PCR方法在出血性大肠杆菌O157:H7诊断中的应用

自1982年首次在美国引起出血性肠炎爆发以来,肠出血性大肠杆菌O157:H7(entero-hemorrhagic E.coli O157:H7,EHECO157:H7)已经成为世界性的重要的公共卫生和食品安全问题,曾在日本、美国、加拿大等国造成了暴发流行和大规模食物中毒事件.估计目前在美国每年可造成大约70000人感染.     

猪链球菌脉冲场凝胶电泳分析方法的建立

目的 建立一种可共享的猪链球菌脉冲场凝胶电泳分析(PFGE)方法.方法 利用PulseNet技术优化猪链球菌PFGE分子分型方法,提出新的分析方案,包括胶块的制备、内切酶的选择、电泳条件等.利用DNAStar的Mapdraw软件对猪链球菌基因组序列进行分析,发现在242种内切酶中,Swa Ⅰ、Sma Ⅰ、Apa Ⅰ种酶比较适合.结果 通过对34个血清型共100株菌的分析,发现使用Swa Ⅰ可获得59种带型,使用Sma Ⅰ可获得53种带型,使用Apa Ⅰ可获得43种带型.其中以Swa Ⅰ的分辨率最好.结论 提出猪链球菌的Swa Ⅰ PFGE分析方法,并对条件进行优化,较原方法所需时间短、图像清晰,更具有可重复性,基本具备推广的条件.     

四川自贡地区健康人群中艾伯特埃希菌的分离鉴定

目的了解长期从事鸡鸭等家禽养殖及屠宰人员等健康人群艾伯特埃希菌的携带情况。方法收集家禽养殖、屠宰人群及其他健康人粪便,经EC肉汤增菌后PCR检测eae基因,阳性样品接种麦康凯琼脂,挑选不发酵乳糖菌落,通过16SrDNA序列分析和多位点序列分型(MLST)对菌株进行鉴定。分离株进行紧密粘附素亚型和cdtB亚型分析,并通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析与动物来源艾伯特埃希菌菌株间的相关性。结果从189份从事鸡鸭宰杀人员的粪便中,分离到2株艾伯特埃希菌,从58份其他健康人群粪便中分离到1株菌,而138份家禽养殖场人员粪便中未分离到菌株。3株菌株的紧密粘附素亚型分别为sigma,iota 2,nu,cdtB亚型均为Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ亚型。PFGE显示三株菌之间的带型相似性小于80%,并且与鸡鸭等来源的艾伯特埃希菌带型不同。结论从事鸡鸭屠宰等健康人员中存在一定程度的艾伯特埃希菌携带率,但其与家禽携带艾伯特埃希菌的关系,仍需进一步研究。     

抗坏血酸克吕沃菌脉冲场凝胶电泳分型方法的建立

目的建立适于抗坏血酸克吕沃菌的PFGE分型方法。方法参考PulseNet中大肠杆菌O157∶H7的PFGE分型方法,选择不同的限制性内切酶和不同的电泳参数,进行反复试验,来确定用于抗坏血酸克吕沃菌PFGE分型的具有高分辩能力的限制性核酸内切酶和电泳参数。结果5株抗坏血酸克吕沃菌经限制性内切酶XbaI、SpeI、BlnI酶切后,再经我们选定的参数电泳,可呈现理想的PFGE带型,具有良好的分型能力。而NotI、SmaI酶切后产生的片段绝大部分集中在200kb以下,且图谱上条带过于密集而难以明确区分。结论利用限制性内切酶XbaI、BlnI和SpeI的PFGE分型方法对抗坏血酸克吕沃菌都具有较好的分辨能力,都可以用于该菌的分子分型,但应优选限制性内切酶BlnI、XbaI。     

一株不产志贺毒素的肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株的鉴定

目的 对一株不产志贺毒素的肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株进行血清生化特征及毒力基因鉴定.方法 对154菌株进行常规血清生化鉴定,使用聚合酶链反应(PCR)方法检测该菌的志贺毒素基因及其他毒力因子,同时以southern杂交、Hela细胞毒实验进行证实.结果 菌株154的志贺毒素PCR检测、shouthern杂交为阴性,Hela细胞毒定量结果显示该菌株不产生志贺毒素,毒力因子eae,hly检测为阳性.结论 菌株154是不产志贺毒素的肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株,且具有O157:H7菌株特异性的毒力因子.     

16S rDNA序列在艾伯特埃希菌鉴定中的应用

目的 通过16S rRNA基因序列分析快速鉴定艾伯特埃希菌。方法 以30株疑似艾伯特埃希菌为材料,使用通用引物扩增其16S rRNA基因并进行测序。获得的序列与艾伯特埃希菌型菌株LMG 20976,基因组测序菌株KF1、NBRC107761、TW07627以及其他密切相关的细菌种(大肠埃希菌、赫曼埃希菌、费格森埃希菌、志贺菌和Shimwellia blattae)的16S rRNA基因序列进行比较,并使用N-J法构建进化树来分析其相关性。结果 30株疑似艾伯特埃希菌的16S rRNA基因序列与艾伯特埃希菌参考菌株的序列相似性最高,并与其聚类为一簇,为艾伯特埃希菌。结论 16S rRNA基因测序分析可用于艾伯特埃希菌的快速鉴定。     

胞苷生产菌的选育及发酵

目的选育胞苷脱氨酶缺失枯草芽孢杆菌,提高胞苷发酵单位,并对间歇补料分批发酵方式进行了初步研究。方法（1）以胞苷脱氨酶缺失枯草芽孢杆菌CDS36为突发菌株,对其进行紫外诱变,经6-杂氮尿嘧啶（6AU）、5-氟胞苷（5FCR）等进行定向抗性筛选;（2）采用间歇补料分批发酵,葡萄糖初始浓度10．0％,48h后补加10．0％,72h补加5．0％的补料方式培养,并测定发酵单位。结果（1）通过紫外诱变和抗性筛选得到了6-杂氮尿嘧啶、5-氟胞苷抗性的突变株CDS36—800—17,抗6-杂氮尿嘧啶和5-氟胞苷的临界浓度分别为1000mg／L和800mg／L;（2）通过间歇补料分批发酵方式发现培养96h,胞苷发酵单位可达4．86g／L,培养120h可达5．58g/l,比未经补料分批发酵时提高了20．0％。结论（1）筛选获得胞苷发酵单位较高的突变株CDS36—800—17,并具有较好的遗传稳定性,可稳定发酵;（2）间歇补料分批发酵方式可提高胞苷产量。     

大肠杆菌O157∶H7 OI115岛的多态性分析

目的研究大肠杆菌O157∶H7测序菌株EDL933的OI115岛在肠杆菌科细菌中的分布。方法用PCR和杂交方法检测OI115岛的21个基因,同时进行该岛序列测定。结果OI115岛和SPI-1毒力岛的分布特点相似,具有种属局限性。仅在大肠杆菌中存在,在EPEC、ETEC、EAggEC均可检测到该岛的缺失形式,在沙门菌、志贺菌、耶尔森、摩根菌等其他肠杆菌科细菌中未发现该岛的存在。在不同类别的致泻性大肠杆菌中,OI115岛也各有特点,共检测到该岛的3种存在形式。产生志贺毒素的大肠杆菌O157∶H7菌株、2株EAggEC和2株不典型大肠杆菌均具有完整的OI115岛。在不产生志贺毒素的大肠杆菌O157中具有H5、H12、H29、H42、H11、H19、H26、H10、H21鞭毛型的菌株缺失了第3基因簇,具有H16鞭毛型的菌株第2、第3基因簇同时缺失。结论本研究发现,OI115岛在致泻性大肠杆菌中分布广泛,可能和病原菌的进化有关。     

多重PCR方法鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌

目的 建立一种快速检测和鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法。方法 根据六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的毒力基因eae、stx1、stx2、elt、estIa、estIb、aggR、ipaH、afaD及16S rRNA基因rrs建立多重PCR反应体系,优化引物浓度、PCR反应条件等,评价该方法的特异性和灵敏度,并用该方法鉴定本实验室保存的174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌,将结果与单重PCR、本实验室已建立的鉴定五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法结果进行对比。结果 10对PCR引物均可特异性扩增相应基因片段。该反应体系对174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌的鉴定结果与单重PCR检测结果一致,本研究的多重PCR检测下限可达4.56 101 CFU/反应(1.14 104 CFU/ml)。结论 本研究采用毒力基因及内参照基因建立的多重PCR方法可在一个反应体系中鉴定和区分致泻性大肠埃希菌和志贺菌,为临床快速检测、疾病预防控制实验室筛查、腹泻的暴发溯源等提供了方便快捷的技术支持。     

马鞍山市非典型肠致病性大肠杆菌的鉴定及分子分型研究

目的通过常规鉴定方法和分子分析手段,了解马鞍山市非典型肠致病性大肠杆菌(a EPEC)的表型特征、菌株携带的eae基因型别及多位点序列分型(MLST)特征。方法病原学表型特征采用生化鉴定、血清学分型、药敏试验;分子生物学分析采用16s r DNA基因测序、PCR检测毒力基因、eae基因测序比对分型及MLST分型。结果 8株a EPEC测试菌生化特点与普通大肠埃希菌一致,1株菌产生H2S无法鉴定。1株菌为O26:K60,其余8株菌的血清学无法分型。药敏结果显示,44%仅耐氨苄西林,22%耐氨苄西林/舒巴坦和SMZ,其余均敏感。所有测试菌均为大肠杆菌,所有测试菌均携带uid A、eae基因而不携带stx1和stx2基因,均为a EPEC菌株。4株菌的eae基因无法分型,其余5株菌分别β1、β2、ε、ι1和ι2型。9株菌共产生6种ST型。结论马鞍山的a EPEC分离株的分子生物学特征呈现多样性,没有相对集中的遗传克隆群。