一种通用型肠道病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用

目的 建立一种肠道病毒通用型微滴式数字PCR（ddPCR）的定量检测方法,以实现肠道病毒的量化检测。方法 利用肠道病毒标准品对ddPCR反应中的探针浓度、退火温度进行优化,并确定ddPCR的检测范围。利用已优化好的反应条件对28份临床样本进行病毒载量检测。结果 本研究确定ddPCR的最佳探针浓度为0.4 μmol/L,退火温度为51.0 ℃,核酸检测范围为3.02~3.59×10⁶ copies/μL,检出限为3.02 copies/μL。ddPCR方法线性相关系数为0.993 8,呈良好的线性关系。结论 本研究建立基于ddPCR肠道通用型的定量方法,可有效地对临床样本中不同血清型的肠道病毒临床样本进行拷贝数定量分析,为临床研究病毒载量的测定提供一种技术。     

4种疟原虫核酸通用型微滴式数字PCR检测方法的建立

目的建立疟原虫微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测方法。方法根据疟原虫18S rRNA基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,用于ddPCR方法建立。优化dd PCR的退火温度、引物和探针浓度后,比较ddPCR和实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)灵敏度和重复性,并对4种疟原虫阳性样本进行检测。结果建立的ddPCR方法特异性良好,灵敏度可达到2.3拷贝/μl,重复性良好。13份经qPCR检测的阳性样本,ddPCR检测也均为阳性,正确率达100%;5份经一个疗程青蒿素为基础的联合疗法治疗后的疟疾病人样本,qPCR检测均为阴性,dd PCR检测发现其中1份阳性(3.8拷贝/μl)。结论建立的ddPCR能够高度敏感、特异地检测人类4种疟原虫核酸。     

两种巢氏PCR方法检测二期梅毒血液标本的比较

目的 比较两种巢氏PCR方法在检测二期梅毒患者血液标本中的价值。 方法 对tpp47和polA,分别建立两个巢氏PCR扩增全血中的梅毒螺旋体DNA。 结果 在353例梅毒阳性全血中,nPCR-tpp47和nPCR-polA分别检出142例(40.2%)和132例(37.4%),结果差异有统计学意义(χ²=5.79,P<0.05);两种巢氏PCR在血清学试验高滴度(RPR≥1:8或TPPA≥1:2 560)组的检出率明显高于低滴度组(RPR<1:8或TPPA<1:2 560)。 结论 在检测二期梅毒全血标本Tp DNA时,nPCR-tpp47优于nPCR-polA;巢氏PCR方法可作为梅毒血清学试验的补充试验。     

新型冠状病毒感染者核酸和抗体检测结果分析

目的 了解新型冠状病毒(novel coronavirus 2019,2019-nCoV)感染者不同时期、不同类型标本中病毒核酸和抗体的检测情况,为完善新型冠状病毒肺炎(简称新冠肺炎)诊疗和防控方案提供科学依据。 方法 2020年2月26—27日采集娄底市71例新冠肺炎确诊病例和25例无症状感染者的粪便、血液和咽拭子,应用RT-PCR方法开展2019-nCoV核酸检测,采用胶体金方法开展2019-nCoV抗体检测,分析检测结果。 结果 共采集96份粪便,95份咽拭子,83份血液标本,粪便2019-nCoV核酸检出率不同年龄组差异有统计学意义;无症状感染者阳性率(47.06%)高于确诊病例(12.70%),＜40岁患者的阳性率(37.5%)高于≥40岁患者的阳性率(8.33%);咽拭子的阳性率无症状感染者(12.5%)和确诊病例(11.3%)差异无统计学意义;血液标本2019-nCoV 抗体检出率为94.0%。 结论 出院患者咽拭子、粪便标本均不同程度检出2019-nCoV核酸,无症状感染者粪便标本核酸检出率高于确诊病例,提示应重点关注无症状感染者在疫情传播中的作用,需加强对无症状感染者、出院患者的持续追踪和管理,综合多个指标进一步评估传染性。     

PCR法检测华支睾吸虫感染的应用研究

目的 探索PCR法在基层医院检测华支睾吸虫感染的应用前景。方法 采集94例普通住院患者粪便和血清样本,分别采用改良加藤厚涂片法（Kato-Katz） 、PCR法和ELISA法3种方法进行华支睾吸虫检测,以Kato-Katz法为评价标准,对PCR法和ELISA法的检测结果进行分析。结果 研究共纳入2018年9—10月住院患者粪便和血液样本均有的患者94例,其中男性53例,女性41例,分别占56.4%、43.6%;20岁以下3例,20~39岁26例,40~59岁33例,60岁及以上32例,分别占3.2%、27.7%、35.1%、34.0%。Kato-Katz法检出华支睾吸虫阳性数26份,阳性率为27.66%,PCR法检出阳性数23份,阳性率为24.47%,ELISA检出阳性数53份,阳性率为57.45%,3种方法阳性率差异有统计学意义（P<0.01）。PCR法灵敏度和特异度分别为53.85%和86.76%,阳性预测值和阴性预测值分别为60.87%和83.10%。ELISA法灵敏度和特异度分别为96.15%和57.35%,阳性预测值和阴性预测值分别为46.30%和97.50%。结论 在华支睾吸虫高流行区的基层医院开展PCR检测华支睾吸虫感染有应用价值。     

实时荧光定量PCR法在低密度疟原虫感染病例中的应用研究

目的 运用实时荧光定量PCR法对低密度疟原虫患者血样进行基因检测,分析其检测效果。方法 选取恶性疟原虫患者和间日疟原虫患者抗凝全血标本各1份,制作厚血膜血片,计算其原虫密度。再以健康人“O”型抗凝全血为稀释液按照1∶4、1∶16、1∶64、1∶256、1∶1 024、1∶4 096、1∶16 384比例分别稀释,制作成7个浓度梯度血样。每个浓度血样分别制备1张厚血膜血片和提取1份疟原虫DNA,分别采用显微镜观察、实时荧光定量PCR法检测其疟原虫感染情况。结果 恶性疟原虫血片厚血膜显微镜法、实时荧光定量PCR法的检出区间分别为12.44~49.76个疟原虫/μL血、3.11~12.44个疟原虫/μL血;间日疟原虫血片厚血膜显微镜法、实时荧光定量PCR法的检出区间分别为45~180个疟原虫/μL血、2.81~11.25个疟原虫/μL血。结论 实时荧光定量PCR法对低密度疟原虫检出限明显高于显微镜检查,可有效解决目前低密度感染以及服用抗疟药后难检测、难鉴别疟原虫的问题,指导合理用药。     

入境人员集中隔离点房间新型冠状病毒污染状况分析

目的 了解入境人员集中隔离点房间新型冠状病毒污染状况,为集中隔离点规范管理提供科学依据。 方法 采集2021年12月18日—2022年1月16日入境人员集中隔离居住过的房间环境表面涂抹样本,用Real-Time PCR方法对新型冠状病毒核酸进行检测,并对房间污染状况进行分析。 结果 共采集房间环境标本21 150份,其中确诊病例房间35个,样本数为350份,检出新冠病毒核酸阳性25份,均在确诊病例房间内,检出率为7.14%(25/350),物品为马桶、门板、灯开关、地面、床头柜、洗漱台、桌面、遥控器等。81.81%(9/11)的奥密克戎变异株确诊病例房间内检出新冠病毒核酸阳性。 结论 新型冠状病毒肺炎(简称新冠肺炎)确诊病例隔离房间物体表面存在污染风险,尤其是奥密克戎变异株患者房间环境污染风险更高,应按相关要求落实闭环管理,采取严格隔离措施,规范做好消毒工作,才能切实阻断新冠肺炎交叉感染和外溢感染风险。     

7种新型冠状病毒核酸检测试剂变异株检测性能比对分析

目的 评价常用的7种新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂（荧光定量PCR法）对2019-nCoV变异株的检测性能。方法 收集已知2019-nCoV核酸检测阳性的变异株样本,包括Alpha变异株、Beta变异株、 Eta变异株样本。比较7种2019-nCoV核酸检测试剂的灵敏度和特异度,采用Kappa系数对7种检测试剂的检测结果与基因测序结果进行一致性评价。结果 7种检测试剂对3种变异株的灵敏度均>85%,特异度均为100%,Kappa系数均>0.8。结论 7种2019-nCoV核酸检测试剂在检测现有流行变异株时均具有较高灵敏度和特异度,未造成脱靶和漏检,且与基因测序结果相比一致性好。     

乙型脑炎病毒微滴式数字PCR检测方法的建立

目的 建立乙型脑炎病毒微滴式数字PCR (droplet digital PCR,ddPCR)检测方法.方法 根据乙型脑炎病毒基因的NS3序列设计特异性引物和TaqMan探针,用于ddPCR和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR).优化ddPCR的退火温度、引物和探针浓度后,比较ddPCR和qPCR灵敏度和重复性,并用多种虫媒病毒进行特异性验证.结果 该方法特异性良好,灵敏度可以达到16.1 copies/μL,重复性良好.结论 本研究建立的ddRT-PCR能够高度敏感地检测乙型脑炎病毒核酸,将该方法用于临床乙型脑炎病毒感染的检测,可提高检测的准确性.     

两种新冠病毒核酸检测系统检测结果的比对分析

目的 对不同新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测方法进行比较和分析,探讨核酸提取扩增检测一体化的实时荧光定量PCR系统的应用价值。方法 2020年1月—10月于新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)复核样本库中随机抽取确诊病例和排除病例的灭活咽拭子标本,共计10份。采用盲法随机编号,同时使用全自动医用PCR分析系统GeneXpert DX system和ABI QuantStudio Dx实时定量PCR检测系统进行检测,每组均进行平行检测,利用四格表法对结果进行一致性分析。结果 检测结束后揭盲,所有样本纳入统计分析,无剔除数据。经检测,两种方法对8例新冠病毒确诊病例咽拭子检测结果均为阳性,2例排除病例咽拭子检测结果均为阴性;两种方法检测结果一致性好(Kappa系数=1,P值=0.002);使用方法A检测前处理时间为30秒,结果报告时间为48分钟;在核酸检测过程中检测人员与样本接触时间短,气溶胶危险较低,试剂盒全程密封,实验完成后标本处理安全性高。结论 方法A与方法B在新型冠状病毒核酸检测中结果一致,方法A具备操作环节简单、生物安全风险系数小、检测更为快速等优点。     

胶体金法与荧光免疫层析法检测新型冠状病毒特异性IgM和IgG的比较分析

目的 对胶体金法与荧光免疫层析法检测新型冠状病毒(简称新冠病毒)特异性IgM和IgG的结果进行比较分析,探讨抗体产生规律及特征。方法 用胶体金法和荧光免疫层析法两种方法对28例新型冠状病毒肺炎(简称新冠肺炎)患者87份血液样本和对照组42份血液样本(经核酸检测排除感染新冠病毒)同时检测新冠病毒特异性IgM和IgG,并对不同采样时间段抗体检测结果进行统计分析。结果 胶体金法 检测IgM和IgG敏感性分别为54. 02% (47/87)、93. 10%( 81/87) ,特异性为100. 00%(42/42)、97. 62%(41/42),荧光免疫层析法检测IgM和IgG敏感性分别为93. 10% .(81/87) 96. 55%( 84/87) ,特异性均为97. 62% (41/42) ;两种方法均显示IgM和IgG转阳平均时间为3周左右,IgM可持续存在50d不消失;荧光免疫层析法显示IgM和IgG浓度均呈先升后降变化,于5周左右达到峰值。结论 荧光免疫层析法检测IgM敏感性明显高于胶体金法,两种方法检测IgM和IgG特异性无差异,胶体金法和荧光免疫层析法均可用于新冠病毒感染的筛查,作为核酸检测方法的有效补充,荧光免疫层析法还可以动态监测抗体浓度的变化。     

15例COVID-19患者治疗后痰、粪便标本新型冠状病毒核酸检测结果比较

 

目的 探讨粪便样本作为疑似或确诊新型冠状病毒肺炎（COVID-19）患者筛查的可行性。方法 利用Real Time RT-PCR技术,对15 例COVID-19患者治疗后痰、粪便标本中新型冠状病毒的ORF1ab、N基因以及人体细胞管家基因核糖核酸酶P（ribonuclease P,RNase P）进行检测,比较痰、粪便标本检测阳性情况。结果 15例患者痰、粪便标本,人体细胞管家基因 RNase P均呈现典型的明显的扩增信号曲线。新型冠状病毒核酸检测,2例患者痰、粪便标本同时为阳性,4例患者痰、粪便标本分别为阳性;6例患者痰阳性标本中有2例同时扩增出ORF 1ab基因与N基因,6例患者粪便阳性标本中有4例同时扩增出ORF 1ab基因与N基因。结论 以呼吸道标本新型冠状病毒核酸检测阴性作为排除COVID-19及治愈标准在实施过程中需谨慎,可以尝试将粪便标本新型冠状病毒核酸检测阴性也纳入其中。

     

ELISA法与胶体金法在检测新型冠状病毒血清抗体中的应用探讨

目的 探讨酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法与胶体金法检测新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)血清抗体的诊断价值。方法 选取湖南省新型冠状病毒肺炎(简称新冠肺炎,COVID-19)确诊病例88例作为病例组,51例核酸检测阴性者作为对照组。采集研究对象血标本,采用ELISA法和胶体金法对所采集标本进行抗体检测,比较两种方法检出率差异;以核酸检测结果作为金标准,评估ELISA法和胶体金法的检验效能。结果 本研究结果显示,ELISA法和胶体金法检测2019-nCoV IgM 检出率均为20.97%,2019-nCoV IgG检出率分别为 43.55%、35.48%。不同采样时间ELISA法和胶体金法检测2019-nCoVIgM 检出率差异无统计学意义(均P>0.05)。发病-采样时间间隔≤7 d时,两种检测方法对2019-nCoV IgG检测结果差异有统计学意义(χ²=5.55,P=0.02),ELISA检出率(26.47%)高于胶体金法(5.71%)。通过对比不同发病-采样间隔发现,无论是ELISA法还是胶体金法,在一定时间内,间隔时间越长,2019-nCoV IgM和IgG检出率越高。以核酸检测结果为金标准,检测 IgG和IgM时,ELISA法和胶体金法的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值差异均无统计学意义。结论 ELISA法与胶体金法检验效能相当,两者特异度高,但灵敏度上都存在局限性,不建议用于筛查,可以作为确诊的补充诊断手段或应用于聚集性疫情溯源。     

一起新型冠状病毒肺炎聚集性疫情流行病学调查分析

目的 分析一起新型冠状病毒肺炎(简称新冠肺炎)聚集性疫情特征,同时探讨血清特异性抗体检测对流行病学调查的意义,为新冠肺炎疫情防控策略的进一步完善提供参考。 方法 对某县发生的一起新冠肺炎聚集性疫情进行现场流行病学调查,将管控区内所有湖北旅居史人员划归为可疑传染源。对确诊病例的密切接触者及可疑传染源采集咽拭子及血清标本,采用RT-PCR法对咽拭子进行2019-nCoV核酸检测,采用ELISA法对血清进行2019-nCoV特异性IgM、IgG抗体检测。 结果 确诊病例5人核酸检测阳性,其中1例连续检测6次阴性,第7次检测阳性。5例确诊病例来自2个不同的家庭,其先发病例之间及与可疑传染源均无密切接触史。密切接触者中发现1人在整个调查期内7次核酸检测均为阴性,后经血清抗体检测IgM和IgG阳性才判定为无症状感染者,其与2个家庭的先发病例均有过密切接触。管控区内可疑传染源77例,核酸检测均为阴性,血清抗体检测发现2例IgG阳性,怀疑其可能是本次聚集性疫情的感染来源。 结论 新冠肺炎易形成家庭内传播,相对封闭的空间存在有利于病毒传播的可能,抗体检测作为核酸检测的补充,对于发现无症状感染者,追溯无明确暴露史确诊病例的传染来源,具有重要意义。     

三种前处理方法对粪便中新型冠状病毒核酸检测结果的影响

目的 对比三种不同前处理方法,为安全、快速、有效的提取粪便标本中新型冠状病毒核酸提供参考。方法 采集20份新型冠状病毒肺炎确诊病例粪便标本,分别用PBS、Trizol、Trizol和PBS三种方法进行前处理,再提取核酸进行实时荧光RT-PCR,比较不同提取方法的检出率。结果 PBS处理标本中,检出12份ORF1ab/N基因阳性/阳性,1份ORF1ab/N基因阴性/阳性,7份ORF1ab/N基因阴性/阴性,检出率为60%;Trizol处理标本中,检出14份ORF1ab/N基因阳性/阳性,6份ORF1ab/N基因阴性/阴性,检出率为70%;Trizol和PBS处理标本中,14份ORF1ab/N基因阳性/阳性,1份ORF1ab/N阴性/阳性,5份ORF1ab/N基因阴性/阴性,检出率为70%。三种前处理方法检出率及Ct值差异无统计学意义（P＞0.05)。结论 采用三种处理方法在不震荡、不离心的情况下均能从粪便标本中检出新型冠状病毒核酸。Trizol处理检出率略高于PBS处理,且Trizol处理可一定程度上降低标本传染性,可作为首选。     

738例新型冠状病毒肺炎病例密切接触者核酸筛查结果分析

 

目的 了解新型冠状病毒肺炎（简称新冠肺炎）病例密切接触者新型冠状病毒核酸检测及血常规结果。方法 选取2020年2月11-23日某定点隔离酒店内738例新冠肺炎病例密切接触且无明显临床症状的医学观察人员,采集其鼻咽拭子进行新型冠状病毒核酸检测,采集血标本进行血常规检测,并观察至隔离期结束。结果 738例医学观察人员新型冠状病毒核酸检测阳性70例（9.49%）,阴性664例（89.97%）,可疑4例（0.54%）,其中首次新型冠状病毒核酸检测阳性52例,可疑28例,阴性658例;对28例结果可疑者隔日重新采样检测,18例阳性,6例阴性,4例仍可疑（二次采样后观察期结束转至指定隔离观察点）。所有新型冠状病毒核酸检测阳性及可疑医学观察人员,血常规白细胞计数均正常,仅2例淋巴细胞计数减少。在第一个14 d观察期内,738例医学观察人员40例（5.42%）发病,其中70例新型冠状病毒核酸检测阳性者,42.86%（30例）出现发热、咳嗽、气促等临床症状;664例新型冠状病毒核酸检测阴性者,1.51%（10例）出现症状。所有确诊病例转至定点医院继续治疗;第一个观察期结束时,新型冠状病毒核酸检测未转阴者、结果仍可疑者送至指定隔离点继续观察。继续观察期中4.54%（2/44）出现症状被确诊,随即转至定点医院治疗;余下观察者新型冠状病毒核酸检测全部转阴。整个集中隔离期发病率为5.69%（42/738）。结论 新冠肺炎病例密切接触者新型冠状病毒核酸检测阳性人员中,潜伏期感染者所占比例较高,亦存在一定比例的无症状感染者,应尽早识别、诊断。

     

新型冠状病毒核酸检测中的思维误区

目的探讨2019新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测在目前新型冠状病毒肺炎(COVID-19)病例确诊中遇到的"假阴性"和"假阳性"问题。方法根据2019-nCoV核酸检测的基本原理和条件,从检测样本采集、运输、保存的方式,试剂盒的质量,以及临床实验室的管理等多方面,分析2019-nCoV核酸检测报告"假阴性"和"假阳性"的原因。结果研究结果论述了造成当前2019-nCoV核酸检测"假阴性"和"假阳性"的可能原因。优化样本采集的操作和方法,加强质控管理,开发应用新技术,加强对疑似病例和出院患者的诊断和管理,是避免2019-nCoV核酸检测报告出现"假阴性"的应对策略,并对保证核酸检测结果的及时性和准确性具有非常重大的意义,可供相关部门在制定防治策略和开展工作时参考。结论核酸检测阳性结果被视为2019-nCoV感染诊断的金标准,而阴性结果不能作为排除2019-nCoV感染的金标准,更不能作为排除COVID-19的金标准。     

新型冠状病毒肺炎病例的血清学检测结果初步分析

目的 了解新型冠状病毒肺炎确诊病例、无症状感染者、密切接触者和其他相关人员血清中IgM和IgG抗体产生情况。 方法 采集研究对象的全血并及时分离血清,采用ELISA和胶体金法对确诊病例和无症状感染者血清进行IgM和IgG抗体检测,采用ELISA对密切接触者和其他相关人员血清进行检测。 结果 用ELISA和胶体金法进行抗体检测,42例确诊病例的阳性情况为:采样日期从第二周起,不论是IgM还是IgG的阳性率均出现增长,第15~35 d组,阳性率最高,IgM抗体阳性率ELISA和胶体金法分别为72.7%与36.4%,IgG抗体阳性率分别为72.7%与90.9%。用ELISA检测,8例无症状感染者为IgM阳性5例(62.5%)和IgG阳性5例(62.5%)。密切接触者为IgM阳性1例(1.7%)和IgG阳性2例(3.4%)。其他相关人员为IgM阳性1例(2.0%)和IgG阳性2例(4.1%)。ELISA IgM、胶体金IgM、ELISA IgG以及胶体金IgG试验检测出阳性确诊病例的发病日期至采样日期的间隔时间中位数分别为16、14、12、13 d。ELISA与胶体金法比对,IgM抗体检测的Kappa值为0.614,IgG的Kappa值为0.716。 结论 新型冠状病毒肺炎确诊病例血清抗体阳性率从第二周起出现显著增长,不同类型人员阳性率差异有统计学意义,ELISA与胶体金法比较中高度一致。