D-核糖发酵过程中的pH控制及对产D-核糖关键酶的影响

在枯草芽孢杆菌突变株D-756发酵生产D-核糖过程中，采用葡萄糖和葡萄糖酸钙混合发酵，葡萄糖酸作为pH调节剂，能促进菌体的生长，显著地提高D-核糖的产量。经酶活测定，发现流加葡萄糖酸能提高单位发酵液中葡萄糖酸激酶的酶活。在5L发酵罐中，利用葡萄糖酸维持发酵pH值在7．2，培养72h后产核糖76．8g／L。     

胞苷生产菌的选育及发酵

目的选育胞苷脱氨酶缺失枯草芽孢杆菌,提高胞苷发酵单位,并对间歇补料分批发酵方式进行了初步研究。方法（1）以胞苷脱氨酶缺失枯草芽孢杆菌CDS36为突发菌株,对其进行紫外诱变,经6-杂氮尿嘧啶（6AU）、5-氟胞苷（5FCR）等进行定向抗性筛选;（2）采用间歇补料分批发酵,葡萄糖初始浓度10．0％,48h后补加10．0％,72h补加5．0％的补料方式培养,并测定发酵单位。结果（1）通过紫外诱变和抗性筛选得到了6-杂氮尿嘧啶、5-氟胞苷抗性的突变株CDS36—800—17,抗6-杂氮尿嘧啶和5-氟胞苷的临界浓度分别为1000mg／L和800mg／L;（2）通过间歇补料分批发酵方式发现培养96h,胞苷发酵单位可达4．86g／L,培养120h可达5．58g/l,比未经补料分批发酵时提高了20．0％。结论（1）筛选获得胞苷发酵单位较高的突变株CDS36—800—17,并具有较好的遗传稳定性,可稳定发酵;（2）间歇补料分批发酵方式可提高胞苷产量。     

低浓度NaOH对小鼠精子DNA完整性的影响

目的用精子DNA完整性评价NaOH溶液对小鼠精子进行头尾分离的最优条件。方法取2～3月龄雄鼠附睾尾精子,稀释到合适浓度（5×10^6～10×10^6／ml）,0～37℃下,加入不同浓度NaOH溶液孵育,显微镜下观察精子的头尾分离率,流式细胞仪检测精子的质膜完整性及DNA完整性。结果NaOH对精子头尾分离的效果,与碱浓度、作用时间和作用温度呈正相关,作用温度越高,时间越长,头尾分离效果越好,但同时对精子DNA的损伤程度也就越大。本研究证实精子在10mmol／LNaOH溶液,0℃下孵育2h,精子头尾分离的效率可达55％,而精子DNA损伤与空白对照相比,则无显著性差异。结论在本研究条件下低浓度NaOH处理小鼠精子,方法简单易行,可有效去除小鼠尾巴,而又不使其DNA受损。     

ssp411基因siRNA表达载体的构建与有效干扰质粒的筛选

目的 为探索精子细胞特异表达的新基因ssp411在受精及早胚发育中的功能,设计并构建了以ssp411基因为靶点的RNA干扰表达载体siRNA-ssp411s,筛选其中对ssp411基因有显著干扰作用的表达质粒.方法 根据已知的ssp411 mRNA序列,选择设计三条带发卡结构的核苷酸序列,克隆到含有U6启动子的载体pRNAT-U6.1中并测序分析.用脂质体转染的方法将干扰质粒与表达质粒ssp411-pDsRed共转染293T细胞,24h后,荧光倒置显微镜观察转染效率,并收集细胞,通过实时定量PCR方法检测不同干扰质粒对ssp411 mRNA的干扰效果.结果 3个ssp411的siRNA片断被成功克隆到pRNAT-U6.1质粒载体中,插入片段测序结果与设计的序列完全一致.实时定量PCR结果表明,针对ssp411基因蛋白编码区3-22序列构建的干扰质粒效果最好,干扰效率可达71%.结论 成功构建了能表达ssp411 shRNA(small hairpin RNA)的重组质粒,同时通过共转染技术,筛选到一个干扰效果达70%以上的干扰片断,为建立转基因RNA干扰小鼠模型,在体内研究ssp411基因及蛋白的生殖生物学功能打好基础.     

猪凝血酶原的制备

通过对两种猪凝血酶原粗品制备方法（氢氧化镁吸附法和柠檬酸钡吸附法）的比较研究，发现钡法工艺的得率和纯度较高。本文着重研究柠檬酸钡、硫酸铵、磷酸二氢钾和Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ等对凝血酶原的稳定和激活作用，并通过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶柱色谱估测活化产物猪凝血酶的分子量。     

贯叶连翘中的1个异丙基二氧基黄酮醇化合物

目的分离鉴定贯叶连翘(Hypericum perforatum L.)的化学成分.方法通过硅胶柱色谱,sephadex LH-20分离纯化,根据理化常数和光谱分析鉴定结构.结果自贯叶连翘地上部分中分离得到3个黄酮类化合物.结论化合物1为新的天然产物,结构为3,5,7-三羟基-3',4'-异丙基二氧基黄酮.     

大肠杆菌核苷磷酸化酶的重组表达和活性

将大肠杆菌K-12菌株来源的嘌呤核苷磷酸化酶、尿苷磷酸化酶和胸苷磷酸化酶基因分别克隆到pET-11a载体并转化大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌表达,通过SDS-PAGE分析和酶的活性测定,重组菌诱导表达后目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的37%以上,与产核苷磷酸化酶的野生菌比较,酶的活性也有显著提高。在特异反应条件下,构建的工程菌可以用来高效催化核苷的转糖基反应。     

酶法合成5-杂氮-2’-脱氧胞苷

将瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）中的N-脱氧核糖转移酶II的基因(ntd)克隆到大肠杆菌BL21(DE3)中,构建原核表达系统,成功地得到一株大量表达N-脱氧核糖转移酶II的菌株PND。以异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂,该重组菌可大量表达N-脱氧核糖转移酶II。在此酶作用下,以5-杂氮胞嘧啶和脱氧胸苷为底物,生成胸腺嘧啶和目标产物5-杂氮-2’-脱氧胞苷。最佳反应条件为：底物浓度均为2 mmol/L, 20 mmol/LTris-HCl缓冲液(pH为7.1),     

酪蛋白磷酸肽的制备及性质

用不同的蛋白水解酶水解牛乳酪蛋白，通过钙－乙醇沉淀法和离子交换法从水解产物中提取酪蛋白磷酸肽（ＣＰＰｓ），并对ＣＰＰｓ进行体外化学分析及体内生物学功能鉴定，结果表明：用双酶法（胰蛋白酶和Ａｌｃａｌａｓｅ）制得的ＣＰＰｓ３（平均相对分子质量为４ ０６６，摩尔Ｎ／Ｐ为５．４８）在体外的持钙能力最强，连续喂食该样品的小鼠对钙的吸收明显提高（吸收率达５６％ ）。