微滴式数字PCR和实时荧光定量PCR对新型冠状病毒肺炎患者不同时间血便尿中核酸检测结果初步探讨

目的 分析微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)的核酸检测结果,比较两种方法检测各类样本的差异性,为改进新型冠状病毒核酸检测方案提供数据支持。 方法 利用ddPCR和qPCR技术对已经确诊的3例新型冠状病毒肺炎患者发病不同时间的全血、尿液、粪便共22份标本进行新型冠状病毒核酸检测。 结果 两种方法对人保守区域基因扩增结果一致:全血标本信号最强,尿液次之,粪便最少;ddPCR在1份全血,1份尿液,5份粪便中检出ORF-1ab和N基因的阳性微滴,qPCR仅在3份粪便中检出上述基因,漏检的3个标本基因拷贝数平均浓度为128 copies/ml;ddPCR在发病<5、5~15、>15 d的各类标本中都有检出,qPCR检出以中晚期为主;重症病例用ddPCR均可测到阳性微滴,qPCR检测的各类标本均为阴性;轻症病例的各类标本中qPCR只有粪便核酸检测阳性,ddPCR检出率高于qPCR。 结论 ddPCR可以有效克服qPCR 灵敏度不足的难题,是对qPCR 的有益补充,尤其是针对病毒载量比较低的血液、尿液和可疑的粪便或肛拭子标本,适用于早期感染的判断及患者治愈后出院诊断。     

抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26-28kDa单链抗体与EGFP的融合表达及靶向性研究

目的 体外观察抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26～28kDa单链抗体与日本血吸虫各阶段的靶向部位,探讨单链抗体在抗血吸虫病疫苗研究中的应用价值.方法 扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,克隆至PET32a/SIEA26～28kDa-scFv质粒,构建PET32a/EGFP-scFv质粒.转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,并诱导表达单链抗体融合蛋白,分析单链抗体融合蛋白与SIEA26～28kDa的结合特异性.单链抗体融合蛋白与日本血吸虫成虫、虫卵切片孵育,荧光显微镜下观测GFP信号,确定特异性单链抗体的靶向性.结果 重组质粒PET32a/EGFP-scFv构建成功,Trx-EGFP-scFv融合蛋白高效表达,与SIEA26～28kDa特异性结合.GFP信号主要集中在未成熟卵卵胚,雌虫卵巢、卵黄腺及与生殖系统邻近的肠腔组织.结论 SIEA26～28kDa单链抗体与血吸虫未成熟卵胚胎及雌虫生殖系统具有较强的靶向性,具有潜在抗卵胚发育、抗雌虫生殖作用,为SIEA26～28kDa单链抗体在抗日本血吸虫病疫苗免疫靶向方面的研究奠定了基础.     

2012-2014年湖南省感染性腹泻哨点医院儿童诺如病毒感染及基因型别分析

目的 了解湖南省感染性腹泻哨点医院儿童诺如病毒的感染状况及基因型别。 方法 2012年1月-2014年12月采集湖南省哨点医院腹泻患儿的粪便标本,应用诺如病毒特异性引物进行扩增,选择扩增阳性产物进行基因测序和进化分析。 结果 936份粪便标本RT-PCR检测诺如病毒核酸,阳性100份,阳性率10.68%。对40份诺如病毒核酸阳性标本进行基因序列测定与分析,38份为GⅡ型,其中31份为GⅡ.4型。在31株GⅡ.4型中,Sydney 2012和GII.4 Den Haag 2006b各栓出14株。 结论 2012-2014年湖南省哨点医院儿童腹泻病例中诺如病毒的感染率较高,GⅡ.4是优势株,其中GⅡ.4 sydney 2012和Den Haag 2006b是主要型别。     

血吸虫病的诊断检测技术及研究进展

血吸虫病的诊断检测技术在血吸虫病的防治中具有极其重要的作用。近年来除了病原学诊断技术的改进,免疫学诊断技术也因为其良好的敏感性、特异性和实用性,成为当前血吸虫病的常用诊断手段,而且随着分子生物学、免疫化学、免疫传感器等新技术的渗入．极大地促进了血吸虫病诊断方法和检测技术的改进和发展。     

2015—2020年湖南省感染性腹泻病原学及分子流行病学特征分析

目的 了解湖南省感染性腹泻的病原谱,追踪其分子流行病学演变趋势,为感染性腹泻的综合防治提供科学依据。 方法 通过哨点监测结合暴发疫情监测的方法,收集2015—2020年湖南省感染性腹泻标本,对细菌病原采用细菌培养、生化鉴定进行检测;对病毒病原采用分子生物学方法进行分型鉴定,并对部分PCR阳性标本进行序列测定。 结果 哨点医院主动监测的总阳性率为35.61%,病毒检出率20.26%高于细菌检出率11.26%,混合病原感染检出率为4.09%。细菌病原谱以沙门菌O∶4群鼠伤寒型为主,病毒病原谱以轮状病毒A组G9P[8]型和诺如病毒GⅡ.4Sydney[P31]型感染为主。不同监测、不同年份的病原谱构成及其基因型变迁规律各不相同:哨点医院监测细菌阳性率低而病毒阳性率高时,诺如暴发疫情随之增加;暴发疫情中诺如病毒感染为86.78%,其中69.43%为GⅡ型感染,12.42%为GⅠ型感染,混合感染占3.03%。诺如病毒暴发疫情具有明显季节性,优势基因型为GⅡ.2[P16]占42.97%。 结论 2015—2020年湖南省感染性腹泻病毒类病原体高于细菌类,鼠伤寒沙门菌、A组轮状病毒G9P[8]和诺如病毒GⅡ.4 Sydney [P31]是最主要的病原体和优势血清/基因型;GⅡ.2 [P16]是诺如病毒暴发流行的优势基因型;通过连续哨点监测的数据支持,提前为暴发疫情做好了防控,促成了湖南省感染性腹泻发病率的平稳下降。     

Sj-UV-致弱尾蚴单链抗体库的构建及筛选

目的构建和鉴定日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）紫外线（UV）-照射致弱尾蚴单链抗体（single chain Fv,ScFv）表达文库,并以此作为高通量的库源筛选出针对有潜在保护力的Sj尾蚴66-68 kDa抗原（Schistosoma japonicum cercariae antigen 66-68kDa,SCA66-68kDa）的单链抗体。方法选择最佳紫外灯照射条件,构建UV-致弱尾蚴小鼠模型,通过其血清被动转移实验证实其是否具有抗血吸虫攻击感染的保护效果;随后提取该小鼠脾脏mRNA,利用噬菌体展示技术构建UV-照射致弱尾蚴单链抗体库,并从库容量、多样性等方面进行鉴定;运用直接菌落挖集法以SjSCA66-68kDa筛选该抗体库,获得阳性克隆进行蛋白表达,再与SCA进行反应,验证其与SjSCA66-68kDa反应的特异性。结果构建UV-致弱尾蚴动物模型中的血清转移至小鼠体内得到42.5%的减虫率,显著高于日本血吸虫感染血清转移组的减虫率（28.0%）;日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库的库容量测定为1.9×108,重组率为100%;运用抗原直接菌落挖集法筛选共获得6个SCA66-68kDa阳性克隆,经SDS-PAGE、Western-blot分析结果显示可溶性ScFv获得了正确表达,且与相应抗原SjSCA66-68kDa特异性结合,证实成功获得了特异性抗SjSCA66-68kDa单链抗体。结论成功构建了高效日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库,从该库筛选共获得6个阳性克隆,均能诱导表达SjSCA66-68kDa特异性可溶性单链抗体。     

日本血吸虫尾蚴66~68 kD单特异性血清对尾蚴cDNA文库的免疫学筛选

目的：获得日本血吸虫（Schistosoma japonicum，Sj）尾蚴66～68kD抗原的编码基因，为日本血吸虫疫苗和诊断研究提供材料。方法：以Sj尾蚴66～68kD抗原免疫家免获得的单特异性血清为探针，对Sj尾蚴cDNA文库进行免疫筛选，将所获阳性克隆的插入片断进行PCR扩增、琼脂糖电泳初步鉴定，并挑选出4个强阳性克隆进行测序，通过互联网NCBI／BLAST进行核苷酸序列分析。结果：共获得21个持续阳性克隆，其中10个阳性克隆初步鉴定显示为单一扩增条带，且插入的cDNA片段大小分布于0．5—3．0kb之间；4个强阳性克隆分别与日本血吸虫SJCHGC05187，SJCHGC05173，SJCHGC06989，SJCHGC01894显著同源。结论：获得了4种日本血吸虫相关的编码基因。     

Sj-UV-致弱尾蚴单链抗体库的构建及筛选

目的构建和鉴定日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)紫外线(UV)-照射致弱尾蚴单链抗体(single chain Fv,ScFv)表达文库,并以此作为高通量的库源筛选出针对有潜在保护力的Sj尾蚴66-68 kDa抗原(Schistosoma japonicum cercariae antigen 66-68kDa,SCA66-68kDa)的单链抗体。方法选择最佳紫外灯照射条件,构建UV-致弱尾蚴小鼠模型,通过其血清被动转移实验证实其是否具有抗血吸虫攻击感染的保护效果;随后提取该小鼠脾脏mRNA,利用噬菌体展示技术构建UV-照射致弱尾蚴单链抗体库,并从库容量、多样性等方面进行鉴定;运用直接菌落挖集法以SjSCA66-68kDa筛选该抗体库,获得阳性克隆进行蛋白表达,再与SCA进行反应,验证其与SjSCA66-68kDa反应的特异性。结果构建UV-致弱尾蚴动物模型中的血清转移至小鼠体内得到42.5%的减虫率,显著高于日本血吸虫感染血清转移组的减虫率(28.0%);日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库的库容量测定为1.9×108,重组率为100%;运用抗原直接菌落挖集法筛选共获得6个SCA66-68kDa阳性克隆,经SDS-PAGE、Western-blot分析结果显示可溶性ScFv获得了正确表达,且与相应抗原SjSCA66-68kDa特异性结合,证实成功获得了特异性抗SjSCA66-68kDa单链抗体。结论成功构建了高效日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库,从该库筛选共获得6个阳性克隆,均能诱导表达SjSCA66-68kDa特异性可溶性单链抗体。     

2017-2020年湖南省健康人群脊髓灰质炎病毒抗体水平监测结果分析

目的 调查湖南省健康人群脊髓灰质炎病毒(简称脊灰病毒)中和抗体水平,为预防和控制脊髓灰质炎提供科学依据。方法 对不同年龄段人群的脊灰病毒中和抗体采用微孔塑料板法进行检测。结果 脊灰病毒Ⅰ型、Ⅲ型抗体阳性检出率分别为98.10%和94.79%,几何平均滴度为1∶168.58和1∶77.05。脊灰病毒Ⅰ型和Ⅲ型抗体阳性检出率存在统计学差异,且其几何平均滴度值随着年龄的增加而降低,常德地区的血清抗体阳性检出率和几何平均滴度较其他地区低。在不同性别之间,脊灰病毒Ⅰ型、Ⅲ型抗体及Ⅰ型、Ⅲ型抗体之间的表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 湖南省健康人群对脊髓灰质炎的免疫水平较高,已经建立起有效的免疫防护体系,加强常规免疫及坚持针对性的强化免疫,坚持高水平的免疫覆盖率是目前湖南省“无脊髓灰质炎病毒”状态的重要保障。