茶叶中三萜及其苷类化学成分研究

目的研究山茶属植物茶Camellia sinensis的芽叶化学成分。方法利用硅胶柱色谱法、Sephadex LH-20凝胶柱色谱法、中压柱色谱法及半制备高效液相色谱等方法分离纯化,通过理化常数和NMR、MS波谱等方法鉴定化合物结构。结果从茶叶甲醇提取物中分离得到三萜及其苷类化合物9个,分别鉴定为21β-羟基坡模酸(1)、坡模酮酸(2)、坡模酸(3)、乌苏酸(4)、地榆皂苷II(5)、3β-[(α-L-arabinopyranosyl)oxy]-urs-12,19(20)-dien-28-oic acid(6)、齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(7)、3β-[(α-L-arabinopyranosyl)oxy]-urs-12,18-dien-28-oic acid(8)、20-epi-urs-12,18-dien-28-oic acid 3β-O-α-L-arabinopyranoside(9)。结论化合物1为新化合物,化合物2、3、5~9为首次从山茶属植物中分离得到。     

人源特异性抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体的制备及鉴定

目的:利用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)调节亚基(R亚基)的二聚体化功能结构域(DDD)的二聚化功能,制备具有中和活性的人源特异性抗狂犬病毒二价抗体?方法:优化合成linker-C-DDD序列,设计引物扩增抗狂犬病毒抗体Fab094的Fd段和轻链可变区序列(Vκ),通过overlap PCR将Fab094的Fd段和linker-C-DDD基因重组为Fd-DDD,将其和Vκ分别克隆到真核表达载体中,共转染293Free style细胞,表达纯化该抗体?应用SDS-PAGE?Western blot?ELISA?免疫共沉淀?亲和力测定及免疫荧光试验检测该抗体的免疫学特性,用荧光抗体病毒中和试验检测其中和活性?结果:成功构建了全人源抗狂犬病毒二价抗体Fab094-DDD的真核表达载体,获得的二价Fab094-DDD抗体与抗原保持着较好的亲和力,能特异性结合狂犬病毒,中和效价为213.2 U/mg?结论:成功制备了抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体,具有较高的中和活性,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础,对于其他疾病双表位人源特异性抗体的制备也具有借鉴作用?     

靶向Trop-2 CAR-T细胞的制备及其体外对卵巢癌细胞杀伤作用的研究

目的：制备靶向人滋养层细胞表面抗原2（human trophoblast cell surface antigen 2 , Trop-2)的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell , CAR-T）,观察Trop-2 CAR-T细胞在体外对卵巢癌细胞增殖的影响。方法：运用分子克隆及基因重组技术构建Trop-2 CAR;采用Western blot检测Trop-2 CAR在293T细胞中的表达;CCK-8法检测Trop-2 CAR-T细胞对卵巢癌细胞增殖的影响;ELISA检测细胞因子分泌的变化。结果：酶切鉴定及测序分析结果表明,Trop-2 CAR各基因片段连接正确;Western blot检测结果显示,该质粒能够在293T细胞中有效表达;CCK-8结果显示,制备的Trop-2 CAR-T细胞在体外能明显抑制表达Trop-2的卵巢癌细胞的增殖（P＜0.05）;ELISA检测结果表明Trop-2 CAR-T细胞与表达Trop-2的卵巢癌细胞共培养后,干扰素（interferon-γ,IFN-γ)、白介素（interleukin-2,IL-2)细胞因子分泌增加（P＜0.01）。结论：该研究成功制备了Trop-2 CAR-T细胞,可有效抑制Trop-2表达阳性的卵巢癌细胞的增殖。     

植物药瓜子金抗抑郁活性部位初步研究

目的探讨远志属药用植物瓜子金提取物及不同部位的抗抑郁作用。方法瓜子金用常规醇提法得瓜子金醇提物,通过系统溶剂法得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水残留部位。采用小鼠强迫游泳、悬尾模型评价瓜子金醇提物及各萃取部位的抗抑郁作用。结果瓜子金醇提物及正丁醇部位能明显缩短小鼠强迫游泳及悬尾的不动时间。结论瓜子金醇提物及正丁醇部位可以改善小鼠的抑郁状态行为,具有一定的抗抑郁作用。     

人源全分子抗c-Met 抗体的制备及对鼻咽癌细胞生物学特性的影响

目的:利用基因工程技术制备全分子人源抗 c-Met抗体,分析该抗体免疫学特性,并观察该全分子抗体对鼻咽癌细胞增殖?迁移和侵袭的影响?方法:设计引物扩增抗c-Met Fab抗体的重轻链可变区序列,将其分别克隆到真核表达载体pFUSE-CHIg-hG1 和 pFUSE-CLIg-hκ 中?转染真核细胞,表达产物用Protein A柱纯化?通过ELISA?Western blot和免疫荧光等方法鉴定该抗体的免疫学特性?CCK-8检测抗体对人鼻咽癌细胞增殖的抑制作用,划痕实验?Transwell侵袭实验分析抗体对人鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响?结果:成功重组全分子人源抗c-Met 抗体的表达载体,获得的全分子抗体保留了与抗原的特异性结合活性?CCK-8实验中结果显示全分子抗体能抑制c-Met阳性鼻咽癌细胞CNE2和HONE1的增殖?细胞划痕和Transwell侵袭实验结果显示全分子抗体能抑制c-Met阳性细胞CNE2和HONE1的迁移和侵袭能力?结论:本研究成功制备人源全分子抗c-Met抗体,该抗体有明显的中和活性,为探索鼻咽癌分子靶向治疗奠定了基础?     

人源抗H7N9血凝素中和抗体IgG的制备及鉴定

目的:将从全人源Fab噬菌体抗体库筛选获得的抗H7N9血凝素Fab抗体基因进行基因工程改造,以表达全分子抗H7N9血凝素中和抗体IgG,并验证其对H7N9型禽流感病毒的中和活性?方法:用H7N9型禽流感病毒血凝素筛选全人源Fab噬菌体抗体库,构建全分子IgG抗体重?轻链表达载体,共转染293 FreeStyle(293F)细胞,表达并纯化IgG抗体?应用ELISA及Western blot实验检测抗体免疫学活性,微量中和实验及鸡胚预防保护实验检测其中和活性,血凝抑制试验判断其结合血凝素亚基?结果:成功筛选出1株全人源抗H7N9血凝素Fab抗体基因并构建IgG真核表达载体?获得的全分子IgG抗体重?轻链序列正确,并可特异性结合H7N9血凝素?微量中和实验证明其对H7N9型禽流感病毒有良好中和活性,中和滴度为15.6 μg/mL?鸡胚预防保护实验显示抗体用量为200 μg时可达100%保护率?血凝抑制试验表明其结合血凝素HA2亚基?结论:制备的重组全人源全分子抗H7N9血凝素IgG抗体可特异性识别H7N9型禽流感病毒血凝素,对H7N9型禽流病毒有显著的中和作用,为进一步研发用于禽流感防治的抗体药物奠定基础?     

靶向c-Met嵌合抗原受体T细胞的制备及其对鼻咽癌细胞作用的研究

目的 构建靶向c-Met的嵌合抗原受体(CAR)逆转录病毒载体,制备靶向c-Met CAR-T,观察其对c-Met阳性鼻咽癌细胞的杀伤作用。 方法 利用基因工程技术构建抗c-Met scFv,并将其重组到含有CD28,CD137,CD3ζ等的逆转录病毒载体中,形成c-Met CAR逆转录病毒载体,测序确认。以该病毒载体感染T淋巴细胞,通过Western blotting检测c-MetCAR在T淋巴细胞中的表达。CCK-8检测c-Met CAR-T对鼻咽癌细胞的作用;通过ELISA检测c-Met CAR-T作用后IFN-γ、IL-2的变化。 结果 测序结果显示c-Met CAR病毒载体序列正确;Western blotting可检测到CD3ζ的表达;CCK-8结果显示,c-Met CAR-T明显抑制c-Met阳性的鼻咽癌细胞的增殖(P<0.05);ELISA结果显示,c-Met CAR-T作用后分泌IFN-γ、IL-2明显增加(P<0.01)。 结论 成功制备了靶向c-Met的嵌合抗原受体逆转录病毒载体。该嵌合抗原受体能在T细胞中表达,能有效抑制c-Met阳性鼻咽癌细胞增殖,增加IFN-γ、IL-2的分泌。     

D-半乳糖诱导的衰老大鼠心脏S100A8/A9及相关炎症通路基因表达的研究

目的：探讨D-半乳糖（D-Gal）诱导的衰老大鼠模型心脏差异基因表达的变化，并对其中S100钙结合蛋白A8/A9(S100A8/A9)及其下游p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/核因子κB(NF-κB)通路关键因子进行验证。方法：（1）将8～10周龄SD大鼠随机分为正常对照（control）组和D-Gal组，每组6只。D-Gal组大鼠每天颈背部皮下注射D-Gal(150 mg/kg),control组大鼠注射相同体积的生理盐水。Morris水迷宫检测学习记忆能力；测定血清超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和丙二醛（MDA）水平；超声心动图测定心功能变化；进行心脏HE、Masson、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）和二氢乙啶染色，并用透射电镜观察线粒体超微结构。转录组测序分析大鼠心脏基因表达差异，qRT-PCR和Western blot检测大鼠心肌组织衰老标志基因、S100A8/A9、p38 MAPK和NF-κB通路相关因子的mRNA和蛋白表达。（2）利用D-Gal(10 g/L)诱导建立H9C2心肌细胞衰老模型，并用S100A8/A9抑制剂帕奎莫德（paquin...