体外中脑微环境下骨髓基质干细胞向多巴胺能神经元分化的实验研究

目的 应用中脑条件培养基与细胞因子联合诱导骨髓间质干细胞(MSCs)转化为多巴胺能(DA)神经元,探索体外诱导MSCs定向分化为DA能神经元的最佳条件.方法 取雄性Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓,进行MSCs的体外培养和传代扩增.采用贴壁培养法使MSCs得到纯化.碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导后,依据加入的神经营养因子不同分为对照组及实验组[单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)组、胶质源性神经营养因子(GDNF)组、GDNF+GM1组、GDNF+GM1+中脑条件培养基组].诱导过程中在倒置显微镜下观察细胞形态变化,分别在诱导第3、7天进行神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸生蛋白(GFAP)、酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学检测.计数NSE和TH阳性细胞数,并计算阳性细胞百分比.结果 各实验组于诱导第3、7天见不同数量的NSE、TH阳性神经元样细胞,GFAP阴性.对照组及实验各组7 d时NSE阳性细胞数(个/视野,n=10)分别为:对照组2.214±0.779,GM1组22.014±3.624,GDNF组31.345±2.850,GDNF+GM1组40.314±4.203,GDNF+GM1+中脑条件培养基组45.257±5.999.实验各组以GDNF+GM1+中脑条件培养基组NSE阳性细胞率最高,依次为GDNF+GM1组、GDNF组、GM1组,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).单独应用GDNF和GM1不能诱导MSCs表达TH,二者联合应用可诱导MSCs表达TH,加入中脑条件培养基可使TH阳性细胞率明显增加,而且随着共培养时间的延长,TH阳性表达增加更显著.结论 中脑条件培养基与细胞因子联合可明显促进MSCs向神经元样细胞分化,并促进细胞表达TH.     

GDNF和GM1体外联合诱导骨髓基质干细胞向多巴胺能神经元分化的实验研究

目的应用GDNF和GM1体外联合诱导MSCs转化为多巴胺能(DA)神经元。探索体外诱导MSCs定向分化为DA能神经元的最佳条件。方法取雄性Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓,密度梯度离心法分离获取单个核细胞。进行MSCs的体外培养和传代扩增。采用贴壁培养法使MSCs得到纯化。依据加入的神经营养因子不同分为对照组及实验组(GM1组、GDNF组、GDNF GM1组)。诱导过程中在倒置显微镜下观察细胞形态变化,分别在诱导第3天、第7天进行NSE、GFAP、TH免疫细胞化学检测。计数NSE和TH阳性细胞数,并计算阳性细胞百分比。采用SPSS10.0软件进行统计学处理。结果对照组可见少量NSE阳性细胞。各实验组比较发现,GDNF GM1组NSE阳性细胞率最高,GDNF组次之,GM1组最低。单独应用GDNF和GM1不能诱导MSCs表达TH,联合应用GDNF和GM1可诱导MSCs表达TH。随着诱导时间的延长,TH阳性表达增加。结论GDNF能够单独诱导MSCs向神经元样细胞分化,GM1不能单独诱导MSCs分化为神经元样细胞,但与GDNF联合,不仅可明显促进MSCs向神经元样细胞分化,而且部分细胞能够表达TH。     

音速波状蛋白促进骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化

目的探讨音速波状蛋白（Shh）促进人骨髓间充质干细胞（MSCs）体外定向分化为多巴胺能神经元样细胞的作用。方法体外分离、扩增和鉴定人骨髓MSCs。采用不同诱导方案诱导MSCs向神经元和多巴胺能神经元样细胞定向转化后,进行抗神经巢蛋白（Nestin）、神经元特异烯醇化酶（NSE）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、酪氨酸羟化酶（TH）和多巴胺转运体（DAT）等免疫细胞化学染色,并计算阳性细胞百分率。结果实验组诱导后MSCs能分化为具有典型神经元形态的细胞,可见NSE、Nestin、GFAP、TH和DAT等神经细胞标志表达;对照组MSCs细胞形态无明显变化,上述特异性标志物表达均为阴性。实验2组（诱导方案含Shh）与1组（诱导方案不含Shh）的NSE、Nestin、GFAP阳性细胞百分率的差异无统计学意义,但实验2组TH和DAT阳性细胞百分率明显高于实验1组,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论Shh可促进MSCs分化为多巴胺能神经元样细胞。     

胶质细胞源性神经营养因子诱导骨髓基质细胞向多巴胺能神经元分化的观察

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）在体外能否诱导骨髓基质细胞（BMSCs）向多巴胺（DA）能神经元分化及可能机制。方法无菌条件下，抽取成年SD大鼠胫骨内骨髓组织，分离制备成单细胞悬液进行培养。将增殖传代至第5代的BMSCs随机分为GDNF诱导组和对照组。继续培养7d后，应用BrdU／GFAP、BrdU/NeuN和TH免疫荧光单标和双标技术检测BMSCs增殖和分化情况。结果两组BMSCs继续培养7d后，增殖仍然活跃，有部分细胞向神经元和胶质样细胞分化，呈Brdu，GFAP、BrdU/NeuN和TH阳性表达，但GDNF组的增殖力更强，向神经元和TH神经元分化的数量明显多于对照组（P〈0．05）。结论GDNF能促进BMSCs的增殖和诱导BMSCs分化成神经元和胶质样细胞，其中少部分可分化为TH神经元（即DA能神经元）。     

成年骨髓间质干细胞体外诱导分化成神经细胞研究

目的：探索成年骨髓间质干细胞（ABMMSC）诱导分化为神经细胞（神经元和神经胶质细胞）的可行性，为ABMMSC在神经科学领域内的应用提供 参考。方法：以成年犬ABMMSC为实验对象，利用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（FGF）、维甲酸（RA）、脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）等作为增殖及分化诱导因子，采用两步法进行增殖培养，分化诱导；免疫细胞化学法进行细胞性质鉴定。结果：加入bFGF、EGF后增殖培养48h，换液、去除非粘附细胞，再增殖培养72h ,可见细胞分裂相（成纤维细胞样细胞）和簇样克隆形成（中小型细胞）。加入RA、BDNF、GDNF诱导3d，部分细胞有神经元特异性烯醇酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）成分表达；第10d可见有神经元、神经胶质形态样细胞形成。经细胞成分（NSE、GFAP）鉴定证实为神经元、神经胶质细胞。结论：ABMSC在体外培养条件下，经过bFGF、EGF、RA、BDNF、GDNF等因子的“程序性”作用，可以向神经元、神经胶质前体细胞及其终末细胞方向分化。     

成年大鼠骨髓基质干细胞诱导分化为神经元样细胞不同方法比较的研究

目的 研究成年大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导分化为神经元样细胞不同的方法，寻找它向神经细胞分化的最佳条件。方法 取纯度较高的BMSCs，通过不同的神经营养因子诱导法和抗氧化剂诱导法，进行抗巢蛋白(nestin)、神经元特异烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色，观察相应的阳性细胞数。结果 诱导第3天A组(EGF：表皮生长因子，bFGF：碱性成纤维细胞生长因子，RA：全反式维甲酸)，B组(GDNF：胶质细胞系源性神经营养因子，BDNF：脑源性神经营养因子)，C组(EGF，bFGF，GDNF，BDNF和RA)的Nestin阳性细胞数较多，其中以C组最多，而D组(抗氧化剂)Nestin阳性细胞数少于前三组。A，B，C组的NSE，GFAP染色阳性细胞数较D组少，但D组有部分细胞发生死亡。诱导第7天A，B，C组的NSE，GFAP阳性细胞数较第3天时明显增多，C组最多，B组其次，Nestin阳性细胞数比例较第3天时明显减少。而D组的NSE，GFAP阳性细胞数少于其第3天时；C组诱导成神经细胞比例较高，阴性对照组和空白对照组极少或无阳性细胞。此外，神经营养因子诱导法生成神经样细胞的比例都多于胶质样细胞。结论 抗氧化剂诱导法分化诱导快，而神经营养因子诱导法分化诱导效率高，诱导后细胞生长状态明显好于前者，各种神经营养因子联合作用影响BMSCs的增殖和分化。     

外源性Ang Ⅱ诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的研究

目的在体外成功分离培养并扩增神经干细胞（NSCs）的基础上,研究外源性血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）对NSCs向多巴胺（DA）能神经元分化的影响。方法（1）分离培养新生1d SD大鼠脑组织NSCs,免疫细胞学方法测定NSCs特异性标志物神经上皮干细胞蛋白（Nestin）表达及其分化为神经元、神经胶质细胞的能力;（2）按培养液中Ang Ⅱ的浓度不同,分5个浓度（100、200、400、600、800nmol/L）对第二代NSCs进行诱导分化。10d后采用免疫细胞学方法检测DA能神经元标志物酪氨酸羟化酶（TH）和神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达,半定量RT-PCR（SQ-PCR）测定分化细胞中TH mRNA的相对表达量。结果外源性Ang Ⅱ诱导提高NSCs向TH阳性细胞分化的比率,TH mRNA相对表达量亦增加,以Ang Ⅱ浓度为400nmol/L及600nmol/L的诱导效果最明显,TH阳性细胞率分别为10.77%和11.34%,TH mRNA相对表达量分别为（0.4023±0.0515）和（0.3971±0.0319）,两组间比较无统计学意义（P〉0.05）;其中400nmol/L Ang Ⅱ组分化细胞中GFAP阳性细胞率高于对照组,有统计学意义（P〈0.05）。结论外源性AngⅡ促进NSCs向DA能神经元分化,在400～600nmol/L浓度范围内AngⅡ的诱导效能更显著;AngⅡ促进NSCs向DA能神经元分化的机制可能与同时促进星型胶质细胞（AS）分化有关。     

脑源性神经营养因子诱导大鼠骨髓基质细胞成为神经干细胞及其分化作用的实验研究

目的探讨脑源性神经营养因子（BDNF）诱导大鼠骨髓基质细胞（BMSCs）成为神经干细胞及其分化作用。方法取大鼠BMSCs。分别以BDNF和BDNF＋RA（维甲酸）作为诱导物诱导，于诱导3d、7d后行巢蛋白（Nestin）、神经元特异烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色。结果后BDNF和BDNF＋RA诱导组均有大量Nestin染色阳性细胞，BDNF＋RA组阳性率高于BDNF组（P〈0．01）。NSE、GFAP免疫阳性细胞在诱导3d后也有少量表达。诱导7d后BDNF和BDNF＋RA诱导组Nestin阳性细胞明显减少．与诱导3d后比较差异有显著性（P〈0．01），而NSE、GFAP阳性细胞敷增多，与诱导3b比较差异有显著性（P〈0．01），且BDNF＋RA组阳性率高于BDNF组（P〈0．01）。结论联合应用BDNF与RA可提高BMscs神经转化．并促进其向神经元及星形胶质细胞细胞分化。     

全反式维甲酸诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的 体外探讨全反式维甲酸（ATRA）对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为神经元样细胞的作用。方法 从大鼠股髓分离出MSCs，采用贴壁法体外扩增、传代，取5代后细胞采用EGF共培养，二巯基乙醇（2-ME）预诱导，再以ATRA为诱导剂诱导，然后免疫细胞化学检测巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、酪氨酸羟化酶（TH）的表达情况。结果 MSCs诱导后具有神经元样细胞的形态，免疫细胞化学显示nestin、NSE、AchE有阳性表达，而GFAP、TH表达为阴性。结论 ATRA在体外能够有效的诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞，且可表达AchE。     

周围神经细胞悬液对体外培养的骨髓基质干细胞诱导分化的影响

目的应用周围神经细胞悬液、中脑条件培养基与细胞因子联合诱导骨髓基质干细胞(MSCs)转化为多巴胺(DA)能神经元。探索体外诱导MSCs定向分化为DA能神经元的最佳条件。方法取雄性SD大鼠股骨和胫骨骨髓,进行MSCs的体外培养和传代扩增。碱性成纤维细胞生长因子预诱导后,依据处理因素不同分为对照组及实验组(周围神经细胞悬液组、周围神经细胞悬液 中脑条件培养基组)。倒置显微镜下观察细胞形态变化,在诱导第7天进行神经元特异烯醇化酶(NSE),酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学检测。计数NSE和TH阳性细胞数,并计算阳性细胞百分比。结果对照组及实验各组7d NSE阳性细胞数分别为2.304±0.767,37.411±2.89.37.836±2.836(细胞数/每视野)。各组以周围神经细胞悬液 中脑条件培养基组NSE阳性细胞率最高,差异有统计学意义(P<0.01)。对照组及实验各组7d TH阳性细胞数分别为0,10.44±0.511,16.671±0.544(细胞数/每视野)。以周围神经细胞悬液 中脑条件培养基组TH阳性细胞数量较多,差异非常显著(P<0.01)。结论周围神经细胞悬液、中脑条件培养基与细胞因子联合可明显促进MSCs向神经元样细胞分化,并促进细胞表达TH。     

神经细胞黏附分子在GDNF保护大鼠多巴胺能神经元中的作用

目的研究神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM)在胶质细胞系源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)保护帕金森(Parkinson's disease,PD)模型大鼠受损多巴胺(dopamine,DA)能神经元中的作用。方法右侧纹状体内立体定位注射6-羟多巴胺(6-OHDA)制备早期PD模型,而后分为4组:对照组(同侧黑质内注射PBS)、NCAM组(同侧黑质内仅注射anti-NCAM抗体)、GDNF组(同侧黑质内注射GDNF)、NCAM阻断组(同侧黑质内注射anti-NCAM抗体30min后注射GDNF),采用免疫组织化学染色技术和免疫印迹技术,观察各组酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表达变化。结果GDNF组黑质致密部TH阳性神经元数目及表达的量明显多于PBS组,差别有统计学意义;NCAM阻断组与GDNF组相比,该处TH阳性神经元数目及表达的量明显减少,差别有统计学意义。结论NCAM参与了GDNF保护DA能神经元的作用。     

脐带间充质干细胞的分离培养及诱导分化为多巴胺能样神经元

目的 探索脐带间充质于细胞(MSCs)的分离培养及将其诱导分化为多巴胺能神经元的方法.方法 分离脐带间充质组织,Ⅳ型胶原酶消化分离脐带MSCs,原代培养于含10%FBS的DMEM/F12培养基中,观察细胞形态并应用流式细胞仪检测细胞表面标志物和细胞周期,CCK8法绘制细胞生长曲线;采用二步法诱导分化P3代脐带MSCs,培养3、6、9 d后终止诱导,应用免疫荧光染色和Wcstern blotting检测分化后细胞酪氨酸羟化酶(TH)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达.结果 分离培养的脐带MSCs形态呈相对均一的成纤维样细胞,平行排列或旋涡状生长.P3代细胞CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166表达阳性,而CD34、CD45、CD19、CD31、HLA-DR表达阴性.对数生长期细胞倍增时间为48 h,处于G0～G1期细胞占91.13%;诱导分化后细胞多数为两级,形态与神经元相似,免疫荧光染色检测结果显示诱导9 d时细胞NSE、TH染色阳性率分别为19.5%和8.9%,Weston blotting检测结果显示诱导6 d时细胞NSE表达明显,TH仅有弱表达,诱导9 d时TH、NSE均表达明显.结论 脐带间充质组织中能分离出MSCs,且能分化成多巴胺能神经元.

Abstract：

Objective To investigate the methods of isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) in Wharton' s jelly and the differentiation of MSCs into dopaminergic neurons. Methods The umbilical cord mesenchymal tissue was scraped off from the Wharton's jelly,and then, collagenase Ⅳ was employed to isolate the MSCs. The isolated cells were primarily cultured in DMEM/F12 medium containing 10% FBS. Inverted microscopy was used to observe the cytomorphology, and flow cytometry was employed to detect the cell surface antigens and the cell cycle.We evaluated the cell viability using CCK8 kit. Two-step method was employed to induce the MSCs of the P3 generation to differentiate into dopaminergic neurons, and immunocytochemistry and Western blotting were used to detect the expressions of neuron specific enolase (NSE) and tyrosine hydroxylase (TH) 3, 6 and 9 d after the induction. Results The isolated MSCs showed fibroblast-like shape, with parallel arrangement and vortex-like growth. MSCs of the P3 generation expressed CD73, CD29, CD44and CD105, but did not express CD34, CD45, CD106 and HLA-DR. The doubling time in the exponential phase was at the 48th h of culture, and 91.13% cells were under G0-G1. These cells had similar morphology of the neurons. The immunocytochemical assay showed that the NSE and TH positive rates were 19.5% and 8.9% on the 9th d of induction; and Western blotting showed that MSCs obviously expressed NSE and weakly expressed TH.Conclusion MSCs can be isolated from the umbilical cord mesenchymal tissue, and be induced to differentiate into dopaminergic neurons in vitro.     

Wnt信号分子诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

间充质干细胞可向神经方向转化,但分子机制目前不清楚。 目的：观察Wnt3a和Wnt5a在骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中的作用。 方法：体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传代后通过形态学和流式细胞仪检测细胞表面标志物CD14,CD44,CD9,CD34,CD45表达。采用碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a和Wnt5a的诱导方案,免疫组织化学法和RT-PCR检测Wnt3a、Wnt5a在骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化过程中的作用。 结果与结论：骨髓间充质干细胞为长梭形,表面标志物CD9,CD44高表达,CD34,CD45低表达。诱导后细胞Wnt3a诱导组巢蛋白,神经元特异性烯醇化酶呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白无明显表达,细胞活力良好。Wnt5a诱导组巢蛋白呈弱阳性表达,而神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性。RT-PCR结果显示Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后5 d可见明显的扩增条带,10 d后更加明显。胶质纤维酸性蛋白在诱导10 d后出现较弱的扩增条带。提示Wnt3a分子能够促进体外培养的间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

神经节苷脂对人骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞生长状态的影响

目的探讨神经节苷脂对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)诱导分化为神经元样细胞后生长状态的影响。方法MSCs由成年人骨髓经密度梯度离心加贴壁培养法获得,取第4～6代MSCs以10ng/ml bFGF预诱导24h后,用丁羟基茴醚(BHA)、二甲基亚砜(DMSO)和不同浓度神经节苷脂(25mmol/L、50mmol/L、75mmol/L)诱导分化,采用免疫细胞化学法鉴定神经细胞特异性抗原标记神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP2)和神经胶质相关蛋白(GFAP)的表达。唑盐比色实验(MTT法)检测不同浓度神经节苷脂对诱导后5h、24h、2d、3d细胞生长情况的影响。结果成功分离培养人MSCs,诱导分化后大部分MSCs变成神经元样细胞并表达NSE和MP2。中等浓度(50mmol/L)神经节苷脂组诱导后的细胞生长活力较低浓度和高浓度组好(P<0.05)。结论中等浓度神经节苷脂能使诱导后的细胞保持较好的生长状态。     

大鼠骨髓间质多潜能成年祖细胞体外培养和神经分化潜能的研究

目的:探讨大鼠骨髓间质中多潜能成年祖细胞(muhipotent adult progenitoi-cells or MAPCs)的体外培养与神经分化的方法,观察其增殖和分化特点。方法:采用Ficoll-Paque液(1.077g/L)和免疫微磁珠从大鼠双侧股骨和胫骨骨髓中分离与纯化出多潜能成年祖细胞,体外扩增,分别采用含碱性成纤维生长因子(bFGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)、成纤维生长因子-8(FGF-8)等试剂的无血清L-DMEM诱导MAPC分化为神经元。应用免疫荧光化学技术和RT-PCR等方法对分化细胞进行鉴定。结果:多潜能成年祖细胞在休外扩增可超过50代,细胞形态和神经分化能力没有发生变化。在碱性成纤维生长因子的诱导下,MAPC形态转变为典型的神经样细胞,神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达阳性。继续用BDNF、FGF-8持续诱导,MAPC可分化为更加成熟的神经样细胞,微管相关蛋白-2(MAP-2)表达阳性;RT-PCR显示诱导出的神经样细胞,酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺β-羟化酶(DBH)mRNA表达水平明显升高。结论:建立了多潜能成年祖细胞体外分离、培养的条件,探索了多潜能成年祖细胞部分生物学特性,多潜能成年祖细胞在体外可以持续增殖并可诱导分化为较成熟的神经元样细胞,它可为多潜能成年祖细胞的临床应用提供材料。