嗅鞘细胞与神经干细胞共培养后增殖及向神经元的分化

背景：影响神经干细胞增殖分化的外在因素包括细胞因子和微环境,嗅鞘细胞能分泌多种细胞因子,与神经干细胞共培养时改变其微环境。 目的：观察不同浓度嗅鞘细胞对神经干细胞增殖及分化的影响。 方法：体外分别培养Wistar大鼠神经干细胞和嗅鞘细胞,5×107 L-1神经干细胞分别和1×107 L-1,1×109 L-1,1×1011 L-1嗅鞘细胞共培养,同时设立正常对照组,不加嗅鞘细胞。倒置荧光显微镜下观察神经干细胞增殖情况,诱导7 d后行NSE免疫细胞化学染色,计算阳性细胞/细胞总数得出阳性细胞百分比。 结果与结论：①3种浓度嗅鞘细胞与神经干细胞共培养3 d后,均促进了神经干细胞增殖,以1×109 L-1嗅鞘细胞共培养组作用最显著,明显优于1×107 L-1嗅鞘细胞组、1×1011 L-1嗅鞘细胞组。②神经干细胞与1×109 L-1嗅鞘细胞共培养7 d后,神经干细胞分化为神经元样细胞的百分比最高,与正常对照组相比差异有显著性意义(P < 0.01)。     

多细胞因子诱导成年鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化的实验研究

目的观察大鼠骨髓基质细胞(rBMSCs)的生长特点及诱导条件下分化成神经细胞的能力,并对其机制进行初步探讨。方法以密度梯度离心分离骨髓基质细胞,在神经干细胞培养液中培养,采用四唑盐(MTT)法观察在培养液中添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)对BMSCs增殖的影响;观察添加脑源性神经生长因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)和维甲酸(RA)对rBMSCs的诱导分化情况;采用免疫组织化学法(ABC)检测诱导后的细胞表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经元核蛋白(NeuN)和胶质原性纤维酸性蛋白抗体(GFAP)等特异性标志物的情况;以流式细胞分选确定神经元的比例。结果bFGF和EGF能在体外促进rBMSCs增殖,BDNF、NGF和RA能诱导rBMSCs来源的神经干细胞(NSCs)表达NSE、GFAP等特异性标志物。结论EGF、bFGF、BDNF、NGF、RA及适宜的培养液可使rBMSCs定向转化为NSCs,获得足够的目的细胞,进而分化为神经元样和神经胶质样细胞。     

嗅鞘细胞对脂肪干细胞诱导分化的影响

目的 比较2种不同方法共培养脂肪干细胞后神经元特异性核蛋白(neuron specific nuclear protein,NeuN)的表达.方法 以transwell小室为共培养载体,实验组中将脂肪干细胞接种于上室,嗅鞘细胞接种于下室,对照组下室无嗅鞘细胞,只加入嗅鞘细胞条件培养液,共培养12 d后观察脂肪干细胞NeuN的表达.结果 共培养12 d后2组都有部分脂肪干细胞表达NeuN,实验组NeuN阳性率为303/345(87.8%),而对照组为120/320(37.5%),差异有统计学意义(χ~2=181.6,P＜0.05).结论 脂肪干细胞在与嗅鞘细胞共培养时更容易向神经元样细胞分化.     

氧化损伤星形胶质细胞与骨髓基质细胞共培养的实验研究

目的 观察氧化损伤星形胶质细胞与骨髓基质细胞(BMSCs)共培养时细胞损伤恢复及存活能力的改变,以进一步探讨BMSCs修复脑损伤的机制.方法 过氧化氢(H2O2)损伤体外培养的星形胶质细胞,与BMSCs共培养后光镜下观察细胞生存情况.分别在培养后第1、3天取细胞培养液应用EuSA试剂盒测定碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)以及表皮生长因子(EGF)的分泌水平,并与氧化损伤星形胶质细胞单独培养组和BMSCs单独培养组进行比较.结果 培养后3 d和7 d,共培养组星形胶质细胞的恢复及两种细胞的存活情况明显优于单独培养组.培养后1 d和3 d,共培养组细胞培养液中NGF、BDNF以及bFGF的浓度明显高于两个单独培养组之和,但是共培养组培养液中EGF的浓度明显低于两个单独培养组之和.结论 氧化损伤星形胶质细胞和BMSCs共培养能够提高星形胶质细胞的存活能力,增加NGF、BDNF以及bFGF的分泌水平.BMSCs移植修复脑损伤的功能可能部分是通过促进损伤星形胶质细胞恢复、减少星形胶质细胞死亡、增加神经营养和生长因子分泌完成.     

大鼠嗅鞘细胞和星形胶质细胞对神经干细胞分化作用的比较研究

目的比较大鼠嗅鞘细胞与星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响。方法分别从新生SD大鼠嗅球、海马、皮质分离、培养嗅鞘细胞、神经干细胞和星形胶质细胞。收集嗅鞘细胞、星形胶质细胞及其上清液,分别对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)进行诱导分化,倒置显微镜下观察细胞的生长情况,并采用免疫组化法对分化细胞鉴定和计数。结果嗅鞘细胞组分化为神经元比率高于星形胶质细胞组(P<0.01)。结论嗅鞘细胞较星形胶质细胞能更好地促进神经干细胞分化为神经元。     

嗅鞘细胞对原代培养神经干细胞增殖、分化的影响

目的 观察嗅鞘细胞(OECs)对神经干细胞(NSCs)增殖、分化的影响.方法 新生大鼠脑OECs和NSCs原代培养,采用免疫荧光及免疫细胞化学方法鉴定相关细胞.取原代OECs分为2组,实验组去除培养孔的间隔,使OECs和NSCs共用一培养液体系;对照组不破坏培养孔的间隔,单独培养NSCs,其余同实验组.观察2组细胞增殖、分化情况.结果 原代培养的OECs表达神经生长因子受体(P75NGFR);原代培养的神经球表达巢蛋白(nestin),神经球分化的细胞表达神经丝200(NF200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP).增殖实验中,实验组NSCs数量较对照组明显增多,差异有统计学意义(P<0.05).诱导分化实验中,实验组4d、7d时NF200阳性细胞率较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),说明2种细胞共液培养时,OECs提高了NSCs向NF200阳性细胞分化率.结论 OECs可促进NSCs增殖,并提高了NSCs向神经元分化的效率.     

牛垂体提取物、碱性成纤维细胞生长因子及Forskolin影响嗅鞘细胞增殖的量效关系

背景：生长因子参与调节嗅鞘细胞增殖、分化及代谢功能,因此有望通过应用其合理的序贯刺激形式,达到细胞数量地大量扩增。 目的：观察牛垂体提取物、碱性成纤维细胞生长因子及Forskolin对嗅鞘细胞增殖的影响及剂量-效应关系。 方法：采用原代培养技术,从新生大鼠的嗅球分离培养嗅鞘细胞,并用差速贴壁+化学药物+胰酶快速消化法纯化培养嗅鞘细胞,添加牛垂体提取物、碱性成纤维细胞生长因子及Forskolin 3种促增殖因子及其组合。MTT法检测各组嗅鞘细胞生长的情况。根据NGFRp75抗体的免疫细胞化学染色统计嗅鞘细胞的纯度和计算嗅鞘细胞的增殖率。 结果与结论：在嗅鞘细胞原代培养和纯化后,添加牛垂体提取物具有促进嗅鞘细胞增殖的效应,但未见典型的剂量-效应关系;添加碱性成纤维细胞生长因子具有促进嗅鞘细胞增殖的效应,且呈现典型的剂量-效应关系;添加Forskolin并不具有促进嗅鞘细胞增殖的效应。说明合理应用不同质量浓度的碱性成纤维细胞生长因子与Forskolin进行联合刺激,能有效促进细胞的增殖。结果表明序贯的使用合适浓度的生长因子组合,将是有效促进嗅鞘细胞增殖的合理策略,有助于解决脊髓损伤治疗中种子细胞来源不足这一问题。     

神经干细胞原代培养及胰岛素对其增殖与分化的作用

目的原代培养获得神经干细胞并初步探讨胰岛素对神经干细胞增殖分化的影响.方法小鼠胎脑原代细胞培养,免疫组化检测鉴定.100 ng/ml胰岛素作用后,甲基噻基四唑(MTT)法及免疫组化观察胰岛素对神经干细胞增殖分化的影响.结果原代培养的神经球表达巢蛋白(nestin),神经球分化的细胞表达神经丝200(NF200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP).与对照组相比,胰岛素作用下的神经干细胞增殖能力强,且神经元分化率较高,可达(35.41±1.97)%.结论原代培养的细胞为神经干细胞,且在胰岛素作用下,其增殖能力和向神经元分化率均有增高.     

人脐带间充质干细胞中神经营养因子的表达

目的 通过检测人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的神经营养因子谱,以进一步认识hUC-MSCs通过分泌神经营养因子治疗神经损伤的作用. 方法 组织块培养法分离培养hUC-MSCs,流式细胞仪鉴定干细胞表面标记物,Raybio人细胞因子抗体芯片检测hUC-MSCs神经营养因子表达情况,RT-PCR检测hUC-MSCs神经营养因子的基因表达,ELISA法定量检测hUC-MSCs上清液中分泌的脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、肝细胞生长因子(HGF)、神经营养因子3(NT-3)含量. 结果 流式细胞分析结果显示hUC-MSCs表面标记物CD29、CD44、CD90阳性(94.05％、90.75％、98.12％),CD34、CD45阴性(3.09％、0.80％).Raybio人细胞因子抗体芯片结果显示,与神经营养相关的因子BDNF、表皮生长因子(EGF)、GDNF、HGF、NT-3、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、神经营养因子4(NT-4)在hUC-MSCs中均有表达.RT-PCR检验也证实IGF-1、VEGF、神经生长因子(NGF)、HGF、GDNF、NT-4、BDNF和NT-3基因在hUC-MSCs表达.ELISA检测细胞上清液中BDNF、GDNF、HGF、NT-3的含量分别为(475.20±32.22) pg/mL、(82.33±3.39) pg/mL、(704.50±12.86) pg/mL、(230.41±16.66) pg/mL,分别与空白对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 hUC-MSCs富含神经营养因子,是一种理想的用于神经损伤治疗的种子细胞.     

骨髓基质干细胞因子对受损神经元的营养保护作用研究

目的 观察骨髓基质干细胞( BMSCs)外分泌因子对损伤神经的保护作用.方法 利用Transwell双室培养体系使BMSCs浸润于神经元裂解液中,酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞因子浓度;将BMSCs条件培养液加入经谷氨酸致伤的神经元表面,ELISA法和原位凋亡法检测乳酸脱氢酶(LDH)含量和口凋亡细胞数量;条件培养液原位注射于大鼠创伤灶后予以动物神经功能缺陷综合评分.结果 经神经元裂解液诱导后,BMSCs条件培养液中神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)含量明显增加,基质衍生因子-1α(SDF-1α)、转化生长因子-β-1(TGF-β-1)含量变化差异无统计学意义;LDH含量和细胞凋亡数量随BMSCs条件培养液浓度的增加而降低;实验动物的神经运动功能明显好转.结论 BMSCs外分泌因子对损伤神经元具有明确的保护作用,其中NGF和BDNF可能扮演重要角色.     

嗅鞘细胞诱导神经干细胞分化后神经元电生理特性的研究

目的探索大鼠嗅鞘细胞对神经干细胞(NSC)分化的影响,以及分化后神经元电生理特性。方法取新生鼠大脑皮质,原代培养大鼠NSC。NSC分为实验组和对照组,实验组将无血清培养的NSC中加入嗅鞘细胞条件培养液,对照组单纯无血清培养NSC。光镜下观察细胞分化情况,免疫组化法分别检测巢蛋白(nestin)、神经生长因子受体(NGFRp75)、神经丝蛋白(NF200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,膜片钳检测神经元电生理特性。结果实验组嗅鞘细胞主要诱导NSC分化为神经元,少量分化为胶质细胞。对照组NSC逐渐萎缩,最终死亡。分化后的神经元记录到快速激活、快速失活能被河豚毒素特异阻断的钠电流,以及慢激活、慢失活能被四乙铵特异阻断的延迟整流性钾电流。结论嗅鞘细胞能诱导NSC分化成神经元,分化后的神经元具有活跃的电生理特性。     

Olfactory ensheathing cells promote migration of Schwann cells by secreted nerve growth factor

Transplantation of Schwann cells (SCs) and olfactory ensheathing cells (OECs) have emerged as very promising therapies for spinal cord repair. The important features of interaction between SCs and OECs are beginning to be appreciated, although the underlying mechanism remains unclear. In the present study, we tested the effects of OECs on SCs migration using a range of in vitro migration assays. We found that SCs migrated abundantly upon OECs monolayer, and the migration-promoting effects were identified to be due to the secreted diffusible factors in OEC-derived conditioned medium (OEC-CM). Furthermore, neutralizing nerve growth factor (NGF) in OEC-CM with NGF antibody could block this effect. Moreover, we found that NGF promotes SCs migration even on astrocyte monolayer. Taken together, these findings provide the first evidence that OECs can promote SCs migration in astrocytic environment by secreted NGF.     

NSCs在OECs诱导下定向分化及神经元电生理特性研究

目的探索大鼠嗅鞘细胞（OECs）对神经干细胞（NSCs）分化的影响,并记录分化后神经元电生理特性。方法在无血清改良Eagle培养基（DMEM／F12）培养的NSCs中,加入OECs条件培养基,观察分化情况,巢蛋白（nestin）鉴定NSCs、神经丝蛋白200（NF200）鉴定神经元、膜片钳检测神经元电生理特性。结果OECs能促进NSCs分化为神经元,分化后的神经元记录到快速激活快速失活、能被河豚毒素（TTX）特异阻断的钠电流及慢激活慢失活、能被四乙基氯化铵（TEA）特异阻断的延迟整流性钾电流。结论OECs能诱导NSCs分化,分化后的神经元具有活跃的电生理特性,具有替代凋亡、坏死神经元的潜能。     

Brain‐derived neurotrophic factor stimulates proliferation and differentiation of neural stem cells,possibly by triggering the Wnt/β‐catenin signaling pathway

Brain‐derived neurotrophic factor (BDNF) has critical functions in promoting survival, expansion, and differentiation of neural stem cells (NSCs), but its downstream regulation mechanism is still not fully understood. The role of BDNF in proliferation and differentiation of NSCs through Wnt/β‐catenin signaling was studied via cell culture of cortical NSCs, Western blotting, immunocytochemistry, and TOPgal (Wnt reporter) analysis in mice. First, BDNF stimulated NSC proliferation dose dependently in cultured neurospheres that exhibited BrdU incorporation and neuronal and glial differentiation abilities. Second, BDNF effectively enhanced cell commitment to neuronal and oligodendrocytic fates, as indicated by increased differentiation marker Tuj‐1 (neuronal marker), CNPase (oligodendrocyte marker), and neuronal process extension. Third, BDNF upregulated expression of Wnt/β‐catenin signaling (Wnt1 and free β‐catenin) molecules. Moreover, these promoting effects were significantly inhibited by application of IWR1, a Wnt signaling‐specific blocker in culture. The TOPgal mouse experiment further confirmed BDNF‐triggered Wnt signaling activation by β‐gal labeling. Finally, an MEK inhibition experiment showed a mediating role of the microtubule‐associated protein kinase pathway in BDNF‐triggered Wnt/β‐catenin signaling cascades. This study overall has revealed that BDNF might contribute to proliferation and neuronal and oligodendrocytic differentiation of NSCs in vitro, most possibly by triggering the Wnt/β‐catenin signaling pathway. Nevertheless, determining the exact cross‐talk points at which BDNF might stimulate Wnt/β‐catenin signaling pathway in NSC activity requires further investigation. © 2012 Wiley Periodicals, Inc.     

Galanin inhibits the proliferation of glial olfactory ensheathing cells

The effect of galanin (GAL) on neural proliferation was studied in this article using olfactory ensheathing cells (OECs). OECs were isolated from newborn rat olfactory bulb and cultured in vitro. RT-PCR was used to determine the expression of GAL and its receptors in these cells. MTT analysis and LDH assay were used to detect the effects of GAL and the agonist, antagonist of GAL receptors on the proliferation of OECs. Results show that OECs express mRNAs for GAL and GAL receptor2 (GalR2) but not for the two other GAL receptors, GalR1 and GalR3. In addition, GAL and two receptor agonists, GAL1-11 and GAL2-11, can inhibit the proliferation of OECs significantly, but cause no cytotoxicity in the OECs population. Moreover, the influence can be blocked by M35, a nonspecific antagonist of GAL receptors. It is suggested that GAL is an inhibitory factor in regulating OECs proliferation.     

不同来源成体神经干细胞神经生物学特性比较的实验研究

目的 比较和评价来源于同一SD大鼠成体骨髓、脂肪和大脑的神经干细胞在体外自我更新、向神经元或神经胶质细胞分化的能力,对比三者体外分泌神经营养因子的能力,进一步评估和对比它们在移植修复中枢神经系统损伤的潜能.方法 选取来源于同一SD大鼠成体脑室下区、骨髓和脂肪3个部位的组织,体外分别诱导分化为脑室下区源性神经干细胞(SVZ-NSCs)、骨髓源性神经干细胞(BM-NSCs)和脂肪源性神经干细胞(AD-NSCs),比较三者的自我更新和分化情况;免疫细胞化学方法 、Western blot检测巢蛋白(nestin)、β-微管蛋白(β-tubulin)、GFAP和半乳糖脑苷脂(GalC)4种细胞表面标记物的表达:ELISA法定量检测体外培养3种组织来源的神经干细胞的BDNF和NGF的分泌水平.结果 3种组织来源基质细胞形成的神经球从外形观察无明显差异;体外扩增率由高到低依次为SVZ-NSCs、BM-NSCs和AD-NSCs.ELISA检测结果 表明3组细胞都能检测出BDNF和NGF分泌,但BM-NSCs组和AD-NSCs组明显低于SVZ-NSCs组,差异均有统计学意义(P<0.05);AD-NSCs组BDNF和NGF的水平均稍高于BM-NSCs组. 结论 在增殖能力、向神经细胞终极分化的能力和分泌神经营养因子的能力等方面,BM-NSCs和AD-NSCs均稍逊于中枢神经组织来源的SVZ-NSCs,但由于其具有可来源于自体、无免疫排斥和伦理道德问题等优点,可超越SVZ-NSCs成为目前最有临床应用前景的移植用种子细胞.AD-NSCs来源更为丰富,取材更为简便,也更容易被患者接受,可能是更好的选择.     

新生大鼠海马区及室管膜下区神经干细胞分离、培养和分化特性

目的建立大鼠神经干细胞（NSCs）分离、培养方法，观察其生长、增殖和分化特点。方法利用无血清培养技术，从新生大鼠海马、室管膜下区分离NSCs，进行体外扩增培养、传代观察。采用荧光免疫细胞化学检测技术，观察鉴定NSCs及其分化结果。结果分离获取的细胞具有自我更新和增殖能力，原代及传代培养均可形成细胞克隆，克隆中的细胞巢蛋白（nestin）表达阳性，显微镜下观察见典型的干细胞特征，诱导后可分化神经元和星形胶质细胞。结论上法分离培养的细胞为具有自我更新和增殖能力的NSCs，可诱导分化为终末神经细胞。     

Brain‐derived Neurotrophic Factor Promotes the Migration of Olfactory Ensheathing Cells Through TRPC Channels

Olfactory ensheathing cells (OECs) are a unique type of glial cells with axonal growth‐promoting properties in the olfactory system. Organized migration of OECs is essential for neural regeneration and olfactory development. However, the molecular mechanism of OEC migration remains unclear. In the present study, we examined the effects of brain‐derived neurotrophic factor (BDNF) on OEC migration. Initially, the “scratch” migration assay, the inverted coverslip and Boyden chamber migration assays showed that BDNF could promote the migration of primary cultured OECs. Furthermore, BDNF gradient attracted the migration of OECs in single‐cell migration assays. Mechanistically, TrkB receptor expressed in OECs mediated BDNF‐induced OEC migration, and BDNF triggered calcium signals in OECs. Finally, transient receptor potential cation channels (TRPCs) highly expressed in OECs were responsible for BDNF‐induced calcium signals, and required for BDNF‐induced OEC migration. Taken together, these results demonstrate that BDNF promotes the migration of cultured OECs and an unexpected finding is that TRPCs are required for BDNF‐induced OEC migration. GLIA 2016;64:2154–2165