中性粒细胞弹性蛋白酶的过表达促进K562细胞增殖并抑制其凋亡

目的利用Ad Easy系统构建携带人中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)基因的重组腺病毒表达质粒,并感染K562细胞,观察其对K562细胞增殖和凋亡的影响。方法以急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株HL-60的RNA为模板,经反转录PCR得到NE基因的编码区并克隆入穿梭载体p Ad Track-CMV,得到p Ad-NE,经HindⅢ、EcoRⅤ酶切鉴定和测序正确后,将其转化入p Ad Easy-1-BJ5183进行同源重组,得到重组子Ad-NE,经PacⅠ酶切线性化后转染AD293细胞进行包装。14 d之后收获原代病毒,经5轮扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。感染K562细胞后,荧光显微镜初步观察感染效率,同时用流式细胞术检测感染效率;Western blot法进一步鉴定NE是否表达上调;CCK-8法测定细胞增殖情况;流式细胞术测定细胞凋亡和细胞周期变化。结果酶切鉴定及测序结果表明重组穿梭质粒p Ad-NE构建成功;酶切鉴定显示同源重组成功,得到重组子Ad-NE;荧光显微镜表明病毒包装成功;经过5轮扩增后,病毒滴度达到1.64×1012pfu/m L;感染K562细胞后,荧光显微镜观察感染效率达80%左右;Western blot法检测到NE表达上调;CCK-8实验显示NE表达上调后K562细胞增殖能力增强;流式细胞术显示S期细胞明显增多并且细胞凋亡减少。结论过表达NE可促进K562细胞增殖并抑制其凋亡。     

唐山市农村小学生肠道致病原感染情况调查

采用随机方法确定唐山市农村小学生肠道致病原感染调查的调查学校和调查对象,采集粪样,用生理盐水涂片法、碘液涂片法、饱和盐水浮聚法检查肠道寄生虫,同时检查肠道致病菌。调查对象共433人,433份粪样中仅检出3例粪类圆线虫和2例结肠内阿米巴;肠道致病菌阳性101份,阳性率为22.75%,其中产碱杆菌阳性5例,乙型副伤寒杆菌阳性78例,伤寒杆菌阳性6例,痢疾杆菌阳性7例,其他5例。唐山市农村小学生肠道寄生虫感染率较低,但是肠道致病菌的感染率较高。     

重组慢病毒LV5-NE的构建及NE促进NB4细胞增殖

目的构建重组慢病毒LV5-NE筛选纯NB4/LV5-NE细胞株,探讨中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)对人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4增殖的影响,为研究NE致白血病的可能机制奠定基础。方法以质粒p CMV-myc-NE为模板得到PCR产物NE,将NE基因连接到穿梭载体p GLV10/U6/GFP/Puro后酶切验证,将序列正确的质粒与包装质粒p Gag/Pol、pRev、p VSV-G共转染293T细胞。测定病毒滴度。实验分为空白组、LV5-NC组和LV5-NE组,病毒感染NB4细胞72 h后用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞。用Western blot检测NE在NB4细胞中的蛋白表达以及其切割作用;CCK-8法观察NB4细胞增殖能力;流式细胞术测定NB4细胞周期和凋亡;Western blot检测p Akt和Akt以及Bax和Bcl-2蛋白表达。结果成功构建表达NE的慢病毒LV5-NE,筛选得到纯NB4/LV5-NE细胞株,NE对NB4细胞的增殖有明显促进作用(P0.05)结论 NE在NB4细胞株中稳定表达后中可促进NB4细胞的增殖,其增殖作用可能通过激活PI3K/Akt通路调节。     

NLS-RARα通过激活AKT调节白血病NB4细胞的增殖

目的构建携带NLS-RARα的重组慢病毒,感染白血病NB4细胞并观察其对NB4细胞增殖和AKT蛋白的影响。方法以质粒p CMV-HA-NLS-RARα为模板,PCR扩增NLS-RARα基因,将其亚克隆到慢病毒表达载体质粒LV5中,经DNA测序鉴定重组载体,用4质粒系统共转染293T细胞,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组慢病毒的滴度;重组慢病毒感染NB4细胞,经过嘌呤霉素筛选获得稳定转染NLS-RARα的NB4细胞株;CCK-8法检测NLSRARα对NB4细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期和感染效率;Western blot分别检测NLS-RARα、t-AKT和p-AKT的表达。结果 NLS-RARα克隆入LV5的多克隆位点,慢病毒浓缩后滴度为2×108Tu/m L;感染效率为86.54%;NLS-RARα能够明显促进细胞增殖,S期细胞增多,G1和G2期细胞减少;NLS-RARα基因在NB4细胞中稳定的表达,同时p-AKT明显增高,用PI3K抑制剂LY294002处理后p-AKT明显降低。结论 NLS-RARα通过激活AKT促进白血病NB4细胞的增殖。     

急性早幼粒细胞白血病患者血肿瘤细胞NLS-RARα蛋白的表达与定位

目的验证急性早幼粒细胞白血病(APL)患者血肿瘤细胞中带核定位信号的维甲酸受体α(nuclear localization signal-retinoic acid receptor alpha,NLS-RARα)蛋白的存在及定位。方法采用蛋白质印迹法验证患者血肿瘤细胞中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)的存在;提取患者血肿瘤细胞核蛋白,蛋白质印迹法检测细胞核中NLS-RARα蛋白的表达;FITC/DAPI双染色免疫荧光法检测患者血肿瘤细胞中NLS-RARα的表达及定位;FITC/PI双染色激光共聚焦法检测患者血肿瘤细胞中NLS-RARα的表达及定位。以重组腺病毒Ad-NE感染的NB4细胞中NLS-RARα蛋白的表达及定位作阳性对照,以正常人血中性粒细胞中野生型RARα的表达和定位作阴性对照。结果阳性对照组设置成功。APL患者血肿瘤细胞中存在NE且有NLS-RARα蛋白表达。细胞免疫荧光法、激光共聚焦法检测结果提示APL患者血肿瘤细胞NLSRARα蛋白的表达主要位于胞核。结论成功用3种方法检测出APL患者血肿瘤细胞中NLS-RARα蛋白的存在并推测其定位,为进一步研究APL的早期诊断及复发监测提供了新思路。     

腺病毒介导的PML(NLS-)过表达对白血病NB4细胞增殖和凋亡的影响

目的 利用腺病毒介导PML(NLS-)的过表达,探讨PML(NLS-)对NB4白血病细胞增殖凋亡的影响.方法 重组腺病毒质粒Ad-PML(NLS-)经Pac Ⅰ酶切线性化后转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-PML(NLS-),经4轮扩增后,测定重组腺病毒滴度;重组腺病毒感染NB4细胞,荧光显微成像和流式细胞术检测感染效率,RT-PCR法和Western blot法检测NB4细胞中PML(NLS-)的转录及表达水平,MTT实验观察细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期及凋亡.结果 重组腺病毒质粒Ad-PML(NLS-)经酶切和测序鉴定正确,经4轮扩增病毒滴度为1 ×1010pfu/mL;重组腺病毒Ad-PML(NLS-)感染NB4细胞效率达75％,PML(NLS-)基因可在NB4细胞中高效表达;NB4细胞增殖活力明显高于未感染组和空病毒载体感染组(P＜0.05),S期细胞比例明显增高(P＜0.05),G2期细胞比例明显减少(P＜0.05);实验组细胞凋亡率明显低于空病毒感染组(P＜0.05).结论 PML(NLS-)过表达能够促进白血病NB4细胞的体外增殖能力,抑制其凋亡.