人源全分子抗c-Met 抗体的制备及对鼻咽癌细胞生物学特性的影响

目的:利用基因工程技术制备全分子人源抗 c-Met抗体,分析该抗体免疫学特性,并观察该全分子抗体对鼻咽癌细胞增殖?迁移和侵袭的影响?方法:设计引物扩增抗c-Met Fab抗体的重轻链可变区序列,将其分别克隆到真核表达载体pFUSE-CHIg-hG1 和 pFUSE-CLIg-hκ 中?转染真核细胞,表达产物用Protein A柱纯化?通过ELISA?Western blot和免疫荧光等方法鉴定该抗体的免疫学特性?CCK-8检测抗体对人鼻咽癌细胞增殖的抑制作用,划痕实验?Transwell侵袭实验分析抗体对人鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响?结果:成功重组全分子人源抗c-Met 抗体的表达载体,获得的全分子抗体保留了与抗原的特异性结合活性?CCK-8实验中结果显示全分子抗体能抑制c-Met阳性鼻咽癌细胞CNE2和HONE1的增殖?细胞划痕和Transwell侵袭实验结果显示全分子抗体能抑制c-Met阳性细胞CNE2和HONE1的迁移和侵袭能力?结论:本研究成功制备人源全分子抗c-Met抗体,该抗体有明显的中和活性,为探索鼻咽癌分子靶向治疗奠定了基础?     

人源抗TLR4抗体IgG的制备及其中和特性分析

目的:构建全人源抗人Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)抗体轻?重链表达载体,在293Free style 细胞中表达并纯化,分析该重组全分子抗体的生物学活性?方法:设计引物扩增全人源抗人TLR4抗体可变区编码序列,将其分别克隆到真核表达载体pFUSE-CHIg-hG1和pFUSE-CLIg-hl中,共转染至293Free style 细胞,表达产物用protein A亲和层析柱纯化?应用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)?Western blot?免疫共沉淀?质谱分析及蛋白芯片检测抗体的免疫学特性,并检测该抗体对人单核细胞淋巴瘤THP1细胞肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α表达的影响?结果:成功构建全人源抗人TLR4抗体真核表达载体,获得的全分子抗TLR4抗体保持了与抗原的结合活性,对THP-1细胞TNF-α表达的抑制率可达85.7%?结论:重组全人源抗TLR4 IgG保持了与TLR4的结合特异性,并具有明显的中和作用,对炎症治疗具有潜在的应用价值?     

人源抗H7N9血凝素中和抗体IgG的制备及鉴定

目的:将从全人源Fab噬菌体抗体库筛选获得的抗H7N9血凝素Fab抗体基因进行基因工程改造,以表达全分子抗H7N9血凝素中和抗体IgG,并验证其对H7N9型禽流感病毒的中和活性?方法:用H7N9型禽流感病毒血凝素筛选全人源Fab噬菌体抗体库,构建全分子IgG抗体重?轻链表达载体,共转染293 FreeStyle(293F)细胞,表达并纯化IgG抗体?应用ELISA及Western blot实验检测抗体免疫学活性,微量中和实验及鸡胚预防保护实验检测其中和活性,血凝抑制试验判断其结合血凝素亚基?结果:成功筛选出1株全人源抗H7N9血凝素Fab抗体基因并构建IgG真核表达载体?获得的全分子IgG抗体重?轻链序列正确,并可特异性结合H7N9血凝素?微量中和实验证明其对H7N9型禽流感病毒有良好中和活性,中和滴度为15.6 μg/mL?鸡胚预防保护实验显示抗体用量为200 μg时可达100%保护率?血凝抑制试验表明其结合血凝素HA2亚基?结论:制备的重组全人源全分子抗H7N9血凝素IgG抗体可特异性识别H7N9型禽流感病毒血凝素,对H7N9型禽流病毒有显著的中和作用,为进一步研发用于禽流感防治的抗体药物奠定基础?     

全人源抗Trop-2 IgG的制备及对卵巢癌细胞生物特性的影响

目的:构建全人源抗人滋养层细胞表面抗原2(human trophoblast cell surface antigen 2,Trop-2)抗体 IgG真核表达系统,表达并纯化该抗体,并检测其对卵巢癌细胞生物特性的影响?方法:构建全人源抗Trop-2抗体IgG的重组表达载体;在293FreeStyle(293F)真核表达体系中表达并纯化该抗体?使用SDS-PAGE?ELISA?亲和力测定?免疫荧光等方法鉴定该抗体并分析其免疫学活性;使用cell counting kit-8(CCK-8)法?划痕实验?Transwell实验和细胞凋亡实验分析其对卵巢癌细胞特性的影响?结果:成功制备出全人源抗Trop-2 IgG;经多种方法检测,该抗体能与Trop-2蛋白特异性结合;对表达Trop-2的卵巢癌细胞增殖?侵袭?迁移和凋亡有明显影响?当抗体浓度为400 μg/mL时,卵巢癌细胞HO8910的生存率仅为55.95%(P < 0.01),划痕愈合率仅为24.71%(对照组为70.80%,P < 0.01),侵袭细胞数是对照组的32.11%(P < 0.05),细胞凋亡率是对照组的2倍(P < 0.05)?结论:全人源抗Trop-2 IgG可特异性识别卵巢癌细胞表面的Trop-2 蛋白,对卵巢癌细胞的恶性行为具有明显的抑制作用?因此,全人源抗Trop-2 IgG在卵巢癌的靶向治疗中有潜在应用价值?     

哺乳动物细胞表面展示全长类风湿关节炎抗体库的构建

目的采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源类风湿关节炎抗体库。方法分离类风湿关节炎患者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增抗体全长轻链基因和重链可变区基因,分别插入哺乳动物细胞表达载体pDGB-HC-TM,电击转化感受态大肠杆菌TOPO-10,分别构建抗体轻链基因库和抗体重链基因库,然后将抗体轻链、重链基因库联合转染293T细胞,用流式细胞仪分析全长人源抗体在293T细胞表面的表达。结果成功构建了类风湿关节炎患者来源的IgG1-Kappa型抗体基因库,随机挑选单克隆经DNA序列分析显示轻链库、重链库的序列正确率分别为80%和60%,可表达的抗体库多样性为6.13×1010。结论类风湿关节炎抗体基因库转染293T细胞后能够在细胞表面表达全长人源抗体,所展示的抗体库具有良好的多样性,能够为下一步筛选特异性抗体奠定基础。     

鼠-人嵌合抗粘蛋白1 IgG1全抗体的构建及其功能初步分析

目的获得鼠-人嵌合抗粘蛋白1(mucin1,MUC1)IgG全抗体,降低鼠源抗MUC1单克隆抗体(monoclonalantibody,mAb)的异种免疫原性,并在哺乳动物细胞中表达制备,初步分析其特性。方法 PCR扩增鼠mAb-6E3可变区编码基因,通过特异性限制性酶切位点克隆入含有人源IgG1抗体恒定区的哺乳动物细胞重组表达载体,获得IgG全抗体表达质粒,瞬时转染293T哺乳动物细胞,直接免疫荧光法确定细胞内人源IgG抗体表达,收获转染细胞培养上清,经亲和层析纯化后,经SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot、流式细胞仪检测和表面等离子共振技术等分析所制备IgG抗体分子特点及其与MUC1抗原的结合活性及动力学参数。结果所构建鼠-人嵌合IgG表达质粒能够在哺乳动物细胞中有效表达并分泌到细胞上清,纯化后蛋白质电泳分析与预期IgG抗体分子大小一致,能够与变性或天然状态下的T47D肿瘤细胞表面MUC1特异性结合,经表面等离子共振技术分析表明抗体的亲和力约为KD=2.8×10-7M。结论获得鼠-人嵌合抗MUC1 IgG抗体,具有与MUC1特异性结合的生物学活性。     

人源性抗-D基因工程抗体在真核细胞CHO中的表达

目的于真核细胞系CHO细胞中表达人源性抗-D基因工程抗体,为人源性抗-D基因工程抗体在临床上的应用打下坚实的基础。方法脂质体法将真核表达载体pAH4604/VH和pAG4622/VL共转染体外培养的CHO细胞,经霉酚酸及组氨醇筛选阳性克隆细胞。通过ELISA法检测培养上清中人IgG的表达量。应用化学发光WesternBlotting法对真核表达载体pAH4604/VH和pAG4622/VL在CHO细胞中的表达进行鉴定。结果pAH4604/VH和pAG4622/VL共转染体外培养的CHO细胞,经霉酚酸及组氨醇筛选12～14d后有阳性克隆长出,未转染细胞则全部死亡。筛选出的各阳性细胞克隆经扩大培养及ELISA定量检测其上清人IgG含量最高为4.05ng/ml。WesternBlotting显示上清和细胞内均有人IgG重链和轻链的表达。结论所构建的真核表达载体pAH4604/VH和pAG4622/VL在CHO真核细胞系表达成功,可产生人源化的IgG重链和轻链。     

抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建及瞬时表达

目的构建及瞬时表达抗人CD28鼠-人嵌合抗体。方法采用基因工程技术,从分泌鼠抗人CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株（克隆号：2F5）中克隆出抗体重链和轻链可变区基因及相应信号肽编码序列。分别与人免疫球蛋白IgG1恒定区重、轻链基因拼接,构建含有重组基因的pIRES表达质粒pIRES/h2F5。转染293T细胞并用抗性药物G418选择培养。采用流式细胞术,检测瞬时转染细胞后嵌合抗体的表达情况。结果抗人CD28鼠人嵌合抗体得到表达并能与CD28分子特异性结合。结论抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建和瞬时表达是成功的,为后续构建稳定分泌抗人CD28鼠-人嵌合抗体的CHO基因转染细胞株奠定了基础。     

人源特异性抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体的制备及鉴定

目的:利用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)调节亚基(R亚基)的二聚体化功能结构域(DDD)的二聚化功能,制备具有中和活性的人源特异性抗狂犬病毒二价抗体?方法:优化合成linker-C-DDD序列,设计引物扩增抗狂犬病毒抗体Fab094的Fd段和轻链可变区序列(Vκ),通过overlap PCR将Fab094的Fd段和linker-C-DDD基因重组为Fd-DDD,将其和Vκ分别克隆到真核表达载体中,共转染293Free style细胞,表达纯化该抗体?应用SDS-PAGE?Western blot?ELISA?免疫共沉淀?亲和力测定及免疫荧光试验检测该抗体的免疫学特性,用荧光抗体病毒中和试验检测其中和活性?结果:成功构建了全人源抗狂犬病毒二价抗体Fab094-DDD的真核表达载体,获得的二价Fab094-DDD抗体与抗原保持着较好的亲和力,能特异性结合狂犬病毒,中和效价为213.2 U/mg?结论:成功制备了抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体,具有较高的中和活性,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础,对于其他疾病双表位人源特异性抗体的制备也具有借鉴作用?     

人源抗c⁃Met抗体与rAGAP偶联物对卵巢癌细胞生物学特性的影响

目的：制备人源抗c?Met的全分子抗体（c?Met?IgG1）及其与重组东亚钳蝎镇痛抗肿瘤多肽（recombinant analgesic?antitumor peptide,rAGAP）偶联的新型抗体（c?Met?IgG1?rAGAP）,分析它们的生物学特性,检测其对卵巢癌细胞生物学行为的影响。方法：以本实验室保存的人源抗c?Met抗体基因为模板,构建c?Met?IgG1?rAGAP真核表达载体并转染真核细胞,表达并纯化抗体偶联物。通过亲和力检测、免疫荧光、流式细胞术等方法,评估c?Met? IgG1和c?Met?IgG1?rAGAP的生物学特性。通过CCK?8、划痕实验、Transwell侵袭实验检测抗体对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果：成功制备出能够与c?Met蛋白特异性结合的c?Met?IgG1和c?Met?IgG1?rAGAP两种抗体;一系列实验证明了c?Met?IgG1和c?Met?IgG1?rAGAP均可抑制c?Met阳性的卵巢癌细胞HO8910的增殖、迁移、侵袭,且c?Met?IgG1?rAGAP对卵巢癌细胞的抑制作用要强于c?Met?IgG1,而在c?Met阴性的IOSE386细胞中并未观察到这些作用。结论：研究结果表明c?Met?IgG1?rAGAP可靶向作用于c?Met阳性的卵巢癌细胞并具有抗肿瘤活性,可为探索卵巢癌的分子靶向治疗奠定研究基础。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

87株幽门螺旋杆菌VacA等位基因的分析

目的以研究方法LiPA（Line Probe Assay）分析VacA等位基因的表达,了解幽门螺旋杆菌致病机理的理解。方法从三个不同城市87位进行胃镜检查患者的胃粘膜中培养出幽门螺旋杆菌,提取DNA,用LiPA方法分析VacA等位基因。结果（1）87位患者以sic（88．5％）和m2a（63．2％）分布为主,未发现s1b和s2;（2）混合菌株感染率为41．4％,远远高于西方国家,其中上海的混合感染率最高（62．5％）,与北京（41．0％）和南宁（20．8％）相比具有显著性差异,P〈0．01;（3）北京、海、南京三个不同城市s1、m等位基因亚型分布率存在差异;（4）溃疡病和非溃疡病患者m1和m2的分布率没有显著性差异。结论我国幽门螺旋杆菌多重菌株感染率较高,不同的m基因型与消化性溃疡的发生无显著性相关。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

浅谈影响放疗摆位精度的相关因素

本文旨以经验交流的方式,阐述影响放疗摆位精度的各种相关因素,以最大努力去消除或减少放疗摆位误差,提高放疗摆位的精度,同时达到与放疗界其他同行的共勉的愿望。     

阴道炎1236例病原检查分析

对１２３６例阴道炎患者的阴道分泌物作直接镜检和病原菌分离培养检查；结果，细菌感染９００例，念珠菌２３４例，滴虫１０２例。９００例细菌经鉴定；葡萄球菌３００例，阴道加特纳菌２７６例，淋病奈瑟菌１７０例，其它细菌１２４例。结果表明，葡萄球菌，阴道加特纳菌，淋病奈瑟菌是细菌性阴道炎最常见的致病菌。     

喉癌主癌灶手术切缘的临床特点分析

目的探讨研究喉癌主癌灶手术的安全切缘在临床上的特点。方法回顾性分析2007年6月—2011年3月已经确诊喉癌的患者100例,随机分成A、B两组,A组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取镜下观察分析;B组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取肉眼观察分析,将结果进行临床特点分析比较。结果早期的喉癌患者和晚期的喉癌患者的阳性切缘例数,差异无统计学意义（P〉0.05）;晚期的阳性切缘发生次数高于早期的阳性切缘发生次数,差异有统计学意义（P〈0.05）。声门上区[SG]2、3和5、10mm;跨声门型[TG]2、3mm和5、10mm的切缘对比,差异有统计学意义（P〈0.05）。SG、G、TG、IG的2mm和3mm,5mm和10mm对,差异无统计学意义（P〉0.05）。肉眼阳性切缘观察39个,镜下阳性切缘观察43,两者差异无统计学意义（P〉0.05）。结论依据原发不同部位、不同分期和不同范围选取适合的切线,就可以有效地减少阳性切缘的发生。     

碱量法测定壳多糖脱乙酰度的方法探讨

目的：评价壳多糖脱乙酰度测定的减量法的影响因素。方法：通过实验评价碱量法的精准度及样本含潮量等因素对测定结果的影响,并对汪氏推荐计算公式和本文作者提出的改良公式作出评价。结果：碱量法测定壳多糖脱乙酰度受样本性状、含潮率、反应体系中酸量的影响。改良公式更能反映样本实际脱乙酰度。结论：碱量法简便易行,评价指标在可接受范围,可用于壳多糖研制中的质量评价。     

上颌骨牙源性囊肿刮除手术的疗效观察

目的探讨对上颌骨牙源性囊肿患者进行囊肿彻底刮除手术的临床疗效。方法对我科在2010年1月～2017年9月收治的73例上颌骨牙源性囊肿患者行囊肿彻底刮除手术治疗,对患者术区肿胀消退、术后伤口感染、伤口愈合、牙龈再附着、术后复发、骨质改建、骨质修复等情况随访观察。结果 73例患者术后肿胀消退时间为1～4 d。73例患者术后均未发生伤口感染,伤口均一期愈合。所有患者牙龈再附着情况好,术后均未见复发。术后未见并发症。骨质改建效果好,骨质修复的效果因影像学资料过少,缺乏客观依据,暂不下有效结论。结论对上颌骨牙源性囊肿患者进行囊肿彻底刮除手术,术后患者的恢复情况良好,值得在临床治疗上进行推广。     

儿童腹痛328例病因诊断及分析

目的：根据儿童急性腹痛的特点，诊断儿童腹痛应综合临床及相关检查提供的依据，做出准确诊断，给予适当治疗。方法：对临床328例腹痛患儿进行选择性辅助检查和分析。结果：小儿腹痛病因复杂，腹腔内疾病占64．63％，共17种病因；腹腔外疾病占35．37％，共6种病因。结论：仔细询问病史、认真体格检查、密切观察病情、针对性地选择辅助检查，在儿童腹痛的诊断上具有重要的意义。     

扩张兔皮肤超微结构的变化

目的：动态观察扩张兔皮肤超微结构的变化。方法：选用2--3kg新西兰大白兔64只，分为2大组，快速扩张组和常规扩张组，每组32只，每大组再分为4组，为扩张完成后即时、1周、12周、24周组。每组8只，其中4只为实验组，另4只植入扩张器不扩张作为对照组。透射电子显微镜观察各组皮肤超微结构的变化。结果：表皮扩张后经历--由扩张刺激引起的创伤至完全修复的过程。扩张后即时真皮中成纤维细胞大量增生，功能由静止转向活跃，胶原纤维碎裂成片，弹力纤维部分断裂，炎症细胞浸润；扩张后1周常规扩张组基底膜连续性基本恢复。显示成纤维细胞合成功能活跃。扩张后12周、24周，成纤维细胞趋于稳定、形态狭长，部分胶原排列紊乱，部分有似癜痕样改变。结论：扩张刺激可致兔皮肤创伤。扩张后真皮不可完全修复。