啮齿类动物骨髓微核试验规范化方法介绍及背景数据采集

啮齿类动物骨髓微核试验（in vivo Mammalian Bone Marrow Micronucleus Test）是临床前药物遗传毒性研究标准组合试验之一,在医学、公共卫生、食品和药物安全性评价等领域有巨大应用前景。在GLP条件下确立标准化试验方法和条件,积累一定的背景数据范围,可有效确保试验系统的可靠性,为数据分析提供有力依据。以国家药物安全评价监测中心2007－2015年开展的小鼠及大鼠骨髓微核试验背景数据采集为例,介绍啮齿类动物骨髓微核试验规范化采集方法。     

抗重组人血清白蛋白抗体的检测方法建立及验证

目的:药物耐受以及内源性交叉反应是影响抗药抗体检测的主要因素,因此建立能够耐受较高药物浓度且可避免内源性交叉反应的检测方法是抗药抗体分析中需要解决的主要问题。本研究目的是建立抗重组人血清白蛋白抗体的检测方法并进行验证。方法:通过酸化及纳米磁珠富集提取抗重组人血清白蛋白抗体,然后采用桥连法进行抗体检测,最后对建立的方法进行验证。结果:经过该方法处理后,抗体回收率>80%,方法灵敏度可达到0.5μg·mL^-1,批间精密度和批内精密度均<20%,该方法最高可耐受2 mg·mL^-1的药物。结论:本研究建立了抗重组人血清白蛋白抗体检测方法,该方法抗体回收率高,具有良好的灵敏度和精密度,可达到mg级耐药,且可有效去除内源性物质干扰,既可用于抗药抗体检测,也可用于抗体药物提取,进而用于药动学分析。     

神经干细胞移植治疗神经系统疾病的研究进展

神经系统疾病作为最大的医学挑战之一,目前尚无针对性的治疗方法。神经干细胞（NSCs）具有分化潜能,可通过组织修复替代、神经营养、免疫调节、抗炎、抗凋亡等达到治疗神经系统疾病的作用,为神经系统疾病的治疗提供了新思路。近年来针对NSCs的研究愈发深入,NSCs移植成为神经系统疾病治疗方法的研究热点,大量临床前及临床研究数据证明NSCs移植治疗用于神经系统疾病是安全可行的。目前已有多个NSCs细胞系进入临床试验阶段,有望用于脑卒中、脑出血、脊髓损伤、帕金森病、阿尔茨海默病等常见神经系统疾病的治疗。总结了NSCs移植治疗中枢神经系统疾病的研究进展,以期为NSCs移植治疗神经系统疾病研究提供理论支持。     

多细胞系胞质分裂阻滞微核细胞组学试验法的建立与应用

目的: 采用不同组织来源的细胞系建立微核细胞组学,比较其遗传毒性生物标志物的敏感性,并研究雷公藤甲素(TPL)和甘草酸二铵(DG)对大鼠成纤维肺细胞(CHL)和犬肾小管上皮细胞系(MDCK)细胞微核率的影响。方法:首先建立方法,采用不同浓度丝裂霉素C(MMC)与CHL、L02、MDCK、Bhas42细胞作用6 h后给予细胞松弛素B(CytoB)继续培养约1.5个细胞倍增时间。收获细胞、制片、染色及镜检。计算每个剂量胞质分裂增殖指数(CBPI)、复制指数(RI)、坏死(Nec)及凋亡(Apop)细胞的千分率、双核细胞中微核(MN)、核芽(NBUD)和核质桥(NPB)出现的千分率。然后进行方法的验证,采用CHL细胞经不同浓度(1、10和100 μg/mL)DG预处理24 h后观察DG对上述细胞毒性和微核细胞组相关指标的影响。为进一步了解微核细胞组学对遗传毒性靶器官评估的效果,MDCK细胞经DG(10 μg/mL)预处理24 h后采用不同浓度(1和5 μg/mL)TPL染毒1 h,观察其对遗传毒性的影响。结果:MMC诱发的不同细胞系细胞毒性(CBPI、RI、Apop与Nec)均随MMC浓度升高呈升高趋势。各组细胞的MN、NBUD和NPB均出现不同程度的剂量相关性升高,但不同细胞系对MMC诱发的生物标志物峰值出现的敏感度不同。在验证实验中,与对照组相比,DG(10和100 μg/mL)对MMC(0.2 μg/mL)诱发的MN、NBUD和NPB升高有显著的抑制作用(P均<0.05)。TPL可诱发MDCK细胞NBUD和MN显著上升(P<0.05),且DG预处理可有效拮抗该效应(P<0.05)。结论:多细胞系胞质分裂阻滞微核细胞组学实验法可同时对多项遗传毒性指标进行评价。DG对CHL及MDCK细胞产生的染色体断裂有保护作用,在临床配伍中可发挥抗细胞DNA损伤的功效。     

食蟹猴重复给予溶瘤病毒药物HSV-1/hPD-1的毒性研究

目的：考察食蟹猴重复给予溶瘤病毒药物HSV-1/hPD-1后的体内毒性,探索安全剂量范围,为后续临床试验提供参考信息。方法：30只食蟹猴随机分成3组,包括溶媒对照组和低、高剂量(1.0×10⁸、4.0×10⁸ pfu)组,每组10只,雌雄各半。采用肌肉注射给药,每周给药2次,连续给药6周,恢复期8周。试验期间,每天观察动物的临床症状和摄食量,每次给药后1～2天观察注射部位症状,每周称量体重。分别在检疫期、首次给药后、给药期结束、恢复期结束的不同时间点进行安全药理(体温、血压、心电图)测定、临床病理(血液学、血凝、血清生化、尿生化)检查、免疫学(T淋巴细胞、细胞因子、免疫原性)测定、组织病理学检查和脏器称重。结果：给药后,动物未见异常症状、注射部位刺激性、体重和摄食量改变,未见安全药理和临床病理指标有意义的变化。与溶媒对照组比较,第41天,低剂量会引起动物CD3⁺CD4⁺T细胞比例升高,高剂量未见明显变化。第13至97天,低、高剂量均能引起动物产生抗载体结合抗体、抗抗体,以及个别动物检出hPD-1表达...     

羚羊清肺颗粒(濒危替代)药效学实验研究

目的:评价羚羊清肺颗粒原方中羚羊角替换为山羊角后的解热、镇痛、祛痰、止咳以及对急性咽炎的治疗作用,并与羚羊清肺颗粒原方进行药效学比较,为羚羊清肺颗粒山羊角替代羚羊角提供实验依据。方法:通过内毒素致家兔发热实验,观察其解热作用;通过小鼠醋酸扭体实验,观察其镇痛作用;通过小鼠酚红排泌实验,观察其祛痰作用;通过枸橼酸诱发豚鼠咳嗽实验,观察其止咳作用;通过氨水致大鼠咽炎实验,观察其治疗急性咽炎作用。结果:羚羊清肺颗粒(濒危替代)可明显降低发热模型家兔体温,减少小鼠扭体次数,增加小鼠气管酚红排泌量,延长豚鼠咳嗽潜伏期,并显著降低豚鼠咳嗽次数;降低咽炎模型大鼠血白细胞数、中性粒细胞数以及淋巴细胞数,并能显著减轻大鼠气管组织炎性病变。结论:羚羊清肺颗粒(濒危替代)具有解热、镇痛、祛痰、止咳及治疗咽炎的药效学作用,山羊角可作为羚羊清肺颗粒原方中羚羊角替换的一种选择。     

基于彗星实验的大黄素型单蒽酮体内外毒性研究

目的：采用人肝细胞HepaRG构建的2D、3D细胞培养模型和大鼠体内重复给药体系开展彗星实验,探讨不同模型对大黄素型单蒽酮毒性评价结果的影响。方法：2D和3D HepaRG细胞培养模型给予不同浓度的单蒽酮处理24、48、144 h后,采用彗星实验检测DNA损伤程度。25只雄性SD大鼠,按体质量随机分为0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）对照组、阳性对照甲磺酸乙酯（EMS）200 mg·kg-1组及单蒽酮6.5、65、650 mg·kg-1组,每组5只。对照组和单蒽酮各剂量组大鼠连续14 d灌胃给药,给药体积为15 mL·kg-1,阳性对照组大鼠连续3d灌胃给予EMS。末次给药3 h后麻醉取血及肝组织用于彗星实验。结果：单蒽酮质量浓度为10 μg·mL-1及以下时对2D培养的HepaRG细胞无明显损伤作用。而当单蒽酮质量浓度为10 μg·mL-1时,在3D模型中培养的肝细胞尾DNA含量及Olive尾矩（OTM）与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,且存在一定剂量相关性。体内彗星实验结果表明,单蒽酮650 mg·kg1组大鼠肝细胞尾DNA含量及OTM均显著高于对照组（P<0.01）,且各剂量组间存在一定剂量效应趋势;而各组大鼠的外周血有核细胞的尾DNA含量及OTM与对照组比较差异无统计学意义。结论：单蒽酮经3D培养模型代谢后存在肝细胞毒性,对大鼠肝细胞DNA损伤程度强于外周血细胞,推断其毒性与单蒽酮在肝脏中的代谢产物有关。     

美国FDA《非临床毒理学研究病理学同行评议指南草案》关注点探讨

目的： 探讨美国食品药品监督管理局于2019年7月发布的《非临床毒理学研究病理学同行评议指南草案》内容，以期为我国药物非临床安全性评价更好地开展病理学同行评议提供借鉴。方法： 对《非临床毒理学研究病理学同行评议指南草案》的制定背景、有关非临床毒理学研究的病理学同行评议的计划、管理、记录和报告的建议进行分析，并与经济合作与发展组织分别于2012年颁布的《长期毒性和致癌性实验的设计和实施》指导性文件第116号和2014年颁布的第16号文件《组织病理学同行评议GLP要求指导原则》进行比较。结果： 从与病理学同行评议相关的8个方面内容对《非临床毒理学研究病理学同行评议指南草案》进行梳理，有关病理学同行评议的定义、同行评议病理学家的资质、病理学同行评议的时间及类型分别与OECD第16号文件中相应内容一致。而关于在非GLP机构进行GLP研究病理学同行评议的要求、病理学同行评议过程的记录、病理学同行评议声明的内容及签署、如何确保专题病理学家的解释结果不会受到过度影响，以及解决专题病理学家和同行评议病理学家分歧的程序与OECD第16号文件中相应内容存在差异。结论： 《非临床毒理学研究病理学同行评议指南草案》的发布旨在给委托方、病理学家、机构负责人、专题负责人和质量保证人员提供指导，以使组织病理学同行评议的计划、管理、记录和报告符合GLP原则要求。本文将有助于我国药物非临床安全性评价建立一致的病理学同行评议的计划、管理、记录和报告程序。     

微孔板与标准平皿Ames试验比较研究

目的 使用鼠伤寒沙门菌和大肠埃希菌及阳性剂开展基于6孔板、24孔板和标准10 cm平皿的Ames试验，为确立标准化微孔板Ames试验奠定研究基础。方法 6种不同鼠伤寒沙门菌（TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535、TA1537）和1种大肠埃希菌（WP2 uvrA）经鉴定及扩增后，分别使用标准平皿、6孔板和24孔板在有无S9代谢活化条件下使用不同浓度的阳性剂开展平板掺入法Ames试验。所有样本置37℃培养约48 h后进行菌落计数。结果 所有试验条件下均出现浓度相关性的回复菌落形成率增加，且最高浓度条件下的菌落数高于对照组3倍。然而微孔板中可出现阴性背景菌落数过少的情况，阳性剂的用量也不能照搬标准平皿中的浓度设置。结论 本研究所用条件可成功开展基于6孔板和24孔板的Ames试验，其试验条件和背景数据需要经过摸索与积累。     

药物神经毒性评价体外模型的研究进展

神经毒性是药物安全性评价的重要方面。体外模型相比较体内动物实验在药物高通量筛选、分子机制研究、检测分析技术应用上具有显著优势。至今,研究和评价药物神经毒性的体外模型主要包括原代神经细胞培养、神经细胞系培养、诱导神经干细胞分化模型,三维细胞培养模型等。这些体外模型的复杂程度、对药物的敏感性及检测方法不尽相同。概述各种神经毒性体外模型的应用领域及研究进展,提出了神经毒性体外评价模型研究应用中存在的问题及今后的发展方向。