猪源产志贺毒素大肠埃希茵耐药性及超广谱β内酰胺酶基因型分析

目的了解我国猪源产志贺毒素大肠埃希菌（Shigatoxin-producingEscherichiacoli,STEC）产超广谱8内酰胺酶（Extended—spectruml β-lactamases,ESBLs）情况及其基因型。方法对22株分离自重庆地区2个规模化养殖场健康猪粪的STEC菌株进行药物敏感性检测、ESBLs表型确证及7种类型（blaSHV,blaLEN,blaOKP,blaTEM,blaCTX-M,blaGES及blaKPC）ESBLs基因型PCR检测和测序分析。结果22株携带stx2e的STEC菌株中2株对所有23种测试抗生素敏感,其余菌株除对亚胺培南和美罗培南敏感外,对其他抗生素均存在不同程度耐药。10株sTEc菌株（占45．45％）产ESBLs酶。PCR检测其中1株为blaCTX-M-1基因型,其余9株为blaCTX-M-9 ＋blaTEM-1基因型。结论重庆地区猪源STEC中存在较高比例的产ESBLs菌株。在加强人和动物STEC感染检测与监测的同时,应进行细菌耐药性监测。     

非O157产志贺毒素大肠埃希菌分离株血清型鉴定及主要毒力基因分析

目的 了解中国不同来源非O157产志贺毒素大肠埃希菌分离株血清型及主要毒力基因的流行情况。方法 采用O抗原基因簇特异性聚合酶链反应（PCR）结合全套O抗血清凝聚法确定O血清群,以PCR扩增和测序fliC基因确定H型;采用PCR方法对所有菌株进行stx1、stx2、eae及ehxA基因检测。结果 434株非O157 STEC分离株中,除不可分型菌株外,共检测出82种O血清群和28种H型,其中O20:H30、O2:H32和O2:H45为优势血清型。stx1、stx2和stx1+stx2 3种志贺毒素基因型的检出率分别为25.35%、64.98%和9.68%,而eae和ehxA基因的阳性率分别为3.92%和32.95%。仅15株菌同时携带3种毒力基因,且主要为血清型O26:H11的腹泻患者分离株。结论 我国非O157 STEC分离株血清型复杂多样,同时检测eae和ehxA基因对于发现高致病潜力的菌株具有重要参考价值。     

产志贺毒素大肠埃希菌分离株多位点可变数目串联重复序列分析

目的 探讨多位点可变数目串联重复序列分析[multiple-locus VNTR (variable-number tandem repeats) analysis,MLVA]分型方法对产志贺毒素大肠埃希菌分离株的分型效果,初步了解菌株分子流行病学特征。 方法 采用7个VNTR位点对70株产志贺毒素大肠埃希菌分离株进行分析,并根据多态性位点的重复数目利用BioNumerics软件进行聚类分析。 结果 70株菌株被分为46种MLVA型别,O157与非O157菌株可分为A、B两个明显不同的群。除少部分菌株外,不同宿主来源、志贺毒素型别及血清型的非O157菌株与MLVA型别存在较好的相关性。 结论 7个VNTR位点的MLVA分型方案对于产志贺毒素大肠埃希菌的菌株分型、暴发溯源等具有一定的参考价值,但仍需进一步完善。     

双重实时荧光定量PCR检测产志贺毒素大肠埃希菌stx1和stx2基因

摘要：目的：建立一种检测产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)的双重实时荧光定量PCR法。 方法：根据stx1和stx2及其变种序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度和特异性评价,并对STEC模拟粪便标本及动物粪便标本进行检测分析。 结果：双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的灵敏度为1×10² copies/反应体系;该法对17种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对47株不同志贺毒素类型及变种的已知STEC菌株的检测特异性为100%;对模拟粪便标本的检测下限为3.55×10³ CFU/g;对动物粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养。 结论: 建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同志贺毒素类型及变种的STEC菌株的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本和动物粪便标本STEC感染的快速筛查。     

青藏高原牦牛携带屎肠球菌及其毒力基因和耐药性检测

目的 了解青藏高原牦牛携带屎肠球菌(Enterococcus faecium)情况,以及耐药性和毒力基因。方法 使用链球菌培养基分离细菌;使用生化反应和16s rDNA序列分析方法鉴定;采用PCR方法检测从牦牛粪便中分离的屎肠球菌携带细胞溶血素(cytolysin,cylA)、明胶酶E(gelatinase, gelE)、表面蛋白(enterococcal surface protein, esp)、胶质蛋白粘附素collagen-binding-adhesin of Enterococcal faecium,acm)、聚集物质(aggregation substance, asa1)及透明质酸酶(hyalronidase,hyl)6种毒力基因的情况;应用K-B纸片法对屎肠球菌分离株进行16种抗生素的敏感性分析;参照PulseNet 脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)实验方法对屎肠球菌分离株进行PFGE分型分析。结果 我们从320份牦牛粪便分离到33株屎肠球菌。这些菌株中毒力基因asa1的阳性率最高,为6.1%,acm和hyl次之,均为3.0%,其他毒力基因皆未检出。33株牦牛屎肠球菌中,有19株菌株具有抗生素耐药性,包括4株多重耐药菌株和15株单耐菌株。牦牛屎肠球菌对利福平耐药率最高,为48.5%;对其他抗生素的耐药率从高到低依次为青霉素G15.2%、四环素12.1%、强力霉素12.1%、红霉素9.1%、环丙沙星6.1%、氨苄西林6.1%、高浓度庆大霉素6.1%、磷霉素6.1%、左氧氟沙星6.1%。所有菌株对万古霉素、替拉考宁和氯霉素均敏感。细菌染色体DNA酶切片段的PFGE分析发现,33株屎肠球菌分离株共产生30种PFGE带型,可分为A-H 8个聚类群,耐药菌株分布在6个聚类群中。结论 青藏高原牦牛携带屎肠球菌,呈现高度遗传多态性,部分菌株携带毒力基因,对多种抗生素耐药。研究提示,屎肠球菌可能会通过牦牛相关食品传播。     

牦牛携带的产志贺毒素大肠杆菌分离株的多位点序列分型研究

目的 对牦牛携带的产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)进行多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)分析,了解菌株的遗传进化关系及致病潜力。方法 根据E. coli MLST数据库(http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Ecoli)提供的MLST方案,对青海玉树牦牛中分离的54株STEC分离株的7个管家基因进行PCR扩增并测序,通过序列比对确定其等位基因及菌株序列型(Sequence type,ST),并使用BioNumerics软件构建最小生成树(Minimum spanning tree,MST),分析牦牛ST型与HUSEC及人源主要流行血清群STEC菌株ST型间的进化关系。结果 54株牦牛STEC菌株呈现高度遗传多态性,可分为31个ST型别,其中包括7个新的等位基因型和17个新的ST型,并存在与HUSEC及主要流行血清群STEC亲缘关系相同或相近的ST型别。结论 青藏高原牦牛携带的STEC具有遗传多样性及一定的特异性,部分菌株具有对人致病的潜力。     

非O157产志贺毒素大肠杆菌分离培养方法研究进展

产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing escherichia coli,STEC)是一类危害人类健康的重要致病菌,可引起出血性肠炎(hemorrhagic colitis,HC)、溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)等严重疾病.1983年Riley等[1]报道了第一起由O157∶H7 STEC引起的食物中毒,之后不同国家相继报道了O157∶H7 STEC所致的暴发和散发感染.2001年,国际上即已提出了食品和动物饲料中O157 STEC菌株分离的标准方法(ISO 16654:2001)[2],得到普遍认可,类似方案被广泛应用于O157 STEC检测和监测工作中[3-4].由于非O157 STEC血清型复杂多样、菌株间差异较大,迄今还未能提出标准化的分离方案,非O157 STEC的感染和流行也可能因此一直被低估[5].     

非O157产志贺毒素大肠杆菌分离株的志贺毒素基因变种及黏附相关基因分析

目的 了解我国部分地区非O157产志贺毒素大肠杆菌分离株的志贺毒素基因变种及其黏附相关基因,为进一步研究致病机制提供依据。 方法 采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法对29株分离菌株的stx1、stx2基因全长扩增并测序,通过与GenBank中已公布的变种序列比对确定菌株stx1、stx2基因的变种类型。对位于LEE毒力岛上的eaeA、escF、escC、tir、espA、espB、espD基因及LEE以外其他黏附相关基因iha、toxB、efa1、sfpA、lpfAO157/OI-141、 lpfAO157/OI-154、saa、lpfAO113、eibG进行PCR检测。 结果 25株stx1阳性菌株中有13株携带stx1a原毒素,12株携带stx1c变种;10株stx2阳性菌株中,7株携带stx2d变种,1株为stx2a原毒素,1株携带stx2g变种,1株携带与stx2e A亚单位、stx2d B亚单位最接近的stx2变种。LEE岛上的7个基因检测结果均为阴性,黏附相关基因iha阳性率为89.7%(26/29),saa阳性菌株3株、eibG阳性菌株1株,其余6个黏附相关基因均为阴性。 结论 我国部分非O157 STEC菌株的志贺毒素基因以stx1c、stx2d变种为主,LEE毒力岛不存在,而黏附相关基因iha广泛存在于不同血清型的产志贺毒素大肠杆菌菌株中。     

多重PCR方法鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌

目的 建立一种快速检测和鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法。方法 根据六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的毒力基因eae、stx1、stx2、elt、estIa、estIb、aggR、ipaH、afaD及16S rRNA基因rrs建立多重PCR反应体系,优化引物浓度、PCR反应条件等,评价该方法的特异性和灵敏度,并用该方法鉴定本实验室保存的174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌,将结果与单重PCR、本实验室已建立的鉴定五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法结果进行对比。结果 10对PCR引物均可特异性扩增相应基因片段。该反应体系对174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌的鉴定结果与单重PCR检测结果一致,本研究的多重PCR检测下限可达4.56 101 CFU/反应(1.14 104 CFU/ml)。结论 本研究采用毒力基因及内参照基因建立的多重PCR方法可在一个反应体系中鉴定和区分致泻性大肠埃希菌和志贺菌,为临床快速检测、疾病预防控制实验室筛查、腹泻的暴发溯源等提供了方便快捷的技术支持。     

长治地区腹泻患者致泻性大肠杆菌的检测与分析

目的 了解山西省长治地区感染性腹泻患者致泻性大肠杆菌分离情况及菌株特征。方法 收集腹泻患者粪便,EC肉汤增菌后,采用针对致泻性大肠杆菌7个毒力基因eaeA、aggR、ipaH、stx1、stx2、lt、stIb及16S rRNA基因rrs的多重PCR初筛后,阳性者作致泻性大肠杆菌分离,再对分离菌株行生化鉴定、毒力基因检测及血清群测定。结果 170份标本中分离到致泻性大肠杆菌20株,阳性率为12%。其中EPEC 11株,均为非典型EPEC,EAEC 7株,ETEC 2株。结论 长治地区致泻性大肠杆菌感染以5岁以下儿童为主,除EPEC外,EAEC占有很大比例;对致泻性大肠杆菌的检测及判断有赖于血清群与毒力基因检测的分子生物学方法相结合。