人源抗TLR4抗体IgG的制备及其中和特性分析

目的:构建全人源抗人Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)抗体轻?重链表达载体,在293Free style 细胞中表达并纯化,分析该重组全分子抗体的生物学活性?方法:设计引物扩增全人源抗人TLR4抗体可变区编码序列,将其分别克隆到真核表达载体pFUSE-CHIg-hG1和pFUSE-CLIg-hl中,共转染至293Free style 细胞,表达产物用protein A亲和层析柱纯化?应用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)?Western blot?免疫共沉淀?质谱分析及蛋白芯片检测抗体的免疫学特性,并检测该抗体对人单核细胞淋巴瘤THP1细胞肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α表达的影响?结果:成功构建全人源抗人TLR4抗体真核表达载体,获得的全分子抗TLR4抗体保持了与抗原的结合活性,对THP-1细胞TNF-α表达的抑制率可达85.7%?结论:重组全人源抗TLR4 IgG保持了与TLR4的结合特异性,并具有明显的中和作用,对炎症治疗具有潜在的应用价值?     

炭疽杆菌致死因子LF253的制备及活性分析

目的 :制备具有生物学活性的重组致死因子253(lethal factor 253,LF253)抗原,获得纯化的目的蛋白,检测其与全分子致死因子(lethal focfor,LF)蛋白竞争性结合保护性抗原(protective antigen,PA)的能力。方法:PCR扩增致死因子LF253片段的DNA,将目的基因插入p ET-28a(+)表达载体中,利用大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌,IPTG诱导重组蛋白表达,通过His标签亲和层析柱获得目的蛋白,Western blot和ELISA法检测蛋白抗原性,Biacore T-100测定重组蛋白与保护性抗原PA结合的亲和力,细胞毒性实验检测其生物学活性。结果:成功构建原核表达载体p ET-28a/LF253,诱导获得重组蛋白s LF253的表达。Western blot和ELISA检测结果证实,该重组蛋白具有良好抗原特异性;细胞毒实验结果表明,重组蛋白可在体内外中和致死毒素引起的生物学效应。结论:本研究制备的融合蛋白s LF253能够与保护性抗原PA结合,可竞争性抑制LF全分子蛋白与PA的聚合,阻断炭疽毒素的致死作用,为今后炭疽疫苗等药物的研发奠定了基础。     

全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定

目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性?方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库?以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性?结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0 × 107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv?经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体?经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg?结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础?     

抗炭疽毒素保护性抗原单克隆抗体的制备及功能分析

目的:原核表达炭疽杆菌保护性抗原PA10蛋白,制备单克隆抗体,并进行功能分析?方法:人工合成炭疽杆菌保护性抗原PA10编码基因并克隆入pUC57载体,酶切鉴定后,将PA10编码基因插入原核表达载体pColdⅡ中,测序验证正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG和低温条件下诱导蛋白表达,SDS-PAGE验证产物;用HiTrap IMAC HP柱纯化重组蛋白,Western blot进一步验证?以纯化获得PA10重组蛋白为抗原,常规程序免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,并检测所制备抗体的中和活性?结果:获得的PA10重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,最终获得了4株特异性的单克隆抗体(分别命名为2G8?5A8?7B3? 9C9)?经体外炭疽毒素保护试验证实,其中1株单抗(7B3)具有较强的中和活性,其保护率可高达96%?结论:本文成功构建并表达炭疽杆菌保护性抗原PA10,制备了具有中和活性的抗PA单克隆抗体,为构建人源化的抗PA中和抗体奠定基础,从而有望用于炭疽病的治疗?     

人源抗TROP2全分子抗体IgG的真核表达及对胰腺癌细胞增殖的抑制作用

目的:以人源抗TROP2抗体Fab基因为模板,构建人源抗TROP2全分子抗体IgG真核表达系统,观察人源抗TROP2全分子抗体IgG对胰腺癌细胞增殖的抑制作用?方法:分别扩增抗TROP2抗体的重链和轻链基因,构建人源抗TROP2全分子抗体IgG的重组表达载体pWS-anti-TROP2,转染CHO dhfr-细胞,加MTX筛选抗体表达量高的单克隆株,Protein G 亲和柱纯化,获得人源抗TROP2全分子抗体IgG?SDS-PAGE?Western blot?ELISA?免疫荧光和流式细胞术等方法鉴定人源抗TROP2全分子抗体IgG并分析其免疫学活性?MTT法分析人源抗TROP2全分子抗体IgG对胰腺癌细胞BxPC-3的增殖抑制作用?结果:成功构建了人源抗TROP2全分子抗体IgG的真核表达系统,表达并纯化人源抗TROP2全分子抗体IgG?经鉴定,抗体的轻链与重链大小与预期一致,可与TROP2蛋白特异性结合,效价可达1∶6 400?MTT检测结果表明,人源抗TROP2全分子抗体IgG对胰腺癌BxPC3细胞的增殖有明显的抑制作用,且呈时效?量效依赖关系?结论:本研究成功构建了人源抗TROP2全分子抗体IgG的真核表达系统,并证明此抗体可特异性识别胰腺癌细胞表面的TROP2蛋白,且对胰腺癌细胞的增殖有明显的抑制作用?     

EBV编码潜伏膜蛋白2A抗原表位的串联表达及其免疫原性分析

目的:制备具有免疫原性的EB病毒潜伏膜蛋白2A (latent membrane protein 2A,LMP2A)的表位串联蛋白并分析其免疫学特性?方法:用DNAstar软件分析LMP2A的抗原表位,将预测的免疫原性较强的两个表位通过基因合成串联在一起,克隆到原核表达载体pET28a中,经大肠杆菌BL21表达并纯化?制备的含LMP2A表位重组蛋白经SDS-PAGE?Western blot鉴定后,免疫小鼠制备多克隆抗体,以ELISA检测抗体的效价,免疫组织化学法检测该抗体对天然LMP2A的特异性?结果:通过原核表达与纯化,获得高纯度的表位融合蛋白,经小鼠免疫并制备效价高且特异性的小鼠抗LMP2A的多克隆抗体,该抗体可用于ELISA和免疫组织化学分析?结论:本研究制备的表位融合蛋白,具有天然抗原的免疫原性,可制备能特异性识别天然LMP2A分子的多克隆抗体,为利用表位融合蛋白筛选全人源基因工程抗体奠定了基础?     

人源特异性抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体的制备及鉴定

目的:利用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)调节亚基(R亚基)的二聚体化功能结构域(DDD)的二聚化功能,制备具有中和活性的人源特异性抗狂犬病毒二价抗体?方法:优化合成linker-C-DDD序列,设计引物扩增抗狂犬病毒抗体Fab094的Fd段和轻链可变区序列(Vκ),通过overlap PCR将Fab094的Fd段和linker-C-DDD基因重组为Fd-DDD,将其和Vκ分别克隆到真核表达载体中,共转染293Free style细胞,表达纯化该抗体?应用SDS-PAGE?Western blot?ELISA?免疫共沉淀?亲和力测定及免疫荧光试验检测该抗体的免疫学特性,用荧光抗体病毒中和试验检测其中和活性?结果:成功构建了全人源抗狂犬病毒二价抗体Fab094-DDD的真核表达载体,获得的二价Fab094-DDD抗体与抗原保持着较好的亲和力,能特异性结合狂犬病毒,中和效价为213.2 U/mg?结论:成功制备了抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体,具有较高的中和活性,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础,对于其他疾病双表位人源特异性抗体的制备也具有借鉴作用?     

狂犬病病毒糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫学特性分析

目的:利用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统对狂犬病病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein,RVG)基因进行克隆?表达?纯化,并对重组 RVG 进行免疫学特性鉴定?方法:参照 GenBank 收录的狂犬病病毒 CVS-11 株RVG基因序列,设计特异性引物,扩增目的基因?RVG 基因经BamHⅠ/KpnⅠ 双酶切后定向克隆到 pFastBac-GP67B 载体上,阳性重组转座质粒进一步转化E.Coli DH10Bac 感受态细胞,经蓝白斑筛选及 PCR 鉴定后获得重组穿梭载体 rBacmid-RVG,将其转染至对数生长期的Sf-9昆虫细胞,进行重组RVG的真核表达?His-TrapHP 纯化目的蛋白,SDS-PAGE 和 Western blot 进行鉴定?重组RVG免疫小鼠,检测其免疫原性和血清中和活性?结果:用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统表达并纯化了重组RVG,分子量约58 000?经重组RVG免疫后的小鼠血清具有中和活性?结论:重组RVG具有天然RVG的活性,为进一步研制亚单位疫苗及制备筛选中和抗体奠定了基础?     

抗EB病毒LMP2A单克隆抗体的制备及免疫学特性分析

目的:利用杂交瘤技术制备抗EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)单克隆抗体并分析其免疫学特性?方法:以LMP第2和第5胞外区表位串联制备的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,制备抗LMP2A的单克隆抗体?通过ELISA?Western blot?免疫荧光?免疫组化?流式细胞术等方法鉴定单抗的免疫学特性?结果:获得1株稳定并持续分泌抗LMP2A单克隆抗体的稳定杂交瘤细胞株,所分泌的单克隆抗体5C12-C4-A6 能够特异性识别鼻咽癌细胞膜表面的LMP2A蛋白?结论:本文制备了能够特异性识别鼻咽癌细胞膜表面LMP2A蛋白的单克隆抗体,为进一步进行鼻咽癌临床早期诊断和分子靶向治疗奠定了基础?     

重组豹蛙酶的制备及其生物学特性分析

目的:通过构建豹蛙酶原核表达载体pColdⅡ－Rap,表达?纯化豹蛙酶并研究其生物学活性?方法:合成豹蛙酶全基因序列,克隆于原核表达载体pColdⅡ中,鉴定正确后转化至大肠杆菌BL21,用SDS－PAGE和Western blot验证豹蛙酶的表达;大量表达重组豹蛙酶融合蛋白(Rap－His),通过MTT法分析Rap－His对乳腺癌细胞增殖的影响?结果:成功构建了pColdⅡ－Rap原核表达载体,经优化表达?纯化的条件,获得纯度较高的Rap－His;MTT法检测结果表明,该融合蛋白在320?160 μg/ml时对乳腺癌细胞MDA－MB－231增殖的抑制率在加药后4 d达到93.49%?结论:本研究制备的重组Rap－His融合蛋白能够抑制乳腺癌细胞MDA－MB－231增殖?这为进一步与肿瘤特异抗体偶联,构建肿瘤特异性靶向药物的研究奠定了基础?