简并PCR在肠道病毒血清型鉴定中的应用

目的 探讨共有序列简并杂合寡核苷酸引物PCR（CODEHOP-PCR）在肠道病毒血清型鉴定中的临床应用价值。方法 以CODEHOP-PCR检测经实时荧光RT-PCR鉴定为EV71和CA16 手足口病患者的临床样本和病毒分离培养细胞上清的肠道病毒VP1基因片段,经琼脂糖凝胶电泳并回收、测序,与Genbank提供的序列比较,确定肠道病毒的血清型。结果 CODEHOP-PCR后的序列分析表明,所有的EV71毒株和CA16毒株与近几年国内报道的部分毒株同源性在96%以上,其血清分型结果验证了实时荧光RT-PCR分型结果的准确性。结论 CODEHOP-PCR合并测序用于肠道病毒血清型的准确鉴定,与传统的病毒分离及血清中和试验相比,具有更快速、准确的优点。     

肠道病毒71型特异性单克隆抗体的制备及其在病毒鉴定中的应用

目的：建立肠道病毒71型（ EV71）特异性检测的免疫荧光方法用于病毒分离培养后的EV71鉴定,为EV71生物学特征研究和疫苗株的筛选奠定基础。方法：以EV71 VP1为免疫原制备单克隆抗体,用经测序鉴定的肠道病毒毒株建立EV71特异性免疫荧光方法;将不同地区收集的手足口病患儿的临床标本进行病毒分离,利用EV71特异性单抗进行分离培养后的病毒鉴定。结果：制备获得2株单抗,经鉴定其中1株3 E12为EV71特异性单抗;以此单抗建立的免疫荧光方法对EV71感染细胞呈阳性反应,而与柯萨基病毒A16和埃可病毒6等非EV71肠道病毒不反应。从104份手足口病临床标本中共分离到35株病毒,产生肠道病毒典型的细胞病变;用3E12特异性单抗免疫荧光鉴定分离病毒,其中29株为EV71,与RT-PCR验证结果完全一致。结论：成功制备获得EV71特异性单克隆抗体,以此单抗建立的EV71特异性免疫荧光方法敏感性高、特异性强,可用于分离培养EV71的鉴定。     

惠州市重症手足口病病原谱及EV71型VP1区基因特征分析

目的分析惠州市手足口病重症病例的病原谱构成,了解惠州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征,为科学防治手足口病提供科学依据。方法采集300例重症手足口病(HFMD)患者标本,采用实时荧光RT-PCR检测肠道病毒核酸,并对肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxA16)进行分型检测;选择8株EV71分离株进行VP1区基因全长序列测定,测序结果利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega5.0软件构建亲缘性进化树。结果通过实时荧光RT-PCR特异性检测,EV71阳性结果 154份,阳性率为51.33%;CoxA16阳性结果 38份,阳性率为12.67%。测序结果表明,8株EV71之间的VP1基因核苷酸同源性为96.9%~99.2%,氨基酸同源性为99.3%~100%。VP1区基因遗传进化分析表明,8株EV71分离株与C4基因亚型的代表株处于同一分支,均属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论惠州市手足口病疫情主要病原EV71病毒均属于C4a基因亚型,与2004年以来的中国大陆EV71病毒流行的基因型一致,未产生明显的抗原漂移及变异。     

重庆地区2009年手足口病病原分离鉴定及病毒基因组特征

目的 对2009年重庆市手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)患儿粪便标本的病原进行分离鉴定及全基因组序列测定,并同相关毒株序列进行同源性比对和进化分析,以了解新分离病毒基因组序列特征及可能的传播来源.方法 将47例手足口病患儿临床标本接种人横纹肌肉瘤细胞(human rhabdomyosarcoma,RD)进行分离培养,采用EV、EV71、Cox A16特异性引物对出现细胞病变的细胞上清进行PCR鉴定,同时电镜观察病毒颗粒形态,将鉴定的病毒基因组分为4个片段进行RT-PCR扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析,绘制进化树.结果 在47例HFMD患儿临床标本接种RD细胞培养中,有7份观察到明显的细胞病变,通过RT-PCR检测有3份呈EV特异性引物及EV71特异性引物阳性,而所有标本Cox A16特异性引物检测为阴性,EV71特异性引物的PCR产物测序结果证实为EV71病毒,同时用电镜观察形态病毒感染的RD细胞,为圆形无包膜病毒颗粒,证实所分离病毒为EV71.测序获得的3株EV71病毒基因组全长分别为7 409、7 406 nt和7 404 nt,其VP1氨基酸序列同源性达99%以上.Blast分析表明重庆毒株Chongqing-2-09-China(GQ994990.1)、Chongqing-3-09-China (GQ994991.1)均与安徽阜阳2008年分离的3株EV71毒株同源性较高,重庆毒株Chongqing1-09-China (GQ994989.1)与2005年台湾分离984 polyprotein、1235 polyprotein序列毒株同源性最高,进化分析表明属于C4基因亚型.结论 新分离的重庆EV71毒株基因组序列符合肠道病毒特征,与国内2008年安徽阜阳及台湾2005年分离的EV71病毒可能具有相同来源.     

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型分离株的VP1基因特征分析

目的:探讨苏皖地区手足口病(HFMD)患者肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)分离株的VP1基因特征。方法:采集南京市、马鞍山市2009至2010年HFMD患者临床标本进行病毒分离和RT-PCR鉴定;扩增并测定VP1基因序列;从GenBank中选取EV71和CA16不同基因型参考毒株,利用生物信息学软件进行同源性比对和系统进化树分析。结果:共分离到9株EV71和4株CA16,EV71分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.5%～99.8%和99%～100%;CA16分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性为96.2%～98.5%和99.3%～100%;系统进化树分析显示,9株EV71全部属于C4a基因亚型,而4株CA16则全部属于B1b基因亚型。结论:2009至2010年苏皖地区分离到的EV71和CA16毒株分别属于C4a和B1b基因亚型,与国内其他地区HFMD病原学及分子进化研究结果一致,有望成为疫苗候选株作进一步研究。     

柯萨奇A组6型病毒TaqMan探针实时荧光RT-PCR的建立

目的建立柯萨奇A组6型病毒TaqMan探针实时荧光RT-PCR,用于手足口病例快速诊断及监测。方法根据GenBank中柯萨奇A组6型病毒VP1高保守序列设计引物和探针,建立和优化实时荧光RT-PCR反应体系,评估其特异性、灵敏度、稳定性,在手足口病监测中应用,并与商品化试剂比较,抽取部分阳性标本测序验证。结果本研究建立的柯萨奇A组6型病毒实时荧光RT-PCR可在60 min内完成检测,与其它型别的肠道病毒和病原体无交叉反应,灵敏度可达10~0 copies/μL梯度,对两个不同核酸浓度样本Ct值的变异系数分别为0.29%、0.38%。280份非EV71、CA16的标本中检出142份CA6阳性标本,与商品化试剂检测结果一致。随机抽取15份阳性标本产物测序,与CA6靶基因序列同源性99.8%以上。结论建立的柯萨奇A组6型病毒实时荧光RT-PCR方法特异、灵敏、稳定,可用于非EV71、非CA16的其它肠道病毒标本分型。     

洛阳市非EV71、非CA16肠道病毒中优势毒株状况分析

目的：了解洛阳市引起手足口病的普通肠道病毒的构成情况,警惕比例较高毒株发展为新的优势毒株,为洛阳市的手足口病防控提供科学依据。方法采用实时荧光PCR（RT‐PCR）对洛阳市手足口病的送检粪便标本进行核酸鉴定,随机选取9例普通肠道病毒阳性,而柯萨奇病毒A16型（CA16）和新肠道病毒71型（EV71）阴性的标本,进行5′UTR测序,确定毒株的亚型。利用CA6的特异性引物,选取75例普通肠道病毒阳性标本（CA16和EV71阴性）,用 RT‐PCR方法鉴定CA6的阳性数量,分析CA6的构成比。结果9个普通肠道病毒5′UTR测序结果进行BLAST初筛,结果显示CA6为5株,在普通的肠道病毒中为优势毒株;75例普通肠道病毒中,共检测出CA620例。CA6在普通肠道病毒中的比例为29．76％（25／84）;25例CA6中,男13例,女12例;引发重症的病例为2例;城市地区5例,乡村20例。结论洛阳市引起手足口病的普通肠道病毒的构成较为复杂,在引起手足口病的普通肠道病毒中CA6病毒所占比例较高,对此应引起重视。     

1起由肠道病毒CA6引起的手足口病聚集性疫情的病原学鉴定

目的对2015年6月开封市1所幼儿园发生的1起由CA6型肠道病毒引起的手足口病聚集性疫情进行病毒型别快速鉴定。方法采集病例及密切接触者的粪便标本,运用荧光定量PCR方法进行总肠道病毒、CA16、EV71和CA6检测,并采用半巢式PC R方法进行肠道病毒VP1序列扩增,对目的条带测序鉴定肠道病毒型别。结果 24例病例24份标本中22份标本检出总肠道病毒阳性,36名密切接触者36份标本中有10人10份标本检出阳性,肠道病毒阳性率分别为91.67%和27.78%,其中分别有22例病例和6名密切接触者CA6阳性,阳性率分别为91.67%和16.67%,所有标本CA16和EV71检测阴性。6例病例和3名密切接触者的9份标本半巢式PCR扩增阳性,测序结果显示VP1序列均为CA6。结论开封市此次发生在幼儿园的1起手足口病聚集性疫情由肠道病毒CA6型引起;荧光定量PCR与半巢式PCR扩增肠道病毒VP1序列能快速准确的鉴定CA6型肠道病毒。     

东莞市2011年手足口病肠道病毒型别分析

目的了解引起东莞市2011年手足口病疫情的肠道病毒型别。方法采用荧光RT-PCR方法对标本中总肠道病毒、肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CVA16)进行特异性核酸检测。对非EV71非CVA16的其它肠道病毒采用VP4基因测序进行型别鉴定。结果 2011年共检测608份手足口病病例标本,537份为阳性,其中198份为EV71阳性(占36.87%),128份为CVA16阳性(占23.84%),211份为非EV71、非CVA16的其它肠道病毒阳性(占39.29%)。对其它肠道病毒进行VP4基因测序分型,共获得50个可用序列,通过BLAST在线比对确定型别,1例CVA1,43例CVA6,4例CVA10,1例CVA12,1例CVB1。结论 2011年引起手足口病的非EV71非CVA16肠道病毒构成比已超过EV71和CVA16,成为东莞引起手足口病主要病原体之一,其中CVA6构成比较大,值得进一步研究。     

双重实时荧光PCR在手足口病快速检测中的应用

目的 探讨双重实时荧光PCR 技术检测手足口病肠道病毒的应用效果.方法 用单一实时荧光PCR先检测标本中的肠道病毒通用病毒核酸,肠道病毒通用病毒核酸阳性再分别用双重实时荧光PCR及单一实时荧光PCR检测CoxA16型和EV71型特异性核酸,比较两种方法检测结果.结果 240份标本中肠道病毒通用型核酸阳性157份,双重实时荧光PCR法CoxA16阳性111份,EV71阳性1份,其他肠道病毒45份,单一实时荧光PCR法CoxA16阳性109份,EV71阳性1份,CoxA16+EV71阳性2份,其他肠道病毒45份.EV71和其他肠道病毒符合率为100%.结论 双重实时荧光PCR 检测技术可以准确检测手足口病肠道病毒,且特异性强、灵敏度高,又可以快速得到检测结果,是一种快速检测手足口病病毒的方法.     

病毒性脑炎患者脑脊液肠道病毒和EV71检测与分析

目的 探讨肠道病毒和EV71所致脑炎的发病情况及荧光定量PCR诊断病毒性脑炎的意义.方法 收集银川市118例临床诊断病毒性脑炎、脑膜炎患者脑脊液和血清,用荧光定量PCR检测肠道病毒和EV71阳性率及病毒拷贝数,用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）定性检测血清EV71病毒IgM抗体.结果 荧光定量PCR检测肠道病毒阳性病例42例,检测阳性率为35.6％;EV71阳性病例22例,检测阳性率为18.6％,占EV阳性病例的52.3％;ELISA定性检测EV71病毒IgM抗体,阳性病例30例,检测阳性率25.4％,肠道病毒和EV71病毒性脑炎患者6岁以内幼儿明显多见于其他年龄组.结论 肠道病毒是本地区病毒性脑炎、脑膜炎患者最常见的病原体,EV71可能是本地区肠道病毒性脑炎中最多见的一种,肠道病毒和EV71感染所致脑炎都以6以内幼儿为主;荧光定量PCR对EV71检测特异性高于ELISA.     

用原位杂交法检测肠道病毒基因组同源性的研究

人类肠道病毒属于微小RNA病毒科,包括脊髓灰质炎病毒(PV)、柯萨奇A组(CAV)、B组病毒(CBV),埃可病毒(EV)4组病毒和肠道病毒68-72型。72型为肠道病毒的新成员甲型肝炎病毒(HAV)。肠道病毒是一组与人类多种疾病密切相关较为复杂的病毒。属内各组病毒基因同源关系尚未完全清楚。而HAV与传统肠道病毒的     

贵阳地区2013年手足口病非 EV71、非 CVA16型肠道病毒的检测分析

目的：了解贵阳地区引起手足口病（HFMD）的非肠道病毒71型（EV71）、非柯萨奇病毒 A（CVA）16型肠道病毒的病原构成及优势型别,为贵阳地区 HFMD 防治工作提供依据。方法收集2013年4～6月检测为非 EV71、非 CVA16型肠道病毒的 HFMD 患者肛拭子标本共107例。提取病毒核酸,用巢式 RT-PCR 法扩增病毒 VP4区序列,对 PCR 阳性扩增产物进行测序,通过与 GenBank 收录的序列 BLAST 比对确定病毒型别;并对优势型别进行序列和进化分析。结果107例标本中共有100例标本巢式 RT-PCR 检测为阳性（93％）,其中100例 PCR 产物测序成功,经 BLAST 比对后,100例标本病毒型别均得到确定：CVA6为46例,CVA10为30例,CVA5为10例,CVA2为6例,CVA3和 CVA4各2例,CVB2和 ECHO16各2例。 CVA6在型别确定的非 EV71、非 CVA16型肠道病毒中占42．99％,为优势肠道病毒型别。结论贵阳地区引起 HFMD 的肠道病毒型别多样,CVA6为非 EV71、非 CVA16型肠道病毒中的优势型别。     

肠道病毒RNA RT-PCR检测在病毒性心肌炎诊断中的应用

目的 探讨ＲＴ－ＰＣＲ方法在肠道病毒感染诊断中的应用。方法 根据肠道病毒５’非编码区和ＶＰ２基因区共同序列设计一对引物,建立了检测各型肠道病毒的ＲＴ－ＰＣＲ方法。用该方法扩增已知病毒,并用于临床标本检测。结果 所检测１１种已知病毒中,只对肠道病毒的９个型别扩增,１８６例心肌炎患者血清标本中,５２例（２７．９５％）阳性,１５例脑炎患者脑脊液标本中,４例（２６．６７％）,阳性。结论 该ＲＴ－ＰＣＲ方法     

肠道病毒感染和克山病病因关系的探讨

先后采用长片段RT-PCR、间接酶联免疫吸附法(ELISA)以及特异性柯萨奇病毒B3RT-PCR对四川省冕宁县、喜德县、德昌县克山病病区潜、慢型克山病患者血清中肠道病毒、血清中CVB1-6.IgM和CVB1-6IgG及血清IgM或IgG阳性者血中的柯萨奇病毒B3分别进行检测.结果显示①肠道病毒检出率较高,为60%;②潜在型、慢型克山病组血清CVB1-6IgM抗体阳性率明显高于健康对照组(33 % v50%,P＜0.05).结果提示病区潜、慢型克山病患者有肠道病毒感染存在,且有反复发作的现象.     

辽阳市手足口病患者标本肠道病毒检测结果

目的 通过对辽阳市2016年手足口病的临床诊断病例的咽拭子标本和粪便标本进行肠道病毒核酸检测和病毒分离培养,比较不同病毒分型下两种标本类型阳性率的差异,探究不同类型标本对手足口病实验室诊断的指导意义。方法 收集107例辽阳市2016年手足口病的临床诊断病例的咽拭子和粪便标本,提取样本核酸,用实时定量PCR法检测肠道病毒通用引物、肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型,通过McNemar检验以及Kappa检验对检测结果进行统计学分析。结果 配对采集病例两种类型标本共214份,肠道病毒通用引物、肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型的咽拭子标本核酸检测阳性率分别为48.6%、8.4%、22.4%;粪便标本的核酸检测阳性率分别为59.8%、11.2%、18.7%。PE、EV71病毒的粪便标本的检出率均大于咽拭子标本的检出率,但CV-A16病毒的粪便标本的检出率却小于咽拭子标本的检出率。其他肠道病毒的咽拭子标本和粪便标本的病毒检出率差异有统计学意义（P<0.05）,粪便标本肠道病毒检测阳性率高于咽拭子标本,同时显示较差的一致性（P<0.05）。结论 在手足口病实验室肠道病毒检测中,粪便标本的肠道病毒检测阳性率高于咽拭子标本,今后的手足口病防治工作中为提高标本检测阳性率,若时间紧迫应首先考虑选择采集粪便标本加以检测。     

应用通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应检测肠道病毒

目的设计通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应(RT-n-PCR),以达到广泛.特异及快速诊断肠道病毒(Enterovirus,EV)感染.方法在EV基因组5'端非编码区(5'-UTR)设计二对通用第物,建立RT-n-PCR检测方法,对3种EV和3种非EV标准株以及165例可疑EV感染的327份临床标本进行检测.结果EV标准株均在电泳中检测到一清晰312bp扩增条带,而非EV标准株则无扩增条带;共有104份标本检测到相应大小扩增条带,阳性率31.8%;147例病例同时检测了粪便和咽拭子,粪便阳性49例,咽拭子阳性44例,其中粪便和咽拭子同时阳性35例,粪便和咽拭子EV阳性比较无显著性差异(P＞0.05).病例总阳性数64例,阳性率38.8%.结论RT-n-PCR可以准确地检测出肠道病毒,特异性强,用时少,同时检测多份标本可以提高EV阳性率.     

脑脊液肠道病毒RT-PCR检测对病毒性脑炎患者的临床意义

的了解脑脊液肠道病毒（EV）逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）检测对病毒性脑炎患者的临床诊断和治疗意义。方法回顾分析2000～2003年进行了脑脊液EVRT—PCR检测的43例患者的临床特征，包括临床症状、体征、脑脊液生化常规及其他病毒病原体检查、头颅影像学和脑电图检查，并进行统计学分析。结果脑脊液EVRT—PCR阳性者18例，占41．9％，男性较多，多发病于7～9月。脑脊液EVRT-PCR阳性者的临床症状与阴性者无明显差异，但脑脊液蛋白和细胞数较高，可同时合并血中其他病毒（单纯疱疹病毒、巨细胞病毒）抗体阳性。结论肠道病毒引起的病毒性脑炎发病率高，并可合并其他病毒感染，EVRT-PCR检查结果可指导临床诊断和针对性用药。