ATRA诱导SP100蛋白表达及其对白血病NB4细胞增殖的影响

目的探讨SP100蛋白在全反式维甲酸(ATRA)作用NB4细胞过程中的表达及其对NB4细胞增殖和周期的影响。方法实时定量PCR检测SP100 mRNA的表达;Western blot检测SP100蛋白的表达;免疫荧光检测SP100的定位;CCK-8检测NB4细胞的增殖;流式细胞术检测NB4细胞的周期。结果 ATRA能明显促进NB4细胞中SP100mRNA水平和蛋白水平,并将SP100由弥散的小点状转变为较大的斑块状;感染SP100-shRNA的NB4细胞增殖活力明显高于未感染组和病毒空载组(P0.05),并使G2/M期的细胞增多。结论 ATRA促进NB4细胞中SP100蛋白的表达,SP100蛋白可能参与NB4细胞增殖活力的调节。     

订单定向医学生开设《临床基本技能》课程的思考

根据全球医学教育最基本要求,借鉴国内外医学生临床技能培养经验,结合订单定向医学生的未来岗位特点需求,具体分析重庆市订单定向医学生开设《临床基本技能》课程的背景、必要性、可行性。同时,提出保证课程教学质量的对策和建议,以促进课程的顺利开展。     

人K562细胞cDNA文库的扩增、纯化、鉴定和酵母细胞转化

目的:对预转化到大肠杆菌DH5 α中的人K562细胞cDNA文库进行扩增、纯化和鉴定并将文库质粒转化酵母细胞,为下一步的靶蛋白筛选做准备.方法:对K562细胞cDNA文库进行扩增,提取文库质粒,将文库质粒转化酵母Y187细胞,并用PCR和酶切鉴定转化结果.结果:成功的扩增人K562细胞cDNA文库、并验证了文库的多样性、将文库质粒成功转化酵母Y187细胞.结论:K562细胞cDNA文库的成功扩增、纯化、鉴定,为进一步的文库筛选奠定了基础.     

苦参碱诱导肺腺癌A549细胞凋亡及对人端粒酶逆转录酶表达的影响

目的观察苦参碱诱导肺腺癌A549细胞凋亡及对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达的影响。方法以终质量浓度为0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL的苦参碱作用肺腺癌A549细胞48 h后,通过台盼蓝拒染法计数细胞的生长抑制率;以终质量浓度为0.2 mg/mL的苦参碱作用A549细胞48、72、96 h后,经透射电镜和DNA Ladder实验了解到细胞凋亡的发生,PCR-TRAP法检测端粒酶活性,实时RT-PCR检测hTERT的mRNA表达水平。结果各种质量浓度的苦参碱作用A549细胞48 h后,均显著抑制细胞的增殖且呈浓度依赖性;0.2 mg/mL的苦参碱作用A549细胞不同时间后,经透射电镜形态学检测和DNA Ladder实验,均显示A549细胞发生了凋亡改变;0.2 mg/mL的苦参碱作用A549细胞48 h后,端粒酶活性明显受抑,hTERT mRNA表达显著降低。结论苦参碱能抑制肺腺癌A549细胞的生长并诱导其凋亡,其机制可能与下调hTERT基因表达,抑制端粒酶活性,破坏端粒稳定性有关。     

BPHL与PML-C间相互作用的胞内、外验证

目的 通过酵母双杂交实验及免疫共沉淀技术验证人联苯样水解酶(BPHL)与缺失核定位信号的人急性早幼粒细胞白血病(PML)基因的coiled-coil的结构域(PML-C)蛋白之间的相互作用。 方法 将表达PML-C诱饵蛋白及BPHL靶蛋白的重组质粒pGBKT7-PML-C及pACT2-BPHL共转化AH109酵母菌,通过酵母双杂交实验验证两者在活细胞内的相互作用。构建能在人胚肾293细胞中表达带HA标签的PML-C融合蛋白的重组载体pCMV-HA-PML-C,经酶切鉴定正确后,和表达带myc标签的BPHL融合蛋白的重组真核表达载体pCMV-myc-BPHL,共转染人胚肾293细胞,利用免疫共沉淀技术验证BPHL与PML-C间的相互作用。 结果 pGBKT7-PML-C及pACT2-BPHL质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆。构建的重组表达载体pCMV-HA-PML-C及pCMV-myc-BPHL经双酶切鉴定正确后共转染HEK293细胞,抗HA多克隆抗体沉淀HA-PML-C相互作用蛋白复合物后,用抗c-myc单克隆抗体进行Western blot检测,可以检测到myc-BPHL的表达蛋白。 结论 成功构建了pCMV-HA-PML-C及pCMV-myc-BPHL融合蛋白真核表达重组载体,利用酵母双杂交实验及免疫共沉淀技术证实BPHL与PML-C之间存在着相互作用。     

重组慢病毒LV5-NE的构建及NE促进NB4细胞增殖

目的构建重组慢病毒LV5-NE筛选纯NB4/LV5-NE细胞株,探讨中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)对人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4增殖的影响,为研究NE致白血病的可能机制奠定基础。方法以质粒p CMV-myc-NE为模板得到PCR产物NE,将NE基因连接到穿梭载体p GLV10/U6/GFP/Puro后酶切验证,将序列正确的质粒与包装质粒p Gag/Pol、pRev、p VSV-G共转染293T细胞。测定病毒滴度。实验分为空白组、LV5-NC组和LV5-NE组,病毒感染NB4细胞72 h后用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞。用Western blot检测NE在NB4细胞中的蛋白表达以及其切割作用;CCK-8法观察NB4细胞增殖能力;流式细胞术测定NB4细胞周期和凋亡;Western blot检测p Akt和Akt以及Bax和Bcl-2蛋白表达。结果成功构建表达NE的慢病毒LV5-NE,筛选得到纯NB4/LV5-NE细胞株,NE对NB4细胞的增殖有明显促进作用(P0.05)结论 NE在NB4细胞株中稳定表达后中可促进NB4细胞的增殖,其增殖作用可能通过激活PI3K/Akt通路调节。     

活细胞内筛选地塞米松衍生物作用靶蛋白的研究

背景与目的：地塞米松衍生物（9-氟-16α-甲基11β,17-二羟基-3-氧-1,4-雄二烯-17β-羧酸）具有优于地塞米松的抗肿瘤活性,为探讨其抗肿瘤机制,本研究利用酵母三杂交技术在活细胞内筛选与之相互作用的靶蛋白。方法：构建诱饵质粒pGBKT7-GRα-LBD,利用酵母三杂交技术从人K562细胞cDNA文库中筛选与地塞米松衍生物相互作用的靶蛋白。结果：诱饵质粒成功构建,经Western blot分析可表达约31ku的诱饵蛋白,且诱饵蛋白没有毒性、渗漏和自激活现象。利用酵母三杂交技术从人K562细胞cDNA文库中筛选到37个能与地塞米松衍生物相互作用的蛋白质,并经酵母回转实验验证,得到20个真阳性克隆。结论：通过酵母三杂交技术在活细胞内筛选到20个与地塞米松衍生物有相互作用的蛋白。     

人红白血病细胞株c-myc/N-ras/P_(53)mRNA的表达及其与细胞生物学特性的关系

本实验用一定浓度的苦参碱作用Ｋ５６２细胞１６ｈ, ２４ｈ,４８ｈ,采用分子生物学Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ和Ｄｏｔ Ｂｌｏｔ杂交技术分析ｃ－ｍｙｃ,Ｎ－ｒａｓ及Ｐ５３ ｍＲＮＡ在Ｋ５６２细胞诱导分化过程中表达水平改变,以探讨其表达水平与细胞生物学特性的关系。结果显示苦参碱作用Ｋ５６２细胞２４ｈ时,Ｎ－ｒａｓ基因ｍＲＮＡ表达活化;Ｐ５３－基因表达增强：作用４８ｈ时,ｃ－ｍｙｃ　ｍＲＮＡ水平表达明显受抑。说明苦参碱在诱导Ｋ５６２细胞分化启动时,能明显改变早期相关癌基因的表达。提示ｃ－ｍｙｃ,Ｎ－ｒａｓ和Ｐ５３等癌基因是一类重要的细胞增殖、分化调控因素。