RVP Fast与Seeplex PneumoBacter ACE Detection assay联合诊断呼吸道感染病原体

目的采用RVP Fast与Seeplex PneumoBacter ACE Detection assay两种方法,联合诊断呼吸道感染病原体。方法收集南京市呼吸道感染患者咽拭子标本67份,提取RNA及DNA,呼吸道病毒群快速检测(Respiratory Virus Panel Fast Array,RVP Fast)技术检测呼吸道病毒,Seeplex PneumoBacter ACE Detection assay检测呼吸道六重病原体。结果 67份标本中,呼吸道病毒阳性仅4例,主要为肠鼻病毒。呼吸道六重病原体检测中,阳性标本为26例,其中肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体阳性较多。结论 RVP Fast与Seeplex PneumoBacter ACE Detection assay联合使用,有利于明确呼吸道感染病原体。     

mariPOC~法在儿童呼吸道病原体检测中的应用

目的探讨双光子荧光激发(TPX)mariPOC~法与直接免疫荧光(DFA)镜检法检测儿童鼻咽分泌物病毒抗原结果的相关性和一致性,评估mariPOC~法的检测效能。方法检测335例呼吸道感染患儿鼻咽分泌物标本中的呼吸道合胞病毒(RSV),腺病毒(ADV),流感病毒A、B型(Flu A、B),副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型(PIVⅠ、Ⅱ、Ⅲ)这7种常见病毒,使用Kappa检验分析两种检测方法的一致性。对检出的人类偏肺病毒(hMPV)、肺炎链球菌阳性标本,使用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法进行验证。结果335例临床标本中的7种呼吸道病毒经mariPOC~法、DFA镜检法检测,总阳性率分别为38.21%和37.31%,一致率为98.4%。单一病毒的一致率为94.6%~100.0%。7种病毒检测的一致性均较高,Kappa值为0.848~1.000(P0.01)。mariPOC~法检测hMPV、肺炎链球菌的阳性率分别为1.19%、2.69%,与实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测结果一致。结论 mariPOC~法检测呼吸道病毒的准确性较高,且具有快速、灵敏和智能优势,对hMPV、肺炎链球菌的检测结果准确,在临床中可以得到很好的应用。     

建立一种PCR产物直接测序检测HBVYMDD突变的方法

目的 建立检测HBV YMDD变异的PCR产物直接测序法,并与传统实时荧光PCR检测YMDD突变的结果进行比较分析.方法 选取103份慢性乙型肝炎患者血清标本,提取血清HBVDNA.用实时荧光PCR检测YMDD突变;用巢式pcR扩增HBV逆转录酶基因,对PCR产物进行DNA双向测序,NTI软件比对结果.采用Kappa一致性检验对DNA测序法检测的rt204位点突变与实时荧光PCR检测的YMDD突变结果进行比较.结果 PCR产物直接测序法可有效检测低病毒载量标本(500拷贝/ml)和高病毒载量(1010拷贝/ml)标本,同时可以避免高病毒载量标本的抑制效应.与实时荧光PCR相比较,YIDD突变检测符合率为100%,YVDD突变检测符合率97.1%,YIDD与YVDD共生突变符合率76.2%(Kappa=0.853,P<0.01).结论 本研究建立的PCR产物直接测序法检测HBV耐药相关基因突变,灵敏度高,检测范围宽,与实时荧光PCR检测结果有较高的符合率,并可同时检出YMDD、YIDD和YVDD.     

多重荧光定量PCR和液态芯片技术对下呼吸道病毒检测的应用比较

目的比较荷兰Patho Finder公司多重荧光定量PCR技术(Respi Finder 2SMART试剂盒,简称Respi Finder检测)和加拿大Luminex公司液态芯片技术(呼吸道病毒检测试剂盒,简称x TAG RVP)对下呼吸道标本病毒检测的结果。方法收集2015年1至12月于北京协和医院疑似病毒性肺炎住院患者100例下呼吸道标本,分别利用Respi Finder和x TAG RVP检测试剂进行常见呼吸道病毒核酸检测,并全部进行PCR及测序分析,比较两种方法的敏感性和特异性。结果 100份下呼吸道标本经Respi Finder和x TAG RVP方法检测,阳性率分别为60.0%和51.0%,混合感染率均为8.0%。两种方法结果一致率为80.0%。以PCR及测序结果为准,经Respi Finder和x TAG RVP方法检测的敏感性分别为97.9%和94.3%,特异性分别为74.5%和97.9%,阳性预测值分别为78.3%和98.0%,阴性预测值分别为95.0%和93.9%,两法检测特异性及阳性预测值差异有统计学意义(P0.05)。结论与Respi Finder方法相比,x TAG RVP对常见呼吸道病毒检测的特异性较好,敏感性相当,对呼吸道病毒的检测性能优于Respi Finder检测。     

建立检测18种（型/亚型）呼吸道病毒的两种循环参数的实时荧光定量PCR

目的建立两种不同循环参数的实时荧光定量PCR,检测包括流感病毒、冠状病毒等18种(型/亚型)呼吸道病毒。方法引用文献报道的18种(型/亚型)呼吸道病毒引物和探针,建立两种不同循环参数的实时荧光定量PCR法,考核方法的敏感性、特异性和准确性,并用临床标本进行验证。结果成功建立了可检测18种(型/亚型)呼吸道病毒的两种不同循环参数的实时荧光定量PCR法;该法特异性较好,最低检测限为10拷贝数/μL,变异系数(CV)为1.26%~3.43%,重复性良好;408份临床标本中,用该法检测鼻拭子标本阳性率为63.2%(225/356),肺泡灌洗液标本阳性率为25.0%(13/52)。结论建立的实时荧光定量PCR法简便、特异、敏感、稳定,适用于临床常见呼吸道病毒感染的早期诊断。     

液相芯片技术检测儿童急性呼吸道感染病原体的研究

目的探讨液相芯片技术快速检测呼吸道病原体的可行性,为重大传染病原体核酸快速应急检测平台的建立提供实验依据。方法采用xTAG~?Respiratory Viral Panel Fast v2试剂盒对74例咽拭子临床标本进行检测,结果与实时荧光定量PCR(RT-PCR)进行比较。结果 74例咽拭子临床标本经液相芯片技术与RT-PCR检测,阳性率分别为77.0%和68.9%,差异有统计学意义(P0.05);其中呼吸道合胞病毒、鼻病毒、肠道病毒、甲型H1N1流感病毒、腺病毒及人博卡病毒检出率差异均有统计学意义(P0.05)。结论液相芯片技术可以较准确地鉴定呼吸道病原体和检测混合感染的临床标本,具有快速、高通量等优势,可应用于呼吸道病原体的快速应急检测。     

GeneXpert实时荧光定量PCR快速检测艰难梭菌的临床评估

目的对GeneXpert实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)在快速检测临床粪便标本中艰难梭菌的应用进行评估。方法采用双拭子蘸取临床未成形粪便标本,一支拭子用于GeneXpert实时荧光定量PCR检测艰难梭菌毒素基因tcdB,另一支用于常规厌氧菌培养检测;对GeneXpert实时荧光定量PCR检测结果与常规厌氧菌培养结果的一致性进行统计学分析,并计算GeneXpert实时荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值等参数。结果临床收集到141例未成形粪便标本,GeneXpert实时荧光定量PCR检出艰难梭菌毒素基因tcdB阳性42例,其中常规厌氧菌培养阳性34例,两者一致性较好(Kappa=0.775 0,P0.01),GeneXpert实时荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为87.2%、92.2%、81.0%和94.9%。结论 GeneXpert实时荧光定量PCR直接检测粪便标本中的艰难梭菌具有检测快速、操作简便等优点,有重要的临床应用价值。     

实时荧光PCR和六胺银染色对肺孢子菌肺炎诊断价值的分析评价

目的比较实时荧光PCR和六胺银染色对肺孢子菌肺炎(PCP)的诊断价值。方法收集2014年1～12月北京协和医院疑似PCP患者非重复送检标本共2 525例,其中2 492例标本用六胺银染色法对肺孢子菌孢囊进行检测,33例标本用实时荧光PCR法对PCP-DNA进行检测,429份标本同时用六胺银染色法和实时荧光PCR法进行检测,以临床诊断为标准,分析两种方法的阳性率、敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。结果六胺银染色法的阳性率为1.2%(30/2 492),其中痰、气管插管支气管吸取物和肺泡灌洗液的阳性率分别为0.70%(13/1 845),4.00%(10/250)和2.72%(7/257)。实时荧光PCR法的阳性率为34.20%(158/462),痰和肺泡灌洗液的阳性率分别为30.61%(105/343)和44.54%(53/119)。六胺银染色法和实时荧光PCR法的敏感度13.97%vs 72.07%(χ~2=68.625,P0.01),特异度100%vs94.24%(χ~2=4.296,P0.05),阳性预测值100%vs 92.14%(χ~2=6.380,P0.01),阴性预测值55.36%vs 78.26%(χ~2=11.873,P0.01),差异均具有统计学意义。结论实时荧光PCR敏感度高,相对干扰因素少,临床诊断价值高,但标本送检率明显低于六胺银染色,建议临床提高其送检率,提高PCP的早期诊断。     

SYBR Green实时荧光PCR方法检测广谱人乳头瘤病毒的方法建立

目的建立实时荧光PCR方法以检测广谱人乳头瘤病毒。方法该实时荧光PCR方法利用了degenerate PCR引物与非特异性的SYBR Green染料替代通常使用的PCR特异性引物与探针,并与市售高危13型、低危6型试剂盒以及degener-ate PCR方法进行比较。结果对于用高危13型试剂盒及低危6型试剂盒检测的100例黏膜型人乳头瘤病毒阳性标本,用SYBR Green实时荧光PCR方法检出的阳性数为69例,敏感性为69%,相反,用SYBR Green实时荧光PCR方法检测出的40例皮肤型人乳头瘤病毒阳性标本,用高危13型试剂盒以及低危6型试剂盒检测均为阴性;对于用SYBR Green实时荧光PCR方法及degenerate PCR方法检测的90例黏膜型、60例皮肤型标本,其检测结果显示两种方法有高度一致性(Kappa=0.907)。结论与市售试剂盒相比,SYBR Green实时荧光PCR方法可以覆盖广谱的HPV型别(皮肤型与黏膜型),并且比degenerate PCR方法高效、快速和简便,不失为一个可用于临床与科研的良好检测手段。     

应用实时荧光RT-PCR技术检测诺如病毒感染

目的应用实时荧光RT-PCR检测技术对诺如病毒(NV)感染进行快速检测,为疾病预防控制提供准确、可靠的实验室诊断依据。方法采集急性胃肠炎暴发流行事件的标本(2例呕吐物、35例粪便和8例自来水等外环境标本)进行实时荧光RT-PCR检测。结果共有20例标本(1例呕吐物、16例粪便和3例自来水)的诺如病毒核酸实时荧光RT-PCR检测阳性。结论这是由诺如病毒感染引起的急性胃肠炎暴发流行;实时荧光RT-PCR检测技术可应用于传染病的快速应急检测。     

2008-2011年湖北省宜昌市手足口病的流行特征分析

目的 了解湖北省宜昌市手足口病的流行特征, 为手足口病的综合防治提供科学依据。 方法 收集2008-2011年宜昌市包括各县(市、区)报告的手足口病疫情病例和聚集性病例的相关标本, 采用荧光定量RT-PCR方法进行检测。 结果 在473份标本中, 男女性别比为1.26:1,手足口病发病高峰在春末和夏初;疱疹液的阳性检出率高于咽拭子(2=8.026,P0.01)和口漱液(2=12.67,P0.01);共检测到肠道通用病毒阳性标本298份, 总检出率为73%,其中肠道病毒71型(EV71)阳性标本191 份,柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)阳性标本78份,其他肠道病毒为29份,EV71的检出率高于Cox A16(2=86.517,P0.01)和其他肠道病毒(2=189.089,P0.01)。 结论 宜昌市手足口病的病原体主要是EV71(64.1%)和Cox A16(26.2%), 随不同年份优势毒株稍有差异,EV71是引起宜昌市2008-2011年手足口病病例的主要优势毒株类型。     

实时荧光PCR在检测MRSA引起血流感染中的研究

目的建立检测引起血流感染中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）mecA基因的实时荧光PCR法。方法设计mecA引物,优化荧光实时PCR实验条件,并用该法检测临床分离的78株金黄色葡萄球菌引起血流感染标本,其结果与头孢西丁纸片扩散法的结果进行比较。结果 78株金黄色葡萄球菌中,荧光实时PCR法检测出mecA基因阳性38株、阴性40株;头孢西丁纸片扩散法检测出MRSA 27株、MSSA 51株,经配对卡方检验,荧光实时PCR法检出率显著高于头孢西丁纸片扩散法（P〈0.01）。结论荧光实时PCR法能敏感、特异检测MRSA引起的血流感染,比一般MRSA表型检测更加简便、快速。     

大足地区儿童呼吸道病毒感染病原学分析

目的了解大足地区住院患儿常见呼吸道病毒感染病原体及其感染特点。方法对2013年2月至2014年4月共7 403例因呼吸道感染收治住院患儿进行回顾性分析,采用直接免疫荧光法检测患儿鼻咽分泌物中的7种常见呼吸道病毒,同时检测患儿肺炎支原体感染情况。分析不同性别、年龄段、季度患儿病毒感染率及合并肺炎支原体感染情况。结果 (1)7 403份标本中检测出病毒阳性1 315例(17.76%),各病毒阳性率分别为呼吸道合胞病毒(RSV)8.63%、腺病毒(ADV)1.49%、流感病毒A(IVA)1.99%、流感病毒B(IVB)1.24%、副流感病毒(PIV)Ⅰ1.35%、PIVⅡ0.41%、PIVⅢ2.66%。检出肺炎支原体阳性750例(10.13%)。(2)不同性别呼吸道病毒感染差异无统计学意义(χ2=0.746,P0.05),而不同年龄及季节呼吸道病毒感染差异有统计学意义(χ2=58.124,P0.01;χ2=428.724,P0.01)。(3)检出病毒混合感染阳性标本17例(0.23%)。单一病毒合并肺炎支原体感染168例(13.11%),IVA、IVB及PIVⅡ型感染合并肺炎支原体感染率较高,分别为18.75%、25.27%和17.86%。结论儿童呼吸道病毒感染率与年龄和季节密切相关,且病毒感染后患儿合并肺炎支原体感染率较高。     

超敏HBV DNA定量检测系统的临床应用研究

目的:比较超敏HBV DNA检测系统与传统荧光定量PCR外标法定量检测血清乙肝病毒DNA,探讨其临床应用价值。方法:采用超敏PCR检测系统和传统荧光定量PCR外标法同时检测80例HBsAg阳性患者的血清HBV DNA浓度。结果:超敏法阳性检出率(92.5%)高于传统外标法(50.0%)(P0.01)。超敏法阳性定量结果中位值为2.95×10~5IU/mL,高于传统外标法(5.63×10~4IU/mL)(P0.01),两种方法对高载量病毒(≥10~4IU/mL)血清标本检测结果的相关性有统计学意义(R~2=0.89,P0.01)。超敏法对26例HBeAg阴性慢性乙肝患者的阳性检出率(100.0%)高于传统外标法(11.5%)(P0.01)。结论:超敏HBV DNA定量检测系统检测灵敏度高,更适用于临床低载量病毒(10~4IU/mL)血清标本的检测。     

手足口病患者体内肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型与常见呼吸道病毒的检测及临床分析

目的 调查手足口病患者中EV71和CA16的感染现状,分析呼吸道病毒合并感染对患者的影响.方法 收集2010年6-10月在北京佑安医院就诊的手足口病患者348例,包括门诊轻症患者100例,住院患者248例.采集患者咽拭子标本提取病毒RNA,用随机引物将标本中的RNA逆转录成cDNA,荧光PCR法检测EV71和CA16.以呼吸道病毒多重PCR引物扩增12种呼吸道病毒的基因片段,通过电泳分析判断结果.比较EV71(+)或CA16(+)组与EV71(-)CA16(-)组合并呼吸道病毒感染阳性率和重症患者比例,住院与门诊手足口病患者中合并感染呼吸道病毒的阳性率.结果 348例手足口病患者,共检测出呼吸道病毒感染36例.在248例住院手足口病患者中,111例EV71(+)或CA16(+)组患者呼吸道病毒感染率7.2%,相比137例EV71(-)CA16(-)组患者呼吸道病毒感染率7.4%,差异无统计学意义(x2=0.059,P＞0.05).在100例门诊轻症手足口病患者中,有17例(17%)合并呼吸道病毒感染,高于111例EV71(+)或CA16(+)组患者呼吸道病毒感染率,差异有统计学意义(x2=4.830,P＜0.05).在111例EV71(+)或CA16(+)组中,重症患者为101例(91.0%);在137例EV71(-)CA16(-)组中,重症患者为132例(96.4%),两组重症患者率差异无统计学意义(x2=3.099,P＞0.05).在348份标本中检出占前3位的呼吸道病毒分别是人鼻病毒A/B(HRV A/B)、人副流感病毒3(PIV3)、甲型流感病毒(FLU A).结论 手足口病患者中存在呼吸道病毒合并感染,但合并感染对手足口病病情未见明显影响.     

细菌革兰双检荧光定量PCR方法检测新生儿败血症

目的 建立细菌革兰阴、阳性菌双重实时荧光定量检测体系,探讨其检测败血症的临床应用价值.方法 分析细菌16SrRNA基因序列,在高度保守区自行设计通用引物和革兰阴性和阳性分型探针,选取临床较常见的35株菌株进行细菌革兰双检实时荧光定量PCR方法检测;对临床疑为败血症的512例新生患儿分别做细菌革兰双检荧光定量PCR和血培养检测.结果 细菌革兰双检荧光定量PCR具有较好的敏感性和特异性,能稳定检测到10 CFU左右细菌数.35株菌株进行细菌革兰双检荧光定量PCR检测,均为阳性,且革兰阴、阳性菌能正确分型和定量.巨细胞病毒、EB病毒、乙肝病毒、新型隐球菌及白色念珠菌、人基因组DNA及空白对照均为阴性.对临床疑为败血症的512份新生患儿标本中,革兰双检荧光定量PCR检测血标本阳性率8.20%(42/512),血培养阳性率6.25%(32/512),前者明显高于后者,差异具有统计学意义(χ<'2>=8.10,P<0.01),30例非感染性疾病同期患儿血标本革兰双检荧光定量PER及细菌培养均为阴性.若以血培养作为对照,细菌革兰双检荧光定量PCR方法的诊断敏感度为100%,特异度为97.92%,准确性98.05%.结论 建立了用通用引物和分型双荧光探针的细菌革兰双检荧光定量PER方法.其检测快速、准确,具有很大的临床推广价值.     

尿液微量白蛋白快速筛查方法应用的评估

目的 评估一种尿液微量白蛋白(mALB)快速筛查方法的临床应用价值.方法 选取2006年12月到2007年2月首都医科大学附属复兴医院尿常规检测标本613份,采用H-800全自动尿液分析仪干化学快速筛查法对mALB进行定性检测.对筛查阳性的标本和部分阴性标本采用Immage-800全自动特定蛋白分析仪同时做mALB的定量检测,以验证mALB的干化学法筛查效果.筛查阳性组与阴性组间mALB定量检测结果的比较采用两样本比较的秩和检验.计数资料的比较采用一致性Kappa检验.结果 613份尿常规检测标本中,经干化学快速筛查法检测为mALB阳性的共114份,阳性率为18.6％.114份阳性标本中,经Immage-800全自动特定蛋白分析仪定量检测确定为mALB阳性的共71份(mALB检测结果＞13.3 mg/L为阳性).76份经干化学快速筛查法检测为mALB阴性的标本,经定量检测确定为mALB阳性的有8份.经一致性检验,干化学法与定量检测法差异有统计学意义( Kappa=0.481,P＜0.01).筛查阳性组mALB水平为17.70 (9.19 ～32.90) mg/L,显著高于阴性组的4.55(2.38～7.60) mg/L,差异有统计学意义(Z=-8.644,P＜0.01).相对于定量法,该mALB快速筛查方法的检测敏感度为89.9％(71/79),特异度为61.3％(68/111).结论 mALB快速筛查法具有一定的筛查价值,但存在一定的漏诊率,应进一步完善检测方法,提高检测敏感度.     

一起诺如病毒Ⅰ、Ⅱ型混合感染引起的感染性腹泻疫情调查

目的应用荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测技术,对疑似诺如病毒感染引起的腹泻疫情标本进行核酸检测,为疫情控制提供准确可靠的技术支持。方法从18例粪便标本中提取RNA,进行诺如病毒核酸荧光定量RT-PCR检测。结果18份标本中有13份诺如病毒核酸RT-PCR检测阳性,阳性率为72.2%。其中6份标本中检出诺如病毒Ⅰ型;6份标本中检出诺如病毒Ⅱ型;有1份标本同时检出诺如病毒Ⅰ型、Ⅱ型。结论应用荧光定量RT-PCR技术,对诺如病毒进行核酸检测结果准确可靠。     

实时荧光PCR检测高危型HPV的评价

目的评价杂交捕获二代(HC-Ⅱ)和实时荧光PCR(real-time PCR)两种人乳头瘤病毒(HPV)检测方法的一致性;探讨两法筛查宫颈癌及其癌前病变的敏感性和阴性预测值;为实时荧光PCR试剂盒的应用提供临床资料。方法对877名就诊的妇女用HC-Ⅱ和real-time PCR两种方法检测HPV,并进行宫颈液基细胞学检查(LCT),其中任一结果异常者再进行组织病理检查。结果877名妇女中有804名两种HPV检测法结果一致,总符合率达91.7%,一致性检验Kappa值为0.792。在对高级别宫颈上皮内瘤样病变(CIN)的检测中,HC-Ⅱ和real-time PCR的敏感性分别为96.7%和94.6%,阴性预测值分别为99.5%和99.2%。结论real-time PCR与HC-Ⅱ检测具有很好的一致性,可用于宫颈癌及其癌前病变的筛查。