0.41,P<0.05;OR=0.29,95% CI：0.12~0.71,P<0.05）。结论：肺癌患者中let-7低表达是肺癌患者预后的危险因素。HMGA2表达阳性率越高,肺癌发生的概率就越高,越具有侵袭性。     

血清中miR-21和let-7a在胃癌无创性诊断及手术效果评定中的作用

目的:探讨血清中miR-21和let-7a在胃癌无创性诊断以及手术效果评定中的作用。方法:采用荧光定量PCR法分别检测正常对照、胃窦溃疡、胃窦炎性息肉、肠上皮化生及胃窦腺癌患者血清样本及配对胃组织中miR-21和let-7a的表达。结果:血清中miR-21和let-7a的含量与配对组织中二者的表达量呈正相关(rS=0.826和0.889,P<0.001)。术后胃癌患者血清中miR-21含量较术前降低(t=0.511,P=0.030),而let-7a则升高(t=0.770,P<0.001)。5组对象血清中miR-21和let-7a含量差异均有统计学意义(χ2=10.841,P=0.028;χ2=26.460,P<0.001)。与正常对照组相比,胃癌患者血清中miR-21含量升高,肠化及胃癌患者血清中let-7a含量降低。结论:血清中miR-21和let-7a的含量可能成为胃癌的无创诊断及手术效果评定的一种新的有效的生物标记。     

高迁移率蛋白A2在浆液性卵巢癌中高表达及其与let-7家族microRNA的关系

目的：检测高迁移率蛋白A2（high mobility group A2, HMGA2）、let-7家族microRNA和P53在浆液性卵巢癌中的表达,分析HMGA2和let-7家族microRNA的关系,比较HMGA2与P53在浆液性卵巢癌中的表达情况。方法：用免疫组织化学方法检测50例卵巢癌和4例正常输卵管石蜡包埋标本中HMGA2和P53蛋白的表达,采用实时荧光定量逆转录-PCR方法检测对应标本以及卵巢癌细胞系中HMGA2 mRNA和let-7家族microRNA的表达。结果：HMGA2 和P53在浆液性卵巢癌中免疫组织化学染色阳性率分别为70%（35/50）和78%(39/50)。HMGA2在输卵管纤毛上皮中有微弱表达,在分泌型上皮细胞中不表达;HMGA2的表达存在随着肿瘤病理分级的增高而增高的趋势,但与肿瘤临床分期没有关系。HMGA2 mRNA在所有卵巢癌标本中均能检测到,但在72%（36/50）的标本中表达量高于正常输卵管组;恶性程度高的细胞系（SKOV3.ipl）比恶性程度低(SKOV3)的细胞系HMGA2 mRNA表达更高。let-7家族各成员在所有浆液性卵巢癌标本中均表达,其表达量与HMGA2 mRNA呈低度负相关(r=-0.305,P＜0.05)。结论：HMGA2可能与P53一样,可以作为浆液性卵巢癌的生物标志物,其表达与浆液性卵巢癌恶性程度有关。let-7表达降低是HMGA2在浆液性卵巢癌中高表达的一种、但非唯一机制。     

基质金属蛋白酶7 mRNA在胰腺癌组织中表达的临床意义

目的探讨胰腺癌基质金属蛋白酶-7（（matrix metalloproteinase-7,MMP-7）在胰腺癌组织中表达及临床病理意义。方法提取35例人胰腺癌及癌旁正常组织中总mRNA,采用实时荧光定量PCR法检测其中MMP-7mRNA表达情况;并分析其表达与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、肿瘤分化程度和TNM分期相关性。结果以2^-ΔΔCt≥2为阳性标准,MMP-7在胰腺癌组织中阳性表达率为82.9%（29/35）,而癌旁组织未见MMP-7mRNA表达,统计学差异显著（P〈0.001）。MMP-7mRNA过表达与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期密切相关（P〈0.01）,而与患者年龄和肿瘤分化程度无关（P〉0.05）。结论MMP-7基因表达与胰腺癌进展密切相关,可能是反映胰腺侵袭转移的重要指标之一。     

胰腺癌组织FOXC2的表达及其与预后的关系

目的: 探讨叉头框C2(forkhead box C2,FOXC2)在胰腺癌中的表达及其与胰腺癌患者预后的相关性。方法: 利用Oncomine数据库分析FOXC2 mRNA在胰腺癌及癌旁组织中的表达;收集112例胰腺患者癌组织及相应癌旁组织,采用qRT-PCR和免疫组织化学染色检测FOXC2的表达,并分析其与临床病理参数的关系。应用Kaplan-meier法分析FOXC2表达对患者生存时间的影响。结果： Oncomine数据库中FOXC2 mRNA在胰腺癌癌组织中表达明显高于癌旁组织(t_Badea=4.074,t_Pei= 3.741,P均<0.05);FOXC2蛋白主要表达于胰腺癌细胞胞核,且癌组织免疫组化评分明显高于癌旁组织( t=7.571,P<0.05);FOXC2 mRNA在胰腺癌组织中表达明显高于癌旁组织( t=13.79,P<0.05);有淋巴结转移的癌组织中FOXC2阳性表达率高于无淋巴结转移的癌组织(χ ² =16.998,P<0.01),胰腺癌Ⅲ期FOXC2阳性表达率高于Ⅰ期( χ 2=15.688,P<0.001)和Ⅱ期( χ ²=10.678,P=0.001)。FOXC2阳性组胰腺癌患者的中位生存时间显著短于阴性组( χ ²=10.32,P=0.001 3),FOXC2阳性表达(HR=2.569,P=0.003)可作为预测胰腺癌预后的独立因素。 结论： FOXC2在胰腺癌组织中呈高表达,且与胰腺癌患者的预后高度相关。     

创伤性脑损伤患者脑组织中miRNA let-7i水平变化及其临床意义

目的 探讨创伤性脑损伤患者脑组织中miRNA let-7i水平变化及其临床意义。方法 选取金华市人民医院收治的创伤性脑损伤患者105例为病例组,分为轻度组35例、中度组56例、重度组14例; <24h组20例、≥24h且≤72h组45例、>72h组40例以及死亡组20例、存活组85例;同期选择于金华市人民医院行脑血管瘤切除术的患者76例为对照组。测定创伤性脑损伤脑组织及正常脑组织miRNA let-7i水平以及IL-4、IL-8、IL-12、IFN-γ、TNF-α、hs-CRP水平。结果 病例组miRNA let-7i水平高于对照组(P<0.05);随着脑损伤严重程度的增加,miRNA let-7i水平逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05);随着脑损伤时间段的延长,miRNA let-7i水平逐渐增加(P<0.05);死亡组miRNA let-7i水平高于存活组(P<0.05);病例组血清 IL-4、IL-8、IL-12水平高于对照组(P<0.05);病例组血清中TNF-α、hs-CRP均高于对照组,IFN-γ低于对照组(P<0.05);miRNA let-7i与IL-4、IL-8、IL-10、TNF-α、hs-CRP正相关关系明显(P<0.05);高水平的miRNA let-7i、GCS、TNF-α均为创伤性脑损伤患者发生死亡的危险因素(P＜0.05)。结论 创伤性脑损伤患者脑组织中miRNA let-7i水平升高,其与脑损伤严重程度及脑部炎症反应密切相关;高水平的miRNA let-7i为创伤性脑损伤患者发生死亡的危险因素。     

microRNA let-7在COPD稳定期男性患者血清中的表达及临床意义

目的：探讨microRNA let-7在慢性阻塞性肺疾病（COPD）稳定期男性患者血清中的表达及其临床意义。方法：选取160例COPD稳定期患者和100例健康志愿者,收集一般临床资料,采集血浆样本并4℃离心提取血清;qPCR检测各组血清中let-7a、let-7c、let-7d相对表达水平;对let-7与肺通气功能进行相关性分析;ROC曲线分析let-7对COPD的诊断价值。结果：COPD患者血清let-7a、let-7c、let-7d表达量明显低于不吸烟对照组和吸烟对照组（P<0.05）;GOLD分组之间血清let-7表达量无明显差异（P>0.05）;吸烟对照组血清let-7的表达量低于不吸烟对照组,但差异无统计学意义（P>0.05）。经Pearson分析,血清let-7表达量与FEV1/FVC、MEF75%pred、MEF50%pred、MEF25%pred、MMEF75/25%pred均呈正相关（P<0.05）,其中let-7与MMEF75/25%pred的相关性最强;let-7c与FEV1%pred呈正相关（P<0.05）,而let-7a、let-...     

miR-let-7c-5p通过靶向HMGA2抑制膀胱癌细胞侵袭和迁移

目的 探讨miR-let-7c-5p能否调控HMGA2抑制膀胱癌细胞侵袭和迁移。方法 生物信息学方法确定miR-let-7c-5p的关键基因;RT-qPCR和Western blot检测膀胱癌和癌旁组织中miR-let-7c-5p mRNA和HMGA2 蛋白相对表达量。以人正常膀胱细胞SV-HUC-1作为对照,RT-qPCR和Western blot检测膀胱癌细胞系T24,UM-UC-3,5637细胞中miR-let-7c-5p mRNA和HMGA2蛋白的相对表达量。对UM-UC-3细胞中miR-let-7c-5p分别进行上调和下调,上调实验设模拟物阴性对照组（mimic-NC）、miR-let-7c-5p模拟物组（mimicmiR-let-7c-5p）、下调实验设阴性对照组（inhibitor NC）及miR-let-7c-5p抑制剂组（si-miR-let-7c-5p）,双荧光素酶实验、RT-qPCR和Western blot法共同验证miR-let-7c-5p和HMGA2的靶向关系;Transwell小室检测单独上调或下调miR-let-7c-5p表达及同时下调miR-let-7c-5p和HMGA2表达UM-UC-3细胞侵袭和迁移的变化;Western blot检测上皮间质转化（EMT）相关蛋白（E-cadherin, N-cadherin, vimentin, Snail）相对表达量。结果 HMGA2为miR-let-7c-5p的靶基因之一;与癌旁组织相比,膀胱癌组织中miR-let-7c-5pmRNA相对表达量降低（P<0.05）,HMGA2蛋白相对表达量增加（P< 0.05）;与SV-HUC-1细胞相比,UM-UC-3细胞中miR-let-7c-5p相对表达量显著降低,HMGA2显著增加（P=0.01）。上调miR-let-7c-5p表达,UM-UC-3细胞侵袭和迁移能力均显著下降（P<0.05）;下调miR-let-7c-5p表达,UM-UC-3细胞侵袭和迁移能力均显著增加（P<0.05）;当同时下调miR-let-7c-5p和HMGA2表达UM-UC-3细胞侵袭和迁移能力显著下降（P<0.05）。Western blot结果显示,上调miR-let-7c-5p表达,E-cadherin表达增加,N-cadherin,vimentin,Snail蛋白表达下降;下调miR-let-7c-5p表达,E-cadherin表达下降,N-cadherin,vimentin,Snail蛋白表达增加;同时下调miR-let-7c-5p和HMGA2表达能够抑制UM-UC-3细胞EMT（P<0.05）。结论 miR-let-7c-5p通过靶向HMGA2抑制EMT进而抑制UM-UC-3细胞侵袭和迁移。     

MicroRNA let-7i对脂多糖诱导的树突状细胞及亚群功能的影响

目的探讨miRNA let-7i对脂多糖诱导的树突状细胞及亚群功能的影响。方法在LPS诱导DC成熟过程中,用miRNA let-7i抑制剂进行干预,然后用RT-PCR检测miRNA let-7i的表达水平;流式细胞仪分析DC的表型;用免疫磁珠将let-7i抑制剂处理的DCs分成两组:CD86+DC和CD86-DC,分别与T细胞共培养,观察CD86+DC和CD86-DC对T细胞增殖的影响;通过ELISA检测CD86+DC和CD86-DC分泌的细胞因子IL-10,IL-12和TNF-α的水平。结果转染miRNA let-7i抑制剂明显降低了LPS刺激的DC表面CD80和CD86的表达。LPS刺激的DCs伴随let-7i下调可分为两个亚群:CD86+DC和CD86-DC,且CD86-DC能更有效地诱导调节性T细胞的增多和抗炎症细胞因子的增多,并使促炎症细胞因子减少。结论抑制miRNA let-7i可以诱导DCs中CD86-DCs的表达,进而导致免疫耐受。     

Let-7d通过靶向调控Rhotekin基因抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭

目的 探讨let-7d在骨肉瘤组织中的表达,并研究let-7d及其靶基因对人骨肉瘤细胞U2OS增殖、迁移和侵袭的影响。方法 收集2010年至2015年于我科行手术切除的25例骨肉瘤患者的肿瘤组织和癌旁组织（距肿瘤组织边缘>5 cm）,并用qPCR检测let-7d的表达情况。构建稳定过表达let-7d的U2OS细胞,用qPCR验证let-7d过表达情况,以转染pCDH空病毒载体的U2OS细胞作为对照组细胞,并分别采用CCK-8实验、划痕实验和Transwell实验检测过表达let-7d对U2OS细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。通过微RNA靶基因预测软件和双荧光素酶实验明确let-7d的下游靶基因,检测过表达let-7d的U2OS细胞中靶基因的表达水平,并通过小干扰RNA技术研究抑制靶基因表达对U2OS细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果 骨肉瘤组织中let-7d表达水平低于癌旁组织（P<0.01）。与人成骨细胞hFOB1.19相比,U2OS细胞中let-7d表达水平下调（P<0.01）。与对照组相比,过表达let-7d能抑制U2OS细胞的增殖、迁移和侵袭（P均<0.05）。微RNA靶基因预测软件和双荧光素酶实验结果显示,Rhotekin（RTKN）基因是let-7d的直接靶基因,且过表达let-7d导致U2OS细胞中RTKN mRNA表达水平较对照组降低（P<0.01）。干扰RTKN表达能抑制U2OS细胞增殖、迁移和侵袭（P均<0.05）。结论 Let-7d通过靶向调控RTKN抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,可作为骨肉瘤治疗一个新的靶点。     

MiR-let-7g-3p靶向HMGB2调控膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡

目的 探讨MiR-let-7g-3p靶向HMGB2对膀胱癌细胞生物学行为的影响及其分子机制。方法 通过qRT-PCR检测膀胱癌组织和癌旁组织以及正常尿路上皮细胞SV-HUC-1和膀胱癌细胞（T24、5637和EJ）中let-7g-3p的表达水平;通过转染过表达或敲低T24细胞let-7g-3p表达,检测细胞增殖、迁移和侵袭、和凋亡等变化;对过表达let-7g-3p的细胞进行转录组测序,结合生物信息学分析,通过双荧光素酶报告实验、qRT-PCR和Western-blot分析let-7g-3p靶向负性调控HMGB2基因;qRT-PCR检测正常尿路上细胞和膀胱癌细胞（T24、5637和EJ）中HMGB2的表达水平,并且在敲低HMGB2的细胞株中,敲低let-7g-3p,检测细胞生物学行为改变。结果 qRT-qPCR证实let-7g-3p在膀胱癌组织和细胞表达明显下调（P<0.01）;过表达let-7g-3p可抑制细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡（P<0.01）;相反,敲减let-7g-3p表达可促进细胞增殖、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡（P<0.01）。生物信息学和转录组测序结果显示,HMGB2是let-7g-3p作用于膀胱癌细胞的关键分子;双荧光素酶报告实验、qRT-PCR和Westernblot显示,HMGB2受let-7g-3p的负性调控;HMGB2膀胱癌细胞中表达水平均明显上调（P<0.01）,敲低HMGB2可部分逆转敲低let-7g-3p对膀胱癌细胞生长的促进作用。结论 MiRNA-let-7g-3p通过靶向负性调控HMGB2基因抑制膀胱癌细胞的生物行为。     

原花青素上调let-7a抑制胰腺癌AsPC-1细胞生长及迁移

目的探讨原花青素是否通过上调let-7a表达而抑制胰腺癌细胞生长及迁移。方法体外培养人胰腺癌AsPC-1细胞,原花
青素处理细胞后,分别用MTT法、Annexin V-FITC/PI双染及Transwell迁移等实验检测细胞增殖率、细胞凋亡率及细胞迁移能
力的改变;利用miRNA实时逆转录PCR检测细胞内let-7a表达变化。AsPC-1细胞转染let-7a mimics后,MTT法、Transwell迁
移实验分别检测细胞增殖率及细胞迁移能力的改变。结果与对照组相比,原花青素处理AsPC-1细胞后,细胞增殖率、细胞迁
移能力随着原花青素浓度升高而下降,而细胞凋亡率随着药物浓度升高而逐渐升高。与对照组相比,原花青素处理细胞后,
let-7a的表达升高。通过脂质体转染let-7a mimics后,细胞的增殖率及迁移能力均低于对照组,且let-7a mimics 与原花青素共
同作用后,细胞增殖及迁移明显低于let-7a mimics和原花青素单独作用组。结论原花青素具有抑制胰腺癌细胞生长、迁移,及
诱导细胞凋亡的作用。原花青素可能是通过上调let-7a表达,从而抑制胰腺癌细胞的生长及迁移。