人脱细胞羊膜对间充质干细胞向神经系细胞分化的影响

背景：成体干细胞在细胞外基质加细胞因子作用下向神经系细胞分化的报道甚少。 目的：根据干细胞巢原理,探讨羊膜间充质干细胞体外向神经系细胞诱导分化的条件,及其定向分化过程中神经蛋白的表达。 设计、时间及地点：细胞形态学观察及蛋白分子水平检测,于2007-12/2008-04在郑州大学医学院实验中心完成。 材料：产妇自愿捐献的羊膜由郑州大学第一附属医院产科提供。维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子为Sigma公司产品。 方法：体外分离培养、扩增羊膜间充质干细胞,调整细胞密度为4×107 L-1,同时通过酶-化学法制作膜样基质。设立2 组：诱导组羊膜间充质干细胞以基础培养基预诱导后,按4×107 L-1接种在膜样基质上,并以神经基础培养基培养2 d,然后替换为含10-3 mmol/L维甲酸、20 μg/Lβ-神经生长因子的DMEM/F12神经诱导培养基,继续培养24 h,换基础培养基继续培养3 d。对照组除不用膜样基质外,余步骤同诱导组。 主要观察指标：细胞形态学变化,蛋白分子水平鉴定神经细胞表型。 结果：诱导组接种到膜样细胞外基质24 h可见细胞呈球形,紧贴膜样基质,胞体伸出突起,折光性强;第3天大部分细胞突起延伸并相互连接;4~6 d突起形成网状结构且排列具有一定的方向性;对照组3 d时见多个突起,4~6 d细胞又恢复纤维细胞形态。预诱导后,两组巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶表达明显增高,突触素、胶质纤维酸性蛋白表达无明显变化;诱导6 d时与对照组比较,诱导组神经元特异性烯醇化酶表达无明显差异(P > 0.05),突触素表达显著升高(P < 0.01),巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白表达显著降低(P < 0.01)。 结论：在膜样细胞外基质上,羊膜间充质干细胞可显示典型神经元特有的形态特征、表达标记。提示应用基质加细胞因子的诱导程序,可以从羊膜间充质干细胞高效获得神经元前体细胞,并抑制其向神经胶质细胞的分化。     

人羊膜上皮细胞有向心肌样细胞分化的特性*★

目的：通过体外诱导分化实验，评价人羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的能力。 方法：实验于2005-09/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成。①对象：经产妇知情同意，无菌采集健康足月剖宫产胎盘6份，实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法：采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，D-Hank’s液冲洗后剪成碎片，加入含有0.2 g/L乙二胺四乙酸的0.5 g/L胰蛋白酶溶液，离心、消化、过滤，收集滤液，加入胎牛血清终止消化，重复消化2次。合并3次消化所得的细胞悬液，离心后将细胞沉淀悬浮于L-DMEM培养基中，按1.25×108 L-1密度接种，常规培养3 d后更换培养基，待细胞达80%~90%融合后用胰蛋白酶+乙二胺四乙酸联合消化，终止后离心弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮，按1×107 L-1密度传代。③实验评估：用流式细胞仪鉴定人羊膜上皮细胞表型；使用10 μmol/L 5-氮杂胞苷和1 mmol/L抗坏血酸磷酸盐诱导第2代人羊膜上皮细胞，免疫荧光染色法检测诱导后细胞中特异蛋白结蛋白和 α-辅肌动蛋白的表达，RT-PCR检测心肌特异性转录因子Nkx2.5、GATA-4和心肌特异性收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA的表达。 结果：①人羊膜上皮细胞的免疫组化特征：人羊膜上皮细胞几乎不表达CD44，不表达波形蛋白，表达角蛋白19。②人羊膜上皮细胞α-辅肌动蛋白和结蛋白的表达：人羊膜上皮细胞经诱导分化后，表达肌系细胞标志α-辅肌动蛋白和结蛋白。③人羊膜上皮细胞Nkx2.5、GATA-4和α-肌球蛋白重链mRNA的表达：人羊膜上皮细胞经诱导分化后，表达心肌特异性转录因子Nkx2.5 mRNA和GATA-4 mRNA，心肌特异的可收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA未见表达。 结论：通过胰蛋白酶消化法分离获得的人羊膜上皮细胞具有向心肌样细胞分化的特性，可能成为细胞心肌成形术的候选供体细胞。     

人羊膜上皮细胞分泌神经营养因子诱导人脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化：可能性验证**★

背景：课题组前期实验已证实人羊膜上皮细胞条件培养液可以诱导人脐血间充质干细胞分化为多巴胺能神经元样细胞，在此过程中人羊膜上皮细胞分泌的神经营养因子及其受体可能起到了重要作用。 目的：探讨人羊膜上皮细胞分泌的神经营养因子对人脐血间充质干细胞神经分化的作用。 方法：将P1代人脐血间充质干细胞按2×108 L-1密度接种，分为3组：对照组加入HG-DMEM培养基；诱导组加入人羊膜上皮细胞条件培养液；阻断剂组预先加入阻断剂K252a工作液，36 ℃孵育40 min后更换为羊膜上皮细胞条件培养液。免疫荧光化学检测诱导后人脐血间充质干细胞神经元特异性烯醇化酶及多巴胺转运体的表达，实时定量PCR法检测诱导后人脐血间充质干细胞中神经元特异性烯醇化酶、多巴胺转运体及酪氨酸羟化酶的表达。 结果与结论：人羊膜上清中有神经生长因子和脑源性神经营养因子的表达，且P1代人脐血间充质干细胞表达神经营养因子高黏附性受体Trka及Trkb。诱导48 h后与对照组比较，诱导组及阻断剂组神经元特异性烯醇化酶、多巴胺转运体阳性细胞数均明显增加(P < 0.05)，且诱导组阳性细胞数最多(P < 0.05)。诱导组、阻断剂组神经元特异性烯醇化酶、多巴胺转运体及酪氨酸羟化酶mRNA含量均显著高于对照组(P < 0.01)，且诱导组各基因mRNA含量明显高于阻断剂组(P < 0.01)。结果证实人羊膜上皮细胞分泌的神经营养因子对人脐血间充质干细胞的神经分化有重要作用，其促神经分化作用是通过酪氨酸激酶受体介导的。     

不同方法诱导大鼠脂肪基质细胞定向分化为神经细胞的比较研究

目的 探索提高大鼠脂肪基质细胞(ADSCs)向神经细胞定向诱导分化比例的实验方法.方法 根据所采用的不同细胞诱导分化方法分为A组(直接诱导组:以含血清及神经营养因子的Neurobasal培养基直接诱导ADSCs向神经细胞分化)和B组[神经球诱导组:先以无血清Neurobasal培养基将ADSCs诱导为神经干细胞(NSCs)球,再以含血清及营养因子的Neurobasal培养基诱导神经球干细胞向神经细胞分化].通过细胞形态学观察以及免疫细胞化学检测巢蛋白(nestin)、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)、微管相关蛋白2(MAP2ab)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达,鉴定细胞分化结果.结果 免疫细胞化学结果证实,两组细胞均有效表达nestin和β-tubulinⅢ.A组细胞在诱导6 h时nestin表达可达高峰(73.8%±6.5%),并很快下降(24 h为50.3%±3.8%,72 h为10.5%±3.0%),72 h后即检测不到;β-tubulinⅢ在诱导后24 h开始表达(33.5%±6.6%),1周达高峰(84.3%±33%).B组nestin的高表达持续整个神经球阶段,β-tubulinⅢ在神经球阶段有少量表达(成球后7 d为14.1%±3.3%),神经球细胞分化后其表达明显增加(分化后3 d为46.4%±6.1%);B组存由NSCs向神经细胞诱导一定时间后可检测到一定比例的MAP2ab阳性细胞(24.5%).结论 ADSCs在体外稳定扩增传代并在适宜诱导条件下,可以向神经细胞定向分化.应用神经球诱导法和直接诱导法均可得到较高比例的nestin及β-tubulinⅢ阳性细胞,神经球诱导组nestin表达稳定,并有一定比例MAP2ab阳性细胞出现.     

音猬因子诱导恒河猴骨髓间质干细胞向神经元样细胞的分化:与维甲酸方案比较其信号分子表达变化的意义

背景：近来研究发现在神经发育过程中,神经干细胞的分化受到来自周围微环境中诸多调控因子的作用,其中音猬因子是神经胚胎发育过程中关键性的诱导信号,有望作为一种有效的诱导剂调节神经细胞的分化。 目的：探讨音猬因子诱导恒河猴骨髓间质干细胞向神经元样细胞分化过程中的信号分子表达变化。 方法：常规密度梯度离心法分离培养恒河猴骨髓间质干细胞,诱导组加入含FGF2、B27、胎牛血清的L-DMEM预诱导24 h撤离血清后,分别加入含0.5 μmol/L维甲酸或400 μmol/L音猬因子的DMEM诱导8 d,以未诱导的细胞作为对照组。经神经元烯醇化酶荧光标记后,流式细胞仪筛选阳性细胞,应用RT-PCR与Western-blot法检测音猬因子和维甲酸诱导的细胞膜受体、细胞内信号蛋白的变化。 结果与结论：音猬因子特异性膜受体Ptc、维甲酸特异性受体RARα、信号蛋白分子ptch1及Smad在正常细胞均有表达。经音猬因子诱导的细胞其Ptc表达上调,且随着诱导时间延长持续高表达,明显强于维甲酸诱导组及对照组(P < 0.01);其细胞内ptch1蛋白分子表达与此趋势一致,但不能引起RARα表达上调。经维甲酸刺激的细胞在诱导过程中没有激活Ptc通路,诱导4 d后RARα表达出现小幅上调并持续至6 d,但这一结果差异不具有显著性意义,ptch1的表达无明显变化。经音猬因子、维甲酸诱导的细胞Smad分子表达均上调,但无明显差异。证实音猬因子诱导方案通过持续激活其特异性受体途径参与细胞诱导分化过程,而维甲酸诱导方案和音猬因子诱导方案之间没有显著受体途径交叉。     

维甲酸体外诱导大鼠胚胎垂体生长激素细胞的分化

目的 探讨维甲酸(RA)在体外诱导大鼠胚胎垂体生长激素(GH)细胞的分化作用.方法 原代培养大鼠胚胎垂体细胞,采用不同浓度的维甲酸(10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L)诱导大鼠胚胎垂体细胞分化,以DMEM培养基为作为对照组,诱导2、4、6d后,利用免疫组化检测GH细胞百分比,放射免疫分析检测细胞上清GH...     

鼠脑C6胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：观察人骨髓间充质干细胞经鼠脑C6胶质瘤细胞上清液诱导后向神经元样细胞方向的分化情况。 方法：取肝素抗凝人骨髓血，Percoll梯度法体外分离培养骨髓间充质干细胞，胰酶消化后传代扩增。取第4~6代骨髓间充质干细胞，当细胞达90%融合时，按2×103/孔接种于24孔板内，第2天分为两组，诱导组用含有50% C6胶质瘤细胞上清液的完全培养基（含体积分数为0.1胎牛血清的L-DMEM培养基）诱导，每隔2 d换液1次；对照组单纯加入完全培养基进行培养。诱导后3 d，两组细胞采用S-P法进行免疫细胞化学染色，检测神经元特异性标志物的表达。 结果：诱导24 h后，诱导组多数骨髓间充质干细胞表现出典型的神经元样外观，对照组细胞形态无明显变化。诱导3 d后，诱导组神经元烯醇化酶阳性细胞率显著高于对照组（P < 0.01）；诱导组神经丝蛋白阳性细胞率为（44.2±2.4）%，对照组为阴性；两组胶质纤维酸性蛋白均呈阴性表达。 结论：鼠脑C6胶质瘤细胞上清液可成功诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

全反式维甲酸诱导神经干细胞分化实验研究

目的探索全反式维甲酸在诱导人胚胎神经干细胞(NSC)分化为神经元过程中的作用.方法用不同浓度(0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)的全反式维甲酸(ATRA)在体外诱导人胚胎神经干细胞.诱导7 d后,做神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光染色,计数分化为神经元的比例.结果与对照组相比,全反式维甲酸能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例(P<0.01).其中1 μmol/L的维甲酸诱导人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例最高,为(29.20±1.09)%.结论全反式维甲酸能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例,其具体机制尚待进一步研究.     

黄芩甙体外诱导大鼠骨髓基质细胞向神经干细胞的分化

背景：已有实验表明,骨髓基质细胞具有分化为骨骼、神经干细胞及造血干细胞的巨大潜能,而黄芩甙具有诱导细胞分化的作用。 目的：探讨黄芩甙体外诱导骨髓基质细胞分化为神经干细胞的可能性。 方法：分离培养Wistar纯系大鼠骨髓基质细胞,并将分离的骨髓基质细胞分为实验组和对照组,对照组不干预,实验组用黄芩甙(350~400 μmol/L)诱导,2组的培养环境相同。持续诱导6 d后选取生长良好的细胞进行蛋白质印迹和反转录PCR(RT-PCR)法检测。 结果与结论：黄芩甙诱导 7 d后,骨髓基质细胞形成较典型的神经细胞形态。诱导前骨髓基质细胞不表达神经细胞标记蛋白mRNA和蛋白;诱导 6 d表达神经细胞标记蛋白和mRNA;对照组不表达神经细胞标记蛋白和mRNA。证实黄芩甙在体外可诱导成年大鼠骨髓基质细胞分化为神经样细胞。     

成年大鼠骨髓基质干细胞诱导分化为神经元样细胞不同方法比较的研究

目的 研究成年大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导分化为神经元样细胞不同的方法，寻找它向神经细胞分化的最佳条件。方法 取纯度较高的BMSCs，通过不同的神经营养因子诱导法和抗氧化剂诱导法，进行抗巢蛋白(nestin)、神经元特异烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色，观察相应的阳性细胞数。结果 诱导第3天A组(EGF：表皮生长因子，bFGF：碱性成纤维细胞生长因子，RA：全反式维甲酸)，B组(GDNF：胶质细胞系源性神经营养因子，BDNF：脑源性神经营养因子)，C组(EGF，bFGF，GDNF，BDNF和RA)的Nestin阳性细胞数较多，其中以C组最多，而D组(抗氧化剂)Nestin阳性细胞数少于前三组。A，B，C组的NSE，GFAP染色阳性细胞数较D组少，但D组有部分细胞发生死亡。诱导第7天A，B，C组的NSE，GFAP阳性细胞数较第3天时明显增多，C组最多，B组其次，Nestin阳性细胞数比例较第3天时明显减少。而D组的NSE，GFAP阳性细胞数少于其第3天时；C组诱导成神经细胞比例较高，阴性对照组和空白对照组极少或无阳性细胞。此外，神经营养因子诱导法生成神经样细胞的比例都多于胶质样细胞。结论 抗氧化剂诱导法分化诱导快，而神经营养因子诱导法分化诱导效率高，诱导后细胞生长状态明显好于前者，各种神经营养因子联合作用影响BMSCs的增殖和分化。     

尿酸减轻6-羟基多巴胺对PC12细胞的毒性作用

目的：评价尿酸减轻6．羟基多巴胺（6-OHDA）对PC12细胞的毒性作用。方法：应用PCI2细胞制作帕金森细胞模型,分为对照组、尿酸组、6-OHDA组、尿酸＋6-OHDA组。采用MTT测定各组PC12细胞活性,免疫荧光法观察各组PCI2细胞caspase-3激活情况,流式细胞术检测各组PC12细胞凋亡率。尿酸100～400μmol·L^-1不影响PCI2细胞生存率,尿酸100～400μmol·L-1可显著提高6-OHDA50gmol-L。作用6、12和24h造成的PCI2细胞生存率的下降（P〈0．01）;尿酸能减少6-OHDA导致的PCI2细胞caspase-3激活,降低6-OHDA导致的凋亡率（P〈0．05）。结论：尿酸具有减轻6-OHDA对PC12细胞的毒性作用。     

还原型谷胱甘肽诱导大鼠骨髓基质细胞GFAPmRNA及蛋白表达变化

目的：研究还原型谷胱甘肽（GSH）对大鼠骨髓基质细胞（BMSCs）胶质纤维酸性蛋白（GFAP）mRNA及蛋白表达的影响。方法：传3代骨髓基质细胞随机分为GSH诱导组和对照组。GSH诱导组加入10mmol·L^-1GSH20μL,对照组加入生理盐水20UL,两组使用的培养基和处理过程相同。于加入GSH和生理盐水后6、12和24h观察记录细胞的生存情况及细胞的形态变化。采用实时荧光定量PCR和Westernblot法检测各组诱导后细胞GFAPmRNA及蛋白表达水平的变化。结果：经GSH诱导后BMSCs形态发生明显改变,GSH诱导组GFAPmRNA及蛋白表达水平显著高于对照组（P〈0．05）,以诱导12h后变化最为明显。结论：BMSCs经GSH诱导后GFAPmRNA及蛋白表达量显著增多。     

脑微血管内皮细胞和脑肿瘤干细胞共培养的体外实验研究

目的 研究体外培养条件下,脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)对脑肿瘤干细胞(braintumor stem cells,BTSCs)增殖、自我更新及分化功能的影响.方法 应用Transwell小室建立BMECs与BTSCs共培养模型,并建立对照组,共培养14 d后,测量肿瘤球(brain tumor sphere,BTS)直径大小,检测BTSCs增殖曲线,测定单细胞克隆形成率.在含血清的培养基中培养10 d后,行CD133、Nestin、GFAP、DAPI免疫荧光染色,计数两组的CD133、Nestin、GFAP染色的细胞数及同一视野的DAPI染色细胞核数,观察两组之间的差异.结果 共培养组BTS直径是对照组的5.05倍,增殖快,共培养组有61.4%能形成下一代BTSCs,而对照组为39.0%.在含血清的培养基中培养10 d后,共培养组的GFAP阳性率较对照组低,而CD133、Nestin阳性率较对照组高.结论 BMECs能够促进BTSCs增殖、自我更新能力,保持BTSCs未分化状态.     

N-甲基-D-天冬氨酸受体亚单位2B特异性拮抗剂对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑室下区神经干细胞增殖的影响

目的:研究N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)亚单位2B(NR2B)特异性拮抗剂(Ro 25-6981)对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠脑室下区(SVZ)神经干细胞(NSCs)增殖的影响。方法:7 d龄新生SD大鼠随机分为Ro 25-6981组(HIBD前2 h,腹腔注射Ro 25-6981 10 mg.kg-1)、HIBD组(HIBD前2 h,腹腔注射等剂量生理盐水)和假手术组(仅游离右侧颈总动脉,不结扎)。采用免疫组化学染色检测SVZ Nestin表达量及BrdU阳性细胞数的变化。结果:HIBD组12h后Nestin表达量开始增多,48 h达峰值,之后缓慢下降;与其相比,Ro 25-6981组在12 h和24 h时下降明显(P<0.05)。HIBD组BrdU阳性细胞数在缺氧缺血3 h后缓慢上升,72 h达高峰;与其相比,Ro 25-6981组在各时间点BrdU阳性细胞表达均有所下降,以24、48和72 h减少明显,尤以72 h为著(P<0.05)。结论:Ro 25-6981能够降低HIBD新生大鼠SVZ Nestin的表达及Brdu阳性细胞数,对SVZ NSCs增殖起抑制作用,提示NR2B参与并促进HIBD引起的SVZ NSCs的增殖。     

咪唑克生对脂多糖诱导的皮质星形胶质细胞相关炎症细胞因子的影响

目的：了解咪唑克生（Ida）对炎症状态下的星形胶质细胞相关的炎症细胞因子的调节作用。方法：将纯度〉95％星形胶质细胞随机分为空白对照组、脂多糖刺激组和Ida炎症干预组，每组7瓶细胞。Ida 100μmol·L^-1，脂多糖10μg·mL^-1。Ida预处理6h、药物共处理12h、脂多糖处理12和24h时留上清液检测细胞因子，细胞提取RNA检测胶质酸性纤维蛋白和核转录因子κB（NF-κB）水平。结果：Ida能抑制促炎细胞因子（P〈0．01）和NF-κB的表达（P〈0．05）。结论：Ida具有抗炎作用。     

海马神经元条件培养液体外诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元样细胞和神经胶质样 细胞的分化：与含b-FGF培养基和无血清培养基的比较*☆

背景：目前关于骨髓间质干细胞能否向神经元方向分化的报道不多,且争论多集中在分化后的神经元是否仅具有神经元形态而不具有神经元功能。 目的：探讨海马神经元条件培养液诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元样细胞和神经胶质样细胞分化的可能性。 方法：将第5代大鼠骨髓间质干细胞分为4组：条件培养基组加入海马神经元和胶质细胞的培养液;b-FGF组加入含b-FGF的DMEM培养基;无血清培养组加入含Neurobasal和B27的无血清培养基;阴性对照组加入含胎牛血清的DMEM。各组诱导12,24 h后,应用免疫细胞化学染色行神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白的鉴定,Western-blot法检测细胞神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白的表达。 结果与结论：诱导12,24 h后,条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组骨髓间质充干细胞微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶均呈阳性表达,阴性对照组未见表达。与阴性对照组比较,诱导后24 h,条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组微管相关蛋白2表达均明显增强(P < 0.05),且条件培养基组增强幅度显著高于另两组(P < 0.05);条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白表达无明显差异。结果证实海马神经元条件培养液可体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞,与含b-FGF的培养基和无血清培养基相比,海马神经元条件培养基诱导的神经元和神经胶质细胞阳性率最高。     

BDNF、EGFP基因修饰大鼠胚胎腹侧中脑神经干细胞的建立

目的建立脑源性神经营养因子（BDNF）、增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因修饰大鼠胚胎腹侧中脑神经干细胞（mNSCs）。方法以FuGENEHD转染试剂介导质粒pcDNA3-BDNF、pEGFPN1共转染第三代E14大鼠胚胎mNSCs。荧光显微镜观察EGFP表达情况；免疫细胞化学方法和Western blot鉴定BDNF的表达；体外诱导分化后免疫细胞化学鉴定其分化能力。结果基因转染12h后EGFP开始表达：免疫细胞化学、Western blot结果表明BDNF能在细胞中正确表达；体外诱导分化研究表明BDNF、EGFP基因修饰不影响大鼠胚胎mNSCs的增殖与分化。结论成功建立了BDNF、EGFP基因修饰大鼠胚胎mNSCs，可为进一步开展帕金森病的细胞移植治疗研究奠定基础。     

7蛋白酶体抑制剂对星形胶质细胞周期素D1和周期素依赖性激酶4表达的影响

目的：研究蛋白酶体抑制对体外培养的星形胶质细胞周期素Dl（cyclinD1）和周期素依赖性激酶4（CDK4）表达的影响。方法：SD乳鼠皮质星形胶质细胞原代培养,并纯化鉴定;予不同浓度（2和4μmol·L^-1）的蛋白酶体抑制剂（lactacystin）对第二代星形胶质细胞进行短期（12h）急性干预处理,应用免疫荧光及Westernblot检测星形胶质细胞cyclinD1和CDK4表达的水平。结果：纯化传代的皮质星形胶质细胞经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光鉴定,其阳性率可达99％;lactacystin2和4μmol·L^-1可诱导星形胶质细胞cyclinDl和CDK4表达的下降,与对照组相比差异有显著统计学意义（P〈0．01）。结论：一定程度蛋白酶体活性抑制可诱导培养的星形胶质细胞cyclinD1和CDK4表达的减少,从而影响胶质细胞细胞周期,促进胶质细胞分化。提示蛋白酶体功能障碍后可能通过影响胶质细胞细胞周期来参与阿尔茨海默病的病理改变。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向GABA能神经元分化

目的研究骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体外向γ-氨基丁酸（GABA）能神经元方向的分化。方法大鼠股骨骨髓分离出BMSCs,培养传代,通过10%胎牛血清（FBS）、20 ng/ml表皮生长因子（EGF）和改良Eagle培养基（DMEM/F12）预诱导24 h,随之加入含10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、10 ng/ml骨形成蛋白-2（BMP-2）和10 ng/ml脑源性神经营养因子（BDNF）作用48 h后,再以10μmol/L全反式维甲酸（ATRA）培养48 h,最后用40 mmol/L KCl刺激15 min完成诱导分化。对照组用10%FBS和DMEM/F12培养不添加任何诱导因子。形态学观察和Western blot对分化后的细胞进行鉴定分析。结果实验组细胞在形态学上表现出典型的神经元样细胞形态,对照组无明显变化;Western blot分析知实验组Ⅰ和实验组Ⅱ都有分化为GABA能神经元的趋势,但实验组Ⅱ的分化率高于实验组Ⅰ。结论BMSCs可在体外分化为GABA能神经元。     

两种诱导骨髓间充质干细胞向GABA能神经元分化的比较

目的 比较两种体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向γ-氨基丁酸(GABA)能神经元分化的效果.方法 从SD大鼠股骨骨髓中分离出BMSCs,进行培养、鉴定.用两种不同的方法进行诱导,方法一设为对照组:碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、全反式维甲酸(ATRA)诱导;方法二设为实验组:ATRA、N5,O2'-二丁酰腺苷3'∶5'-环磷酸(Bt2环磷腺苷)(Bt2CAMP)诱导.对分化细胞进行形态学观察和免疫荧光染色.结果 两组细胞均出现类似神经细胞的形态变化,实验组细胞变化更明显.两组细胞均能表达nestin和GABA 能神经元标记GAD-67,对照组与实验组表达GAD-67的阳性率分别为33.13％±5.12％和41.06％±6.32％,两组相比较具有统计学意义(P＜0.05).结论 实验组定向分化为GABA能神经元的效率高于对照组.