Fe3O4 纳米化颗粒标记人羊膜间充质干细胞的合适条件

目的:Fe3O4 纳米化颗粒是近来发现的活体示踪剂,由于其毒性可导致标记细胞死亡,寻找合适的浓度进行细胞标记已成为活体示踪的关键.实验以人羊膜间充质干细胞作为靶点,探讨Fe3O4 纳米化颗粒标记的合适条件.方法:实验于2007-08在郑州大学完成.①细胞来源及颗粒:人羊膜间充质干细胞由郑州大学第一临床医学院神经外科杨波教授自健康产妇胎盘羊膜中提取,产妇对实验知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准.Fe3O4 纳米颗粒由美国Sigma公司生产,商品名:菲立磁,批号094k0788.转染剂多聚左旋赖氨酸购自大连宝生生物公司,批号033K4351.②实验方法:向人羊膜间充质干细胞加入含10%胎牛血清、20μg/L碱性成纤维生长因子的DMEM/F12培养基,置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,待细胞达80%～90%融合时胰酶消化传代.取传至第3代的细胞,放入含DMEM/F12培养基的10 mL培养瓶中,密度调整为1×109 L-1.设立3组:单纯Fe3O4组分为4个亚组,即向培养基中分别加入终浓度为20,30,40,80 mg/L的Fe3O4纳米颗粒;Fe3O4 多聚左旋赖氨酸组分为4个亚组,即向培养基中分别加入上述终浓度Fe3O4纳米颗粒后,再加入1.5 mg/L多聚左旋赖氨酸;培养基对照组,仅加入DMEM/F12培养基.各组细胞标记12 h后,均更换为DMEM/F12培养基培养3周.③实验评估:分别于标记后12 h、36 h、1周和3周,普鲁士蓝染色检测Fe3O4纳米颗粒进入细胞情况,锥虫蓝染色检测细胞活性.结果:①Fe3O4 纳米颗粒标记人羊膜间充质干细胞的效果:终浓度为20 mg/L的Fe3O4纳米颗粒细胞标记率为60%,终浓度为30,40,80 mg/L的Fe3O4纳米颗粒细胞标记率均为100%.单纯Fe3O4组可见少量蓝染的Fe3O4纳米化颗粒分散于细胞浆内,Fe3O4 多聚左旋赖氨酸组蓝染颗粒明显增多,部分聚集成团.②标记后细胞活性测定:与培养基对照组比较,当Fe3O4终浓度为20,30 mg/L时,单纯Fe3O4组、Fe3O4 多聚左旋赖氨酸组细胞活性均无明显变化(P > 0.05);当Fe3O4终浓度升高至40,80 mg/L时,上述2组细胞活性均显著降低(P < 0.05).结论:①与多聚左旋赖氨酸混合,能够使进入细胞内的Fe3O4纳米颗粒增多,从而加强细胞标记效果.②30 mg/L Fe3O4纳米颗粒细胞标记率可达100%,且该浓度不影响人羊膜间充质干细胞的生物活性.③30 mg/L Fe3O4纳米颗粒联合多聚左旋赖氨酸是标记人羊膜间充质干细胞的合适条件.     

分化人脑胶质瘤干细胞的放疗耐受性

目的:比较不同剂量的放射治疗对人脑胶质瘤干细胞及其分化的胶质瘤细胞的杀灭作用,探讨胶质瘤干细胞与放疗耐受的相关性.方法:分离、培养并纯化人脑胶质瘤干细胞,并同时诱导纯化的肿瘤干细胞向胶质瘤细胞分化,对人脑胶质瘤干细胞及其分化后的胶质瘤细胞分别以0、2、3、5、8、12 Gy的6MVX线照射后,继续培养72 h,采用MT...     

海洋单细胞海藻体外对人脑胶质瘤干细胞生物学活性的影响

背景：海藻具有广阔的药理活性前景,加强其研究对有目的进行应用开发有重要的指导意义。 目的：观察海洋单细胞海藻在体外对人脑胶质瘤干细胞生物学活性的影响。 方法：以酶消化法培养人脑胶质瘤干细胞,流式细胞分选出CD133阳性细胞,细胞传代获得第3代细胞。流式细胞仪检测海洋单细胞海藻作用前后细胞CD133表达变化,免疫组织化学检测贴壁细胞巢蛋白及胶质纤维酸性蛋白的表达。实验组分别加入不同质量浓度的海洋单细胞海藻,阴性对照加不含药的PBS,将稀释成4,6,8,10 g/L的海洋单细胞海藻加入细胞培养液中并作用24,48,72 h,流式细胞仪检测胶质瘤干细胞生长周期,应用酶标仪检测细胞生长抑制情况。 结果与结论：随着浓度和时间的增加,与对照组相比倒置显微镜下可见实验组胶质瘤干细胞不易聚团成球,出现贴壁分化,并逐渐明显;加药后胶质瘤干细胞CD133表达量明显减少;出现的贴壁细胞免疫组织化学染色巢蛋白及胶质纤维酸性蛋白表达阳性;流式细胞仪检测显示,停滞在S、G2/M期细胞数增加,而G0/G1期细胞数减少;随着浓度和时间的增加,胶质瘤干细胞增殖明显抑制,与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05~0.01)。提示海洋单细胞海藻能够抑制人脑胶质瘤干细胞的增殖,并促进其分化,且作用具有浓度和时间依赖性。     

亚甲蓝/光化学法灭活病毒对血浆成分的影响

背景：对血液进行病毒灭活是保障安全输血的措施之一,亚甲蓝/光化学法灭活人血浆中病毒的效果已被证实,但其对血浆成分影响的报道很少。 目的：观察亚甲蓝光化学法病毒灭活血浆对血液成分结构和功能的影响。 方法：随机选择40份采血后6 h内400 mL全血制备的新鲜血浆称质量留样,然后与亚甲蓝病毒灭活过滤器无菌连接,亚甲蓝的终浓度在0.9~1.3 μmol/L。将加入亚甲蓝的血浆置入4 ℃病毒灭活箱的搁架上,摆动频率60次/min,利用32 000~ 38 000Lx光照强度的可见光4 ℃照射35 min,将光照后的血浆通过病毒灭活过滤器滤除亚甲蓝和残余白细胞,混匀后留样10 mL,立即置于-80 ℃冰箱冻存。检测照射前后样品的血浆量、亚甲蓝浓度、FⅧ∶C、FⅤ∶C、VWF、Fib含量的变化。 结果与结论：血浆病毒灭活后血浆容量、FⅧ∶C、FⅤ∶C、VWF、Fib的回收率分别为(96.39±1.73)%、(82.55±9.25)%、(81.03±15.27)%、(93.25±6.17)%、(81.61±14.25)%。亚甲蓝光化学法灭活血浆病毒对血浆中大多数成分的影响不明显,可以满足临床安全输血的需求。     

阿替洛尔对羊急性心肌缺血后心室复极离散度的影响

目的研究β-受体阻滞剂阿替洛尔(atenolol)对急性心肌缺血后心室复极空间离散度的影响。方法本实验于1998—2002在Charles Sturt University医学院心血管病研究室完成。20只绵羊随机分成对照组和阿替洛尔组。结扎左冠状动脉的钝缘支诱导急性心肌缺血,同时在缺血区和非缺血区的64个心外膜位点描记单极心电图,从心外膜心电图上测量激动-恢复间期(activation-recovery intervals,ARI),最长和最短的ARI的差值定义为ARI离散度。结果阿替洛尔组缺血面积小于对照组[(13±2)%比(19±3)%,P<0.05];对照组ARI离散度在冠状动脉结扎后30、60和90min分别增加(18±21)、(27±21)和(16±10)ms(P<0.01),而在阿替洛尔组ARI的离散度无显著增加。结论阿替洛尔可抑制羊缺血诱导的心室复极空间离散度的增加。     

量子点标记神经生长因子纳米化颗粒修饰羊膜间充质干细胞移植治疗大鼠实验性脑损伤

目的:量子点是由Ⅱ-Ⅵ族元素或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的纳米颗粒,因三维上受到量子限制而表现出独特的光学特征,其标记的神经生长因子纳米化颗粒由于是纳米级,易通过细胞生物膜.实验观察负载此纳米颗粒的羊膜间充质干细胞移植治疗大鼠脑损伤的效果.方法:实验于2007-01/10在郑州大学完成.①材料:SPF级健康成年Wistar大鼠40只,按体质量编号分为4组:神经生长因子细胞组、常规细胞组、损伤模型组、培养基对照组,10只/组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.羊膜间充质干细胞来自健康产妇胎盘羊膜,产妇对实验知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准.量子点神经生长因子纳米粒由兰州大学功能有机分子化学国家重点实验室协助构建.②实验方法;向羊膜间充质干细胞中加入含10%胎牛血清、20 μg/L碱性成纤维生长因子的DMEM/F12培养基,置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,待细胞达80%～90%融合时胰酶消化传代.取传至第3代细胞,分别加入终浓度为20,40,60 μg/L的量子点标记神经生长因子纳米粒进行修饰处理72 h,并设立空白对照和空载量子点对照.4组大鼠均采用Feeney自由落体法建立脑损伤模型,神经生长因子细胞组于大鼠损伤部位注入经40 mg/L量子点标记神经生长因子纳米粒修饰的羊膜间充质干细胞悬液10 μL(约4.0×108 个细胞),常规细胞组注入等量单纯量子点标记的羊膜间充质干细胞悬液,培养基对照组注入等量DMEM/F12细胞培养基,损伤模型组不给予移植操作.③实验评估:经量子点标记的神经生长因子纳米粒修饰后,MTT法检测细胞活性,荧光显微镜观察量子点在细胞内的分布,免疫细胞化学鉴定细胞分化.细胞移植后对各组大鼠运动及感觉功能进行评分,免疫组织化学染色及荧光显微镜观察量子点荧光化羊膜间充质干细胞在脑内存活分化和迁移情况.结果:①细胞生长率:培养72 h后与空白对照和空载量子点对照细胞比较,20,40,60 μg/L量子点标记的神经生长因子纳米粒组细胞生长率均呈增长趋势,40 μg/L时细胞无明显生长抑制,达60 μg/L时增长有所减慢.②体外量子点分布:荧光显微镜连续观察羊膜间充质干细胞.约6 h后开始摄入量子点标记的神经生长因子纳米粒,随着时间延长摄入量逐渐增加,于32 h荧光强度达高峰.③体外免疫细胞化学鉴定:经量子点神经生长因子纳米粒修饰的羊膜间充质干细胞表达神经元烯醇化酶和神经丝蛋白,向神经元方向分化,但不表达胶质纤维酸性蛋白.④神经行为学检测结果:细胞移植后24h,各组神经行为学各项指标评分均基本相似(P＞0.05);移植后10,20 d,损伤模型组与培养基对照组无明显变化,神经生长因子细胞组、常规细胞组运动及感觉功能各项评分均显著降低(P＜0.05),且神经生长因子细胞组下降幅度明显强于常规细胞组(P＜0.05).⑤免疫组织化学和荧光检测结果:经量子点神经生长因子纳米粒修饰的羊膜间充质干细胞在脑组织损伤区存活,并向周围迁移.结论:量子点是一种较好的细胞示踪剂,负载其标记的神经生长因子纳米化颗粒的羊膜间充质干细胞移植能够改善脑损伤大鼠神经功能.     

电刺激小脑顶核后脑外伤患者脑血流和脑损害变化

目的　探讨小脑顶核电刺激 (FNS)对脑外伤患者脑血流速度 (Vm)和血清髓鞘碱性蛋白 (MBP)的影响。方法　30名健康者为正常对照组 (A)。 6 0例脑外伤患者 ,随机均分为B(外伤对照组 )和C(刺激治疗组 )两组。用FNS对C组实施治疗。应用经颅多普勒超声动态监测A、B和C三组患者ACA、MCA的Vm。分别于外伤后第 1、3、5天检测B、C两组血清MBP。结果　ACA和MCA的Vm正常值分别为 ( 4 5 .4± 6 .1)cm/s和 ( 5 4.3± 5 .7)cm/s ;B组外伤后呈现持续性低Vm ,ACA和MCA的Vm分别为 ( 35 .9± 5 .6 )cm/s和 ( 4 5 .5± 6 .5 )cm/s ;C组FNS后Vm明显升高 ,分别为 ( 4 2 .8± 6 .8)cm/s和 ( 5 1.9± 6 .2 )cm/s。MBP正常值为 ( 1.0 2± 0 .46 ) μg/L。外伤后第 1天 ,B、C两组MBP明显升高 ,B组于第 5天达高峰 ,而C组MBP于第 5天则明显下降。结论　外伤后Vm降低 ,血清MBP升高。FNS可明显提高脑外伤后Vm ,改善脑循环 ,降低MBP ,减轻脑损害     

人羊膜间充质干细胞移植对荷瘤鼠C6胶质瘤生长的抑制

背景:实验室前期课题成果显示,脐血或羊膜间充质干细胞具有亲肿瘤及抑瘤特性。目的:探讨人羊膜间充质干细胞对C6胶质瘤细胞生长的抑制作用。设计、时间及地点:细胞学体内对照观察,于2008-06/09在郑州大学微生物与免疫教研室完成。材料:胎盘来源于郑州大学一附院妇产科健康剖宫产产妇,C6胶质瘤细胞株由北京神经外科研究所惠赠,10只BALR/c裸鼠由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。方法:无菌条件下取胎盘,分离部分羊膜,体外分离培养人羊膜间充质干细胞,传至第3代用于实验。10只裸鼠背部双侧皮下注射含3×106个C6胶质瘤细胞的DMEM/F12培养基,建立双侧荷瘤鼠模型。成功造模后,模型对照组于裸鼠左侧皮下注射DMEM/F12培养基50μL,细胞移植组于同一裸鼠右侧皮下注射含2×106个羊膜间充质干细胞的等量DMEM/F12培养基。主要观察指标:肿瘤生长情况,周围组织浸润及新生血管形成等病理学观察,免疫组化法检测肿瘤中细胞周期素D1的表达。结果:细胞移植后14,21d,细胞移植组肿块体积明显小于模型对照组(F=54.127,P<0.05)。模型对照组瘤体呈结节状,部分肿瘤组织中心有坏死现象,内部有新生血管形成,肌层及皮肤浸润较明显,已达腹膜;细胞移植组瘤体分叶较少,无新生血管形成,仅有局部的皮肤浸润,未见肌层浸润。模型对照组细胞周期素D1蛋白呈阳性表达,而细胞移植组表达阳性率较低。结论:人羊膜间充质干细胞可明显抑制荷瘤鼠C6胶质瘤细胞的生长,同时可抑制细胞周期素D1蛋白的异常表达。     

人脐带间充质干细胞对神经胶质瘤生长的抑制

背景:Wnt信号通路是决定肿瘤发生发展的关键通路。研究表明Dickkopf-1分泌蛋白能阻断Wnt信号向胞内的传递。目的:通过共培养体外观察人脐带间充质干细胞对C6胶质细胞瘤生长的抑制作用及其相关机制。方法:采用不同浓度的人脐带间充质干细胞条件培养液培养C6胶质瘤细胞。分别使用CCK-8和流式细胞仪对细胞增殖和细胞周期进行观察,以Western blotting法检测C6细胞中β-catenin和c-Myc的表达水平。酶联免疫吸附法检测人脐带间充质干细胞分泌Dickkopf-1的水平。利用抗Dickkopf-1的抗体中和人脐带间充质干细胞条件培养液中的Dickkopf-1,检测抗体中和后的效应。结果与结论:人脐带间充质干细胞能够抑制C6细胞的生长,将细胞周期阻滞在G0-G1期。在人脐带间充质干细胞条件培养液的作用下,C6细胞中β-catenin和c-Myc的表达下调。分泌蛋白Dickkopf-1的水平与人脐带间充质干细胞条件培养液的浓度呈正相关。随着条件培养液浓度的增加,人脐带间充质干细胞对C6细胞增殖的抑制效应增强。然而,当抗Dickkopf-1的抗体中和人脐带间充质干细胞条件培养液中的Dickkopf-1后,抑制作用减弱。结果表明,人脐带间充质干细胞通过分泌的一些可溶性因子如Dickkopf-1,能够抑制胶质瘤细胞的生长。