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1.
目的利用Ad Easy系统构建携带人中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)基因的重组腺病毒表达质粒,并感染K562细胞,观察其对K562细胞增殖和凋亡的影响。方法以急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株HL-60的RNA为模板,经反转录PCR得到NE基因的编码区并克隆入穿梭载体p Ad Track-CMV,得到p Ad-NE,经HindⅢ、EcoRⅤ酶切鉴定和测序正确后,将其转化入p Ad Easy-1-BJ5183进行同源重组,得到重组子Ad-NE,经PacⅠ酶切线性化后转染AD293细胞进行包装。14 d之后收获原代病毒,经5轮扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。感染K562细胞后,荧光显微镜初步观察感染效率,同时用流式细胞术检测感染效率;Western blot法进一步鉴定NE是否表达上调;CCK-8法测定细胞增殖情况;流式细胞术测定细胞凋亡和细胞周期变化。结果酶切鉴定及测序结果表明重组穿梭质粒p Ad-NE构建成功;酶切鉴定显示同源重组成功,得到重组子Ad-NE;荧光显微镜表明病毒包装成功;经过5轮扩增后,病毒滴度达到1.64×1012pfu/m L;感染K562细胞后,荧光显微镜观察感染效率达80%左右;Western blot法检测到NE表达上调;CCK-8实验显示NE表达上调后K562细胞增殖能力增强;流式细胞术显示S期细胞明显增多并且细胞凋亡减少。结论过表达NE可促进K562细胞增殖并抑制其凋亡。 相似文献
2.
目的构建重组慢病毒LV5-NE筛选纯NB4/LV5-NE细胞株,探讨中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)对人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4增殖的影响,为研究NE致白血病的可能机制奠定基础。方法以质粒p CMV-myc-NE为模板得到PCR产物NE,将NE基因连接到穿梭载体p GLV10/U6/GFP/Puro后酶切验证,将序列正确的质粒与包装质粒p Gag/Pol、pRev、p VSV-G共转染293T细胞。测定病毒滴度。实验分为空白组、LV5-NC组和LV5-NE组,病毒感染NB4细胞72 h后用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞。用Western blot检测NE在NB4细胞中的蛋白表达以及其切割作用;CCK-8法观察NB4细胞增殖能力;流式细胞术测定NB4细胞周期和凋亡;Western blot检测p Akt和Akt以及Bax和Bcl-2蛋白表达。结果成功构建表达NE的慢病毒LV5-NE,筛选得到纯NB4/LV5-NE细胞株,NE对NB4细胞的增殖有明显促进作用(P0.05)结论 NE在NB4细胞株中稳定表达后中可促进NB4细胞的增殖,其增殖作用可能通过激活PI3K/Akt通路调节。 相似文献
5.
6.
目的探讨SP100蛋白在全反式维甲酸(ATRA)作用NB4细胞过程中的表达及其对NB4细胞增殖和周期的影响。方法实时定量PCR检测SP100 mRNA的表达;Western blot检测SP100蛋白的表达;免疫荧光检测SP100的定位;CCK-8检测NB4细胞的增殖;流式细胞术检测NB4细胞的周期。结果 ATRA能明显促进NB4细胞中SP100mRNA水平和蛋白水平,并将SP100由弥散的小点状转变为较大的斑块状;感染SP100-shRNA的NB4细胞增殖活力明显高于未感染组和病毒空载组(P0.05),并使G2/M期的细胞增多。结论 ATRA促进NB4细胞中SP100蛋白的表达,SP100蛋白可能参与NB4细胞增殖活力的调节。 相似文献
7.
目的:探讨大黄素对人白血病K562细胞的增殖抑制与诱导凋亡作用.方法:采用MTT法检测大黄素对K562细胞的增殖抑制作用;通过Wight-Giemsa染色(W-G染色),在普通光镜下观察细胞的形态学变化;运用Annexin V/PI双标记法检测大黄素对K562细胞的凋亡效应;采用流式细胞技术检测细胞周期变化与凋亡情况;通过比色法检测Caspase-3、8、9的相对活性,分析大黄素诱导K562细胞凋亡的信号途径.结果:大黄素能显著抑制K562细胞的增殖,作用24、48、72 h后的半数抑制率浓度分别为80、50、40 μmol/L;处理组细胞在普通光镜下可见典型的凋亡形态学改变;Annexin V/PI双标记法检测到K562细胞在大黄索的诱导下出现早期凋亡并呈剂量依赖性(P<0.01);流式细胞仪结果分析发现,处理组的K562细胞被阻滞于G0/G1期,与对照组相比,凋亡率明显升高并呈现剂量依赖性(P<0.01);大黄素可触发caspase-3、8、9的活性增高(P<0.01).结论:大黄素能有效地抑制K562细胞的增殖并诱导其凋亡,其机制和Caspase信号途径的活化有关. 相似文献
8.
背景与目的:地塞米松衍生物(9-氟-16α-甲基11β,17-二羟基-3-氧-1,4-雄二烯-17β-羧酸)具有优于地塞米松的抗肿瘤活性,为探讨其抗肿瘤机制,本研究利用酵母三杂交技术在活细胞内筛选与之相互作用的靶蛋白。方法:构建诱饵质粒pGBKT7-GRα-LBD,利用酵母三杂交技术从人K562细胞cDNA文库中筛选与地塞米松衍生物相互作用的靶蛋白。结果:诱饵质粒成功构建,经Western blot分析可表达约31ku的诱饵蛋白,且诱饵蛋白没有毒性、渗漏和自激活现象。利用酵母三杂交技术从人K562细胞cDNA文库中筛选到37个能与地塞米松衍生物相互作用的蛋白质,并经酵母回转实验验证,得到20个真阳性克隆。结论:通过酵母三杂交技术在活细胞内筛选到20个与地塞米松衍生物有相互作用的蛋白。 相似文献
9.
测定K562细胞培养液中苦参碱浓度变化的反相离子对HPLC研究 总被引:1,自引:1,他引:0
本文建立了一种用于测定苦参碱含量的反相离子对高效液相色谱法(ion-pairHPLC)。该法比较准确、可靠,分离效果好,灵敏度高。可用于细胞培养液中苦参碱的分离测定及鉴定。结合样品前处理,作者运用此法对苦参碱在K562细胞培养液中的浓度变化情况进行了初步分析。发现在我们研究的实验条件下,K562细胞培养液中苦参碱的浓度先呈线性下降趋势,以后1-3天则浓度维持不变。 相似文献
10.
苦参碱对K562细胞培养液中PGE_2含量的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 :研究苦参碱诱导 K5 62细胞分化的胞外信号。方法 :运用酶联免疫法 ,动态检测苦参碱作用于 K5 62细胞后 ,培养液中 PGE2 含量的变化。结果 :培养液中 PGE2 含量在苦参碱作用于K5 62细胞 2天后有增高 ,并与苦参碱浓度有关。结论 :在苦参碱诱导 K5 62细胞分化的过程中 ,PGE2 含量的增高可能涉及到 PLA2 的激活 ,并且 PGE2 可能作为胞外信号影响 K5 62细胞的增殖与分化。 相似文献