紫外线致弱尾蚴免疫兔血清筛选血吸虫成虫cDNA文库

目的 :寻找照射致弱尾蚴中起免疫保护作用的抗原分子 ,为血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原。方法 :用紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)成虫cDNA文库 ,并对阳性克隆的插入基因片段进行PCR扩增及测序分析。结果 :经三轮筛选 ,获 10个阳性克隆 ,其插入的SjcDNA片段大小为 1 5～1.8kb。初步测序获 5个部分序列 ,其中 2个序列分别与Sj动力蛋白轻链 5 (DLC 5 )及Sj线粒体基因明显同源 ,其余 3个序列为未知的新基因片段。结论 :获得的阳性克隆插入基因片段可能为编码抗日本血吸虫感染的抗原基因     

两个日本血吸虫成虫新基因的克隆和分析

目的 克隆并分析日本血吸虫（Sj)新的抗原基因，为血吸虫病疫苗研制提供有效的侯选抗原分析。方法 用日本吸虫肝门型童虫表膜抗原（SjHmAg)免疫兔血清筛选日本血吸虫成虫cDNA库，并对阳性克隆的插入片段进行PCR扩增及测序，通过互联网对测序获得的核苷酸序列进行同源性比较分析，并预测蛋白质结构与功能。结果 经3轮筛选，获10个阳性克隆，其插入的Sj成虫cDNA片段大小自0.6-3.0kb不等。对其中3个阳性克隆测序的结果显示，两个为新基因片段，SjHm1、SjHm2的Genbank登录号分别为AY118085，AY124772，分别编码79、66个氨基酸。SjHm1蛋白为跨膜蛋白，含1个跨膜区，1个N－肉豆蔻酰化位点。SjHm2蛋白为一个非跨膜蛋白，含1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。结论 获得的阳性克隆插入基因片段可能为编码具有保护性作用的日本血吸虫抗原的基因片段。     

Sj-UV-致弱尾蚴单链抗体库的构建及筛选

目的构建和鉴定日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)紫外线(UV)-照射致弱尾蚴单链抗体(single chain Fv,ScFv)表达文库,并以此作为高通量的库源筛选出针对有潜在保护力的Sj尾蚴66-68 kDa抗原(Schistosoma japonicum cercariae antigen 66-68kDa,SCA66-68kDa)的单链抗体。方法选择最佳紫外灯照射条件,构建UV-致弱尾蚴小鼠模型,通过其血清被动转移实验证实其是否具有抗血吸虫攻击感染的保护效果;随后提取该小鼠脾脏mRNA,利用噬菌体展示技术构建UV-照射致弱尾蚴单链抗体库,并从库容量、多样性等方面进行鉴定;运用直接菌落挖集法以SjSCA66-68kDa筛选该抗体库,获得阳性克隆进行蛋白表达,再与SCA进行反应,验证其与SjSCA66-68kDa反应的特异性。结果构建UV-致弱尾蚴动物模型中的血清转移至小鼠体内得到42.5%的减虫率,显著高于日本血吸虫感染血清转移组的减虫率(28.0%);日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库的库容量测定为1.9×108,重组率为100%;运用抗原直接菌落挖集法筛选共获得6个SCA66-68kDa阳性克隆,经SDS-PAGE、Western-blot分析结果显示可溶性ScFv获得了正确表达,且与相应抗原SjSCA66-68kDa特异性结合,证实成功获得了特异性抗SjSCA66-68kDa单链抗体。结论成功构建了高效日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库,从该库筛选共获得6个阳性克隆,均能诱导表达SjSCA66-68kDa特异性可溶性单链抗体。     

日本血吸虫尾蚴cDNA文库的免疫学筛选及EST序列的分析

目的为获得日本血吸虫（Schistosoma japonicura，Sj）转化生长因子β1（TGF—β1）基因的部分或全长cDNA序列。同时验证用针对某一蛋白的抗体筛选表达文库是否可以得到相应蛋白对应的基因序列。方法采用兔抗鼠TGF—β1血清，对Sj尾蚴cDNA表达文库进行免疫学筛选，对阳性克隆进行PCR扩增后，将大于500bp的克隆进行复筛，对复筛阳性的克隆进行测序和生物信息学鉴定。结果对大约10^6个噬菌斑进行了初筛。共获得7个阳性克隆；经过PCR扩增后，其中有4个克隆大于500bp，复筛获得3个持续阳性克隆；对测序后的阳性克隆进行生物信息学鉴定，得到的三个克隆均与日本血吸虫辅酶Q10氧化还原酶（SjCHGC）基因具有高的同源性（Bhata分值都大于200）。结论SjCHGC蛋白与兔抗鼠TGF—β1抗体的反应为交叉反应，用抗某一蛋白的抗体筛选表达文库得到相应蛋白的基因序列的方法不一定可行。     

日本血吸虫合抱相关未知功能基因SJCHGC00821的克隆及生物信息学分析

目的 克隆与日本血吸虫合抱相关但未知功能的新基因SJCHGC00821，构建其真核表达载体，并应用生物信息学初步探讨其功能。方法 应用PCR技术从日本血吸虫成虫cDNA文库中扩增SJCHGC00821基因全长ORF，将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3中，通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定。应用生物信息学初步分析其细胞定位、蛋白序列、结构域及功能。结果 获得日本血吸虫合抱相关未知基因SJCHGC00821的克隆，序列分析结果提示该cDNA序列含有一个597bp的完整阅读框序列，编码198个氨基酸，其编码蛋白的理论分子量为22．76kDa，等电点为4．84。二级结构分析预测提示其具有一定抗原性。结论 成功地克隆了日本血吸虫SJCHGC00821基因全长ORF，构建了其pcDNA3真核表达载体，为进一步研究其结构与功能创造了条件。     

日本血吸虫新基因的克隆及分析

目的：克隆并分析日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）新基因,提供有效的疫苗候选分子。方法：用Sj雄虫可溶性抗原免疫家兔血清为探针筛选Sj成虫cDNA文库,将所获阳性克隆的插入片断进行PCR扩增并测序,通过互联网NCBI GenBank和蛋白质分析软件进行分析。结果：共筛选得11个阳性克隆,经分析有2个新基因,分别是Sj-P8（GenBank注册号AF517843）和Sj肌球蛋白cDNA序列（GenBank注册号AY770506）,分别编码含75个氨基酸的跨膜蛋白和含212个氨基酸的蛋白片断。结论：Sj-P8和Sj肌球蛋白cDNA序列可能为日本血吸虫疫苗的研究提供有价值的材料。     

日本血吸虫中国大陆株琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白的克隆与表达

目的：克隆日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白（sjSDISP）全长编码基因，并对所获基因在大肠杆菌中进行表达。方法：根据基因库中SjSDISP对应的EST（BU804141）以及日本血吸虫成虫cDNA文库载体λgtl1多克隆位点邻近核苷酸序列设计引物，以日本血吸虫成虫cDNA文库为模板，采用锚式PCR对SjSDISP基因不完整的3′端和5′端进行扩增、测序，用电子软件拼接成全长cDNA，将其克隆到表达载体pGEX-4T-1上，经琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶消化、PCR和测序鉴定后，选择阳性克隆进行表达及Western印迹分析。结果：获得1071bp全长cDNA，其理论推导为编码278个氨基酸残基的蛋白质。SjSDISP基因在大肠杆菌BL2．中获得良好表达。该融合表达产物相对分子质量约为56kD，且能被日本血吸虫成虫抗原免疫血清特异识别。结论：编码日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白全长cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达获得成功。     

紫外线致弱尾蚴免疫兔血清筛选血吸虫成虫cDNA文库

目的：寻找照射致弱尾蚴中起免疫保护作用的抗原分子，为血吸虫病疫苗研究提供新的侯选抗原。方法：用紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ，Ｓｊ）成虫ｃＤＮＡ文库，并对阳性克隆的插入基因片段进行ＰＣＲ扩增及测序分析。结果：经三轮筛选，获１０个阳性克隆，其插入的Ｓｊ ｃＤＮＡ片段大小为１．５～１．８ｋｂ。初步测序获５个部分序列，其中２个序列分别与Ｓｊ动力蛋白     

日本血吸虫SJCHGC02377蛋白部分片段的克隆与表达

目的:克隆和表达日本血吸虫SJCHGC02377蛋白。方法:采用RT-PCR从日本血吸虫成虫总RNA中扩增出编码SJCHGC02377蛋白的基因片段;经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23 a(+),转化大肠埃希菌BL21,菌落PCR和双酶切鉴定;阳性菌株经IPTG诱导表达SJCHGC02377蛋白部分片段,亲和层析予以纯化。结果:RT-PCR扩增出SJCH-GC02377蛋白基因片段;获得的阳性克隆序列与GenBank中登录的日本血吸虫SJCHGC02377蛋白的基因序列一致;SJCH-GC02377蛋白基因被亚克隆到原核表达载体pET-23 a(+),在BL21中获得了表达,表达的蛋白经亲和层析获得纯化。结论:成功构建了日本血吸虫SJCHGC02377蛋白的重组表达质粒,在大肠埃希菌中获得表达。     

日本血吸虫精氨酸酶编码基因cDNA的分离和序列分析

【目的】分离和鉴定日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,S .j)新基因。【方法】应用免疫学方法筛选S .jcDNA文库获得阳性克隆 ;通过PCR直接序列测定技术 ,表达序列标签 (EST)同源性检索对阳性克隆插入片段进行鉴定 ;采用亚克隆技术及生物信息学等技术 ,对获得的日本血吸虫精氨酸酶编码基因序列进行结构与功能的分析。【结果】获得了一个含10 6 1bp外源插入片段的阳性克隆 ,其cDNA序列含有一个 840bp的阅读框 ,编码 2 79个氨基酸 ,属精氨酸酶家族 ,与国际蛋白质库中的酵母、蛙、人和大鼠精氨酸酶序列的同源性分别为 44 % ,5 0 % ,5 1% ,5 3%和 5 4%。【结论】获得了编码日本血吸虫精氨酸酶编码基因全长cDNA ,为日本血吸虫精氨酸酶基因功能的研究奠定了基础。     

日本血吸虫尾蚴抗原模拟表位的筛选及其免疫保护性

目的 筛选日本血吸虫尾蚴抗原的模拟表位，探讨其对日本血吸虫的免疫保护性。方法 用粗提日本血吸虫尾蚴抗原的抗体IgC作配体筛选噬菌体12肽库，按“吸附－洗脱－扩增”的过程进行三轮筛选；随机挑取单个噬菌体克隆进行Dot-ELISA检测；用混和噬菌体克隆免疫小鼠3次，攻击感染45d后剖杀冲虫，计算虫数及肝卵数。结果 经三轮筛选，特异性噬菌体得到富集，挑取11个噬菌体克隆经Dot-ELISA鉴定，均与日本血吸虫尾蚴抗原免疫血清呈特异性反应。与对照组相比，混和噬体克隆免疫小鼠的减虫率为18.79%，减卵率为38.00%。结论 利用噬菌体随机肽库技术获得了日本血吸虫尾蚴抗原的模拟表位，这些表位能诱导对日本血吸虫的保护性免疫。     

日本血吸虫成虫67kD抗原模拟表位的筛选及其免疫原性

目的：筛选日本血吸虫成虫67kD抗原的模拟表位，对其免疫学活性予以鉴定。方法：用粗提日本血吸虫成虫67kD抗原的抗体IgG作配体筛选噬菌体12肽库，随机挑取三轮筛选后的噬菌体克隆，Dot-ELISA检测其特异性：用混和阳性噬菌体克隆免疫小鼠3次，攻击感染后45d剖杀，计数虫荷。结果：经三轮筛选，特异噬菌体得到富集，挑取的11个噬菌体克隆经Dot-ELISA鉴定均与67kD抗原免疫血清呈阳性反应。混合噬菌体克隆的免疫血清可识别67kD抗原，并具有一定的抗血吸虫的免疫保护效果。结论：利用噬菌体随机肽库技术获得了日本血吸虫成虫67kD抗原的模拟表位，这些表位具有良好的免疫原性。     

日本血吸虫不同发育阶段与旋毛虫抗原交叉性的研究

运用ＥＩＴＢ技术分析日本血吸虫（Ｓｊ）尾蚴、肝期童虫及雌雄成虫与旋毛虫（Ｔｓ）肌蚴抗原的交叉性。结果显示：Ｓｊ尾蚴、肝期童虫、成虫各阶段不同程度地被抗－ＴｓＳＡＲＳ，ＴｓＩＲＳ识别，其识别的抗原分子量在１５￣１００（尤５０￣７０）ｋＤ之间，两种抗血清识别的带型基本相同。所识别的各期Ｓｊ抗原中以尾蚴抗原最多，次为肝期童虫。３０天成虫仅雌虫抗原与上述两种抗血清在９７ｋＤ处显出一条弱带。抗－Ｓｊ♂ＡＲＳ     

东方田鼠感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库的初步报告

东方田鼠 (Microtusfortis,Mf)对日本血吸虫 ( Schistosomajaponicum ,Sj)感染具有抗性。为探讨Mf感染Sj后是否产生针对虫体某些抗原分子的免疫应答 ,作者用Mf受感染血清对Sj成虫cDNA文库进行免疫筛选 ,经初筛和复筛 ,共筛选出 1 2个阳性克隆 ,这些阳性克隆经辅助噬菌体自动剪切后PCR扩增显示 ,插入的SjcDNA片段大小在30 0bp～ 1 .8kb之间 ,其中 30 0bp片段 6个 ,1kb片段 1个 ,1 8kb片段 5个。说明Mf感染血清可识别Sj的特异性抗原分子。后者的免疫保护作用值得进一步研究     

日本血吸虫尾蚴(中国大陆株)表达序列标签的获取及同源性分析

目的 了解日本血吸虫尾蚴ｃＤＮＡ文库中基因的基本情况,为新基因的筛选鉴定提供依据。方法 日本血吸虫尾 蜘ｃＤＡＮ文库中的噬菌体侵入大肠杆菌ＢＭ２５．８后环化成质粒。筛选出已转入质粒的菌株。提取质粒ＤＮＡ,用质粒上 的一段测序引物序列进行一次性测序,得到一个表达序列标签（ＥＳＴ）。通过ＢＬＡＳＴｘ及ＢＬＡＳＴｎ公共数据库经编辑分 析的ＥＳＴ序列进行同源性比较。经过分析编辑后的新ＥＳＴ序列,以编写好的程序和Ｅ－ｍａｉｌ方式递交,以获得ＧｅｎＢａｎｋ 登录号。通过对同源性比较结果的总结,对该文库的基本情况进行分析。结果与结论 在测出的５８个ＥＳＴ中有３个核 苷酸序列与日本血吸虫已知基因高度同源,有２个核苷酸序列与曼氏血吸虫较高度同源,有７个ＥＳＴ的蛋白质序列与 其他物种有较高同源性而核苷酸序列同源性很低,有２７个ＥＳＴ的蛋白质及核苷酸序列同源性都很低。     

东方田鼠感染血清免疫筛选日本血吸虫成cDNA文库的初步 …

东方田鼠（Ｍｉｃｒｏｔｕｓ ｆｏｒｔｉｓ,ＭＤ）对日本血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐａｎｉｃｕｍ,Ｓｊ）感染具有抗性。为探讨Ｍｆ感染Ｓｊ后是否产生针对虫体某些抗原分子的免疫应答,作者用Ｍｆ受感染血清对Ｓｊ成虫ｃＤＮＡ文库进行免疫筛选,经初向下和复筛,共筛选出１２个阳性克隆,这些阳笥克隆经辅助噬菌体自动剪切后ＰＣ扩增显示,插入的Ｓｊ ｃＤＭＡ片较大小在３００ｂｐ～１．８ｋｂ之间,其中３００ｂ     

肺癌相关抗原的血清学筛选与鉴定

目的:筛选和鉴定肺癌肿瘤相关抗原,为肺癌早期诊断提供血清学标志物,并为研制肺癌疫苗提供候选抗原.方法:5份异体肺癌患者血清采用重组cDNA表达文库的血清学分析(SEREX)技术对肺癌cDNA表达文库筛选;对阳性克隆插入片段进行测序、生物信息学分析.结果:①筛选出70个阳性克隆,插入片段大小为300～2 800 bp.②测序:70个阳性克隆代表63个不同的基因.③生物信息学分析:1个基因与肺癌的发生、发展关系密切;34个基因报道与细胞的分化、代谢及信号转导等有关系,与其他肿瘤的发生、发展有关;26个基因的生理功能未见文献报道;2个插入片段未发现有同源基因,推测可能为新发现的基因.结论:使用SEREX技术成功鉴定了一组肺癌相关的肿瘤抗原.