检测烟曲霉菌GM抗原生物素-亲和素-夹心酶联免疫吸附试验法的建立

本研究用重组烟曲霉半乳糖甘露聚糖 (ＡＦＭＰ1) ,制备免疫血清 ,建立一种以生物素 亲和素 (ＢＡ)系统为基础的夹心酶联免疫吸附试验 (ＥＬＩＳＡ)法 ,快速检测烟曲霉ＧＭ抗原[1] 。一、材料与方法1.动物和菌株来源 :家兔和豚鼠购自第一军医大学动物所 ,表达ＧＳＴ ＡＦＭＰ1融合蛋白ＢＬ2 1菌种及全部真菌标准株均由香港大学微生物系提供。2 .主要试剂 :ＧＳＴ融合蛋白纯化试剂盒、ＰｒｏｔｅｉｎＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ 4Ｂ和ＥＣＬ底物显色剂 (ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ公司 ) ,弗氏佐剂 (Ｓｉｇｍａ产品 ) ,活化Ｓｕｌｆｏ ＮＨ…     

化学发光免疫分析技术在严重急性呼吸综合征冠状病毒核衣壳蛋白检测中的应用

目的　建立一种可用于严重急性呼吸综合征(SARS)早期诊断的简便、快速、灵敏的实验室检测方法。方法　采用化学发光免疫分析方法 (Chemiluminescenceimmunosaasy, CLIA)测定 34种不同病毒培养上清和人血中SARS冠状病毒(SARS- CoV)核衣壳蛋白 (Nucleocapsidprotein, SARS- CoVN)。结果　6种不同SARS- CoV毒株测定均为阳性, 11种非SARS毒株测定均为阴性,最低可检出核酸定量为 6 3×10PFU/ml的SARS- CoV培养上清;测定 49例抗体阳性的临床血清样本,发热 6~10d的样本检出率最高可达 100%。结论　SARS -CoV的CLIA的灵敏度和特异性较高,且简便、快速,在SARS的早期诊断中有良好的应用前景。     

简并PCR技术在肠道病毒血清型鉴定中的应用

目的 探讨共有序列简并杂合寡核苷酸引物PCR（CODEHOP-PCR）在肠道病毒血清型鉴定中的临床应用价值。方法 以CODEHOP-PCR检测经实时荧光RT-PCR鉴定为EV71和CA16 手足口病患者的临床样本和病毒分离培养细胞上清的肠道病毒VP1基因片段，经琼脂糖凝胶电泳并回收、测序，与Genbank提供的序列比较，确定肠道病毒的血清型。结果 CODEHOP-PCR后的序列分析表明，所有的EV71毒株和CA16毒株与近几年国内报道的部分毒株同源性在96%以上，其血清分型结果验证了实时荧光RT-PCR分型结果的准确性。结论 CODEHOP-PCR合并测序用于肠道病毒血清型的准确鉴定，与传统的病毒分离及血清中和试验相比，具有更快速、准确的优点。     

流式细胞术鉴定特异性识别曲霉孢子单克隆抗体

目的筛选可以与悬浮状态下曲霉孢子结合的特异性单克隆抗体。方法采用流式细胞术检测与曲霉活孢子结合的单抗。结果 2株单抗MA3和Con2可特异性结合悬浮状态下的烟曲霉孢子,其中单抗MA3可结合烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉等常见致病曲霉孢子。结论成功筛选到2株特异性结合曲霉孢子的单抗。     

含血管内皮生长因子启动子驱动CD自杀基因重组腺病毒的制备及其体外杀伤作用观察

目的 应用AdEasier-1系统高效制备含血管内皮生长因子(VEGF)启动子驱动CD自杀基因重组腺病毒并观察其体外肿瘤杀伤作用。方法 以JM109细菌基因组为模板,PCR扩增出含Hind Ⅲ/Bam HⅠ酶切位点的CD基因,亚克隆到pREP8,继而用Hind Ⅲ/XbaⅠ切出含pA加尾信号的CD基因,插入到预先构建的含VEGF启动子的转移质粒pAdtrack-VEGFP构建pAdtrack-VEGFP-CD。经PmeⅠ线性化后转化AdEasier-1细菌,用25 μg/ml卡那霉素筛选阳性克隆,先后进行琼脂糖电泳和PacⅠ酶切鉴定,筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-CD。经293细胞包装、扩增获得重组腺病毒Ad-VEGFP-CD,行PCR鉴定。通过测定细胞克隆形成率和细胞存活率观察重组腺病毒对体外培养的LoVo细胞的细胞毒作用。结果 构建重组腺病毒质粒的成功率为70%(7/10)。包装扩增后重组腺病毒的滴度为4.8×10¹² CFU/ml,PCR扩增结果与预期相符。在前药5-氟胞嘧啶存在下,重组腺病毒对LoVo具有明显杀伤作用,细胞克隆形成率和细胞存活率都明显下降。结论 应用AdEasier-1系统可以成功制备含VEGF启动子驱动CD自杀基因的重组腺病毒,该重组体具有明显的肿瘤杀伤作用。     

靶向性双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞的杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的前药/血管内皮生长因子受体(KDR)启动子-双自杀基因系统对血管内皮细胞的杀伤作用。方法 应用PCR扩增出KDR启动子、CD基因、TK基因序列,构建pKDR-CDglyTK质粒;以Adeasy-1系统为载体,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带KDR启动子调控下的CD与TK的融合基因腺病毒重组质粒pAdKDR-CDglyTK,重组质粒在293细胞中包装成病毒,并进一步扩增、纯化,以不同的感染复数(MOI)体外感染脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),利用重组病毒携带的绿色荧光蛋白(GFP)基因,荧光显微镜下观察重组腺病毒的感染效率,并给予不同浓度的GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),比较GCV(ganciclovir)和/或5-FC联合对转基因HUVEC细胞的杀伤作用。结果 成功构建了AdKDR-CDglyTK重组病毒,并高效地转染了HUVEC,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高。被转染的HUVEC对GCV和5-FC高度敏感。另外,MOI一定时,细胞存活率随GCV和5-FC浓度增加递减;GCV和5-FC浓度一定时,细胞存活率随MOI升高而降低。不同前药组细胞存活率结果显示:联合应用GCV+5-FC较单用GCV或5-FC对感染细胞的杀伤作用更强(P<0.05)。结论 KDR启动子-双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞具有强烈的杀伤作用,其杀伤效率与GCV和5-FC的浓度及重组腺病毒的MOI相关,联?     

Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1血清型特异性单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备并鉴定Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1(DV2-NS1)的血清型特异性单克隆抗体。方法以具有良好抗原性的重组DV2-NS1蛋白与灭活的Ⅱ型登革病毒(DV2)混合免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞经间接ELISA法、IFA法筛选,ELISA、IFA及WesternBlot对mAbs的类型及亚类、交叉实验及特异性等进行鉴定。结果免疫的Balb/c小鼠经多次融合筛选,共获得14株血清型特异性抗DV2-NS1蛋白的mAbs,其亚类测定两株为IgG2b,余均为IgG1。ELISA和免疫印迹显示这些mAbs与重组DV2-NS1蛋白和DV2抗原均特异性结合,IFA结果显示这14株单抗特异结合Ⅱ型登革病毒,与其它3型登革病毒无交叉。结论成功获得了特异性针对DV2-NS1蛋白的mAb,为进一步研究NS1蛋白的结构和功能以及研制早期诊断试剂奠定基础。     

RVP Fast与实时荧光PCR/RT-PCR检测呼吸道病毒结果的比较

目的评价xTAG呼吸道病毒群快速检测(Respiratory Virus Panel Fast Array,RVP Fast)技术检测呼吸道病毒的临床应用价值。方法选取经实时荧光定量PCR/RT-PCR筛查的74份呼吸道病毒阳性和4份阴性鼻拭子标本,用RVP Fast和RTPCR同时检测78份标本的8种呼吸道病毒及其亚型(共19型),运用McNemarχ2检验,Kappa检验和线性回归方法对检测结果进行统计处理。结果两种方法检测78份标本有71份结果完全相符,包括55份单个病毒感染标本,12份混合病毒感染标本和4份阴性标本。两种方法检测结果总体比较无统计学差异(P0.05),一致性较好(Kappa=0.960,P0.01),RVP Fast荧光强度中位数(MFI)与实时荧光PCR/RT-PCR阈值循环数(Ct)呈负相关(r=-0.529,P0.01)。结论 RVP Fast芯片技术的检测性能准确可靠,可应用于国内呼吸道病毒感染的快速、高通量检测,具有推广价值。