自制毛囊再生乳膏对小鼠皮肤创面毛囊再生的影响

背景 创面愈合时无毛囊等皮肤附属器再生是创面修复领域的难题.小分子化合物能够调控细胞增殖与分化,促使成熟体细胞再分化为具有增殖能力的前体细胞或其他细胞系,还能够靶向调控信号通路与代谢进程,是一种促进皮肤及附属器原位再生的安全有效的方法.目的 本研究拟通过小分子化合物组合探索其促进创面毛囊再生的效果及机制.方法 选取C57BL/6小鼠45只,雌性,体质量(20±5)g.以打孔器配合眼科剪制作小鼠背部双侧皮肤全层缺损创面动物模型,左侧创面为用药侧,右侧创面为对照侧.以负载CHIR-99021、Purmorphamine、Tofacitinib和SJ000291942四种小分子化合物的凡士林药膏(以下简称毛囊再生乳膏)连续涂抹小鼠背部皮肤全层缺损创面28 d,通过常规HE染色、Masson染色以及免疫组织化学染色分析创面愈合和毛囊再生情况.结果 用药组与对照组小鼠背部创面愈合率无统计学差异,提示毛囊再生乳膏对创面愈合速度无显著影响.HE染色发现,毛囊再生乳膏处理创面14 d左右,用药组创面表皮形成毛囊上皮芽基细胞,真皮中出现毛乳头细胞.28 d可见用药组创面中大量毛囊样结构,免疫荧光染色证实其表达毛囊细胞特征性标志物CK5、CK15、CK17、Noggin,而对照组创面毛囊再生数量极少,用药组与对照组新生毛囊数量差异有统计学意义(17 vs 4,P<0.001).Masson染色可见用药组与对照组创面胶原纤维密度及排列方式无明显区别,提示毛囊再生乳膏可诱导纤维瘢痕中毛囊再生.免疫组织化学染色显示用药侧创面新生的表皮细胞、毛囊上皮芽基细胞、新生毛乳头细胞中Wnt信号通路和Shh信号通路相关标志物β-catenin、Shh、Gli1显色明显,表明毛囊再生乳膏可能通过激活Wnt、Shh信号通路促进创面毛囊再生.结论 本研究自制的毛囊再生乳膏能够通过调控毛囊生长发育过程中的Wnt信号通路和Shh信号通路促进创面愈合时毛囊再生,有望转化为创面治疗药物应用于临床.     

不同深度烫伤大鼠创面组织中β1整合素、整合素连接激酶的表达

[目的]通过观察不同烫伤程度大鼠在烫伤24 h后β1整合素和整合素连接激酶(ILK)的表达,探讨β1整合素和ILK在创面愈合中的作用.[方法]将32只sD大鼠分别造成Ⅰ、浅Ⅱ、深Ⅱ度和Ⅲ度烫伤,伤后24 h取创面组织标本,制作切片,分别进行HE染色以及整合素β1、ILK免疫组化染色,观察不同烫伤程度创面整合素β1和ILK的表达与定位.[结果]Ⅰ度烫伤大鼠表皮基底层和皮肤附属器可见明显整合素β1和ILK表达,其中ILK在皮肤附属器的表达较整合素β1更为显著;浅Ⅱ度组织创面,残留的基底层和健全的皮肤附属器周围有整合素β1和ILK表达,其中ILK在皮肤附属器的表达较整合素β1更为显著,而整合素β1主要在毛囊表达;深Ⅱ烫伤创面仅真皮深层健存的皮肤附属器中有整合素和ILK阳性细胞表达;Ⅲ度烫伤创面未见整合素β1和ILK阳性.[结论]整合素β1和ILK具有相似的局限表达模式并与大鼠烫伤程度密切相关,提示ILK可能介导整合素的胞内的信号通路,与整合素β1共同参与创面愈合过程.     

成人不同部位角质形成细胞的生物学特性比较

目的:观察成人不同部位角质形成细胞的生物学差异,探讨用来构建自体组织工程皮肤的最佳表皮细胞来源. 方法: 体外分离培养成年男性头皮、躯干、下肢及包皮来源的角质形成细胞,分别利用绘制细胞生长曲线、3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)掺入、流式细胞仪检测等方法比较细胞在生长增殖、细胞周期及代谢等方面的生物学差异. 结果: 在细胞的生长增殖及DNA合成代谢方面,头皮与包皮来源的角质形成细胞之间无统计学差异(P>0.05),躯干与肢体来源的细胞之间亦无统计学差异(P>0.05),但前两者均高于后两者(P<0.05);细胞周期分析表明,头皮及包皮来源的角质形成细胞S期比例高于躯干及肢体组. 结论: 头皮及包皮组织来源的角质形成细胞可作为构建自体组织工程皮肤的表皮细胞来源.     

创面愈合过程中创缘表皮干细胞的再分布

目的：研究皮肤干细胞在全层皮肤创面愈合过程中的分布与增殖分化特征,以及该特征在创面愈合过程中的作用。方法：20只Wistar大鼠背部各制备4个面积为2．54cm^2的全层皮肤缺损创面,将创面随机分为2组,即银锌霜治疗组（40个创面）,空白对照组（40个创面）。分别于伤后3天、1周、2周和3周以组织学检查动态观察各组治疗效果,并以β1整合素、角蛋白19（K19）免疫组化法检测表皮干细胞在创面愈合过程中的分布情况。结果：两组创面愈合率在银锌霜组为80％（32／40）,对照组为60％（24／40）。两组创面肉芽组织于各时相点均未见β1整合素、K19阳性细胞出现,但于创缘表皮的棘层或颗粒层出现了散在的β1整合素和K19同时染色阳性细胞,且越接近创面这些阳性细胞更加密集,组织学上与基底层的阳性细胞无直接联系。其数量随着创面的缩小渐渐增加,直至创面愈合。创面上皮化后,这些阳性细胞逐渐减少,并随着愈合创面表皮脚的出现而消失;而感染创面的阳性细胞数量明显少于未感染创面。结论：表皮干细胞能动的参与创面的修复,创缘表皮干细胞再分布的主要功能可能是促进创面再上皮化。     

毛囊干细胞的体外研究

毛囊是皮肤的重要附属器官,其生长具有周期性.这与其中存在的毛囊干细胞的功能密不可分.毛囊干细胞具有强大的增殖潜能及多向分化能力,可以分化成毛囊及表皮的多种细胞.它不仅对维持毛发的周期性生长有重要作用,同时也是表皮及皮肤附属器官再生的重要细胞来源.目前对成人毛囊干细胞的定位还没有明确的结论,多数的在体研究认为它可能存在于毛囊膨出部(立毛肌插入点附近)和外根鞘的最外层,其特点是体积小,分化程度低,具有慢周期性,特异性表达β1整合素和角蛋白19型(Keratin 19,K19).     

人眼睑组织来源的成纤维细胞作为饲养层细胞构建人口腔黏膜上皮细胞片层的研究

目的：探讨人眼睑组织来源的成纤维细胞作为饲养层细胞代替鼠源饲养层细胞在体外培养人口腔黏膜上皮细胞的可行性。方法：通过酶消化法从人眼睑组织中分离成纤维细胞传代培养，取P5代成纤维细胞通过丝裂霉素C方法制备饲养层细胞，将其制备成的饲养层细胞用来培养商品化人口腔黏膜上皮细胞。通过罗丹明染色观察其细胞克隆形成率；HE染色观察细胞片层的结构；免疫荧光检测特征蛋白P63、β1-integrin的表达。结果：人眼睑组织来源的成纤维细胞在体外具有较强的增殖能力，高表达成纤维细胞特异性标志性蛋白CD90，培养的人口腔黏膜上皮细胞呈克隆样生长，细胞克隆形成率约为2.2%，并将其构建成3～4层口腔黏膜细胞片层，且高表达上皮细胞标志物P63及β1-integrin。结论：人眼睑组织来源的成纤维细胞可以作为饲养层细胞构建人口腔黏膜上皮细胞片层，为临床应用提供一种新的人源化饲养层工具细胞。     

人各段毛囊上皮细胞培养的增殖力比较

目的 比较毛囊球部和隆突部上皮细胞的增生能力。方法 采用０．５％分离酶将人正常头皮毛囊上皮组织与真皮组织分离,再将毛囊上皮细胞分成上段、下段和球部,然后进行传代培养。结果：上段细胞传代次数最多,形成的克隆数量多,细胞生长活力最强,而球部细胞的生长能力最差,下段细胞有少数能形成进行性生长克隆。结论：毛囊上段细胞的增生能力最强,支持隆突激活假说,即毛囊干细胞定位于隆突部。     

β1整合素-绿色荧光蛋白融合基因在角膜上皮细胞的功能性表达

目的:将β1整合素-绿色荧光蛋白(GFP)融合基因转染兔角膜上皮细胞并检测其对各细胞外基质蛋白的黏附能力。方法:构建β1整合素-GFP融合基因真核细胞重组表达质粒,并将其转染至兔角膜上皮细胞。利用RT-PCR、Western印迹和荧光显微镜观察融合基因表达,同时检测转染细胞的增殖情况及对各细胞外基质蛋白的黏附能力。结果:成功将β1整合素-GFP融合基因转染兔角膜上皮细胞并使其过表达;转染β1整合素对角膜上皮细胞增殖无明显影响,但使细胞对各细胞外基质蛋白的黏附能力明显增高。结论:建立了功能性β1整合素-GFP过表达的角膜上皮细胞模型,为研究β1整合素基因在角膜上皮细胞的功能及角膜细胞移植奠定基础。     

β1整合素与卵巢癌细胞凋亡关系的实验研究

目的 研究β1整合素及纤维黏连蛋白在人卵巢癌HO-8910细胞增殖、凋亡中的作用及其意义.方法 以培养在包被纤雏黏连蛋白底物上的人卵巢癌HO-8910细胞为靶细胞,用不同浓度抗β1整合素单克隆抗体阻断β1整合素与纤维黏连蛋白的相互作用.用MTT法测定细胞增殖抑制率;吖啶橙(acridine orange,AO)染色观察细胞凋亡的形态学变化;流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡率.结果 抗β1整合素单克隆抗体能抑制人卵巢癌HO-8910细胞的增殖,并有明显的时间和剂量依赖性(P＜0.05).荧光显微镜观察到细胞凋亡的形态学改变;流式细胞术检测结果显示实验组S期上升,细胞凋亡率上升.结论 抗β1整合素单克隆抗体可抑制卵巢癌细胞的增殖,β1整合素抗体与卵巢癌细胞凋亡密切相关,阻断β1整合素与其特意配体纤维黏连蛋白的相互作用可诱导卵巢癌细胞凋亡.     

荷负电气溶胶对大鼠烫伤创面表皮细胞生长因子和β1整合素表达的影响

目的研究荷负电气溶胶(aerosol bioelectricity, ABE)对大鼠烫伤创面愈合过程中表皮细胞生长因子(epidermal growth factor, EGF)和β1整合素表达的影响,探讨荷负电气溶胶促进创面愈合的作用机制.方法制作SD大鼠深Ⅱ度烫伤模型,将40只鼠随机分为治疗组(n1=20)和对照组(n2=20).治疗组应用荷负电气溶胶治疗,每次1.5 h,每天2次,直至创面愈合;对照组不作荷负电气溶胶治疗.采用免疫组织化学和图像分析方法,检测创面愈合过程中EGF和β1整合素表达水平.结果创面平均愈合时间治疗组为(7±1.15) d,对照组为(9±1.34) d,治疗组创面愈合时间明显提前(P<0.01).免疫组化显示,治疗组伤后第2天可见EGF、β1整合素开始表达于基底细胞和毛囊细胞,第5天表达显著,第6～9天持续高水平表达;对照组于第3天开始表达,第7天表达显著,第8～10天持续高水平表达.治疗组表达水平明显高于对照组(P<0.01).创面愈合后两组表达逐渐恢复至正常水平,差异无显著性意义(P>0.05).结论通过上调EGF和β1整合素的表达而促进细胞增殖可能是荷负电气溶胶促进烧伤创面愈合的机制之一.     

山羊卵泡大小对卵母细胞体外发育能力的影响

目的比较不同大小山羊卵泡的卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎发育的能力。方法收集不同大小山羊卵泡的卵母细胞,分3组进行体外培养。Ⅰ组：卵泡直径≥5.0mm;Ⅱ组：卵泡直径3.0～4.9mm;Ⅲ组：卵泡直径〈3.0mm。观察各组卵母细胞体外成熟率、体外受精率、卵裂率及囊胚形成率。结果3组卵母细胞体外成熟率与受精率差异无统计学意义（均P〉0.05）。Ⅲ组卵母细胞的卵裂率及囊胚形成率分别为53.8%和28.6%,均显著低于Ⅰ组和Ⅱ组（均P〈0.01）。结论在进行山羊未成熟卵体外成熟培养时,卵泡直径≥3mm的卵母细胞体外发育潜能较卵泡直径〈3mm的卵母细胞好。     

β-连接蛋白和细胞周期蛋白D1在乳房外Paget病中的表达

目的：探讨β-连接蛋白（β-catenin）和细胞周期蛋白D1（cyclinD1）在乳房外Paget病（EMPD）中的表达及两者表达的关系。方敞：应用免疫组化方法检测32例EMPD组织和30例湿疹组织中β-连接蛋白和细胞周期蛋白D1的表达。结果：EMPD组织中β-catenin异位表达率为75．00％,显著高于湿疹组织。cyclinD1在乳腺外Paget病组织中的表达率为90．63％,而在湿疹组织中的表达率为40．00％。β—catenin呈正常膜表达的组织中,有46．67％呈cyclinD1过度表达;而β—catenin异常表达的组织中,有84．38％cyclinD1为过度表达。β—catenin在EMPD的异位表达率与cyclinD1表达呈正相关。结论：β—catenin的异位表达激活了cyclinD1的过度表达,引起了细胞增殖和分化失控,在EMPD的发生中可能起着重要作用。     

豚鼠卵巢组织片和分离的窦前卵泡玻璃化冷冻效果比较

目的：比较分析不同玻璃化冷冻配方对豚鼠卵巢组织片和单个窦前卵泡形态、存活率及体外发育能力的影响。方法：取5周龄雌性豚鼠卵巢,实验分新鲜对照组、组织片A液毒性组、组织片B液毒性组、卵泡A液毒性组和卵泡B液毒性组,及相应的冻融组,即组织片A液冻融组、组织片B液冻融组、卵泡A液冻融组、卵泡B液冻融组,共9组行毒性试验和冷冻保存。各组卵巢组织片行HE染色形态学观察,分离窦前卵泡经锥虫蓝染色活力测试并行体外培养。结果：A液冻融组和B液冻融组豚鼠卵巢组织片HE染色光镜观察可见大部分卵泡形态正常,A液组和B液组异常窦前卵泡数与新鲜对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）;在分离的窦前卵泡锥虫蓝染色活力测试中,冻融卵巢组织片A组的卵泡复苏率（为66．1％）显著低于（P〈0．05）冻融卵泡B液组（为78．5％）和新鲜对照组（为87．5％）;其余组别之间差异无统计学意义。体外培养卵泡发育情况组织片冷冻组比卵泡冷冻组差,以A液组尤甚,第6天存活卵泡数目不足（为20．0％）,与新鲜对照组（为60．0％）及卵泡B液冻融组（为50．0％）相比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：玻璃化冷冻法能较好地冷冻保存豚鼠卵巢组织片和分离的窦前卵泡,而单个豚鼠窦前卵泡玻璃化冷冻优于卵巢组织片的玻璃化冷冻;B液较A液更适合豚鼠卵巢卵泡的玻璃化冷冻保存。窦前卵泡的体外培养证明玻璃化冷冻复苏卵泡具有一定的继续发育能力。     

来曲唑联合HMG对多囊卵巢综合征患者促排卵的疗效观察

目的 比较来曲唑（LE）联合人绝经期促性腺素（HMG）和单用HMG对多囊卵巢综合征（polycystic ovarian system,PCOS）患者促排卵的临床效果.方法 回顾58例PCOS不孕患者58个促排卵周期,随机分为LE联合HMG组（A组）24个周期和单用HMG组（B组）34个周期,A组于月经周期第3～7天口服来曲唑2.5 mg/d,第8天肌注HMG 75 IU/d;B组于月经第3天始肌注HMG 75 IU/d,用药至卵泡成熟,肌注HCG诱发排卵.分析两组患者HCG日成熟卵泡数、子宫内膜厚度、单成熟卵泡发育率、HMG用量、临床妊娠率、流产率、多胎率、卵巢过度刺激综合征（OHSS）发生率及肥胖对妊娠的影响.结果 A组和B组患者HCG日子宫内膜厚度及临床妊娠率差异无统计学意义（P＞0.05）;比较两组HCG日优势卵泡数目、单成熟卵泡发育率及HMG用量,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 LE联合HMC和单用HMG促排卵能获得相似的妊娠率,LE联合HMG促排卵可以减少HMG药物用量,降低多胎和OHSS风险.     

不同突变型β-地中海贫血基因携带者血液学特征分析

目的探讨佛冈县中医院不同基因突变型β-地中海贫血(简称β-地贫)基因携带者的血液学特征及发生频率。方法应用反向斑点杂交技术检测β-地贫基因突变,用Sysmex血液分析仪测定病人平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞分布宽度(RDW)等血液学特征,应用SPSS统计软件,采用方差分析及多重比较对实验数据进行统计分析。结果215例β-地贫基因携带者中,杂合子213例,占99.06%,双重杂合子1例,占0.47%,纯合子1例,占0.47%。检出12种基因突变类型,以CD41-42,IVS-II-654,-28,CD17,CD27-28等突变型为主,比例分别为43.72%、26.98%、9.77%、7.44%和6.51%,5种突变占94.42%。与对照组相比,β+/β和β0/β的MCV、MCH、MCHC值均有显著降低,RDW值高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。5种主要突变位点病人的MCV、MCH、MCHC值均低于对照组,RDW值高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。215例β-地贫MCV/MCH分布情况如下:(1)MCV78 fl、MCH27 Pg:94.88%;(2)MCV80 fl、MCH27 Pg:95.35%;(3)MCV82 fl、MCH27Pg:95.82%;(4)MCV≥82 fl、MCH≥27 Pg:2.79%。结论佛冈县地贫以中国人发病率高的突变类型为主;β-地贫基因携带者血液学特征符合小细胞低色素性贫血,MCV、MCH降低时应高度怀疑地贫可能,但MCV、MCH正常时也不能排除轻型β-地贫。     

血清NSE、CA125及β2-MG测定对非霍奇金淋巴瘤疗效及预后判断的价值

目的：探讨NHL患者血清NSE、CA125及β2-MG水平对判断临床疗效和预后的价值。方法：测定46例NHL患者化疗前、后血清NSE、CA125及β2-MG,分析其与临床疗效和3年生存率的相关性。结果：（1）血清NSE增高患者化疗有效率、3年生存率低于血清NSE正常患者,差异有统计学意义（P〈0.05）;其中化疗有效患者化疗后血清NSE水平较化疗前明显降低,差异有统计学意义（P〈0.05）。（2）血清CA125增高患者化疗有效率、3年生存率低于血清CA125正常患者,差异有统计学意义（P〈0.05）;化疗有效患者化疗后血清CA125水平较化疗前明显降低,差异有统计学意义（P〈0.05）。（3）血清β2-MG增高患者化疗有效率低于血清β2-MG正常患者,差异有统计学意义（P〈0.05）;血清β2-MG增高患者与正常患者3年生存率比较,差异无统计学意义（P〉0.05）;化疗有效患者化疗后血清β2-MG水平较化疗前明显降低,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：NHL患者血清NSE、CA125及β2-MG水平与化疗敏感性及临床预后密切相关,对判断疗效和预后有重要价值。     

蜕皮甾酮对人表皮干细胞体外增殖的影响

目的观察蜕皮甾酮(EDS)对人表皮干细胞(hESCs)体外增殖的影响。方法采用中性蛋白酶-Ⅳ型胶原黏附法分离正常人包皮表皮干细胞,免疫细胞化学法检测第3代细胞β1整合素、角蛋白19(CK19)、角蛋白14(CK14)及角蛋白10(CK10)的表达以鉴定hESCs。分别用含0 mg.L-1(对照组)、10 mg.L-1(10 mg.L-1组)、20 mg.L-1(20 mg.L-1组)、40 mg.L-1(40 mg.L-1组)、80 mg.L-1(80 mg.L-1组)及160 mg.L-1(160 mg.L-1组)EDS的Ep ilife培养基作用第3代hESCs 3 d,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测酶标仪490 nm下的吸光度值,评价EDS对hESCs体外增殖的影响。结果免疫细胞化学法检测提示第3代表皮干细胞β1整合素、CK 19、CK 14的表达阳性,CK 10表达阴性。EDS作用3 d后,10 mg.L-1组、20 mg.L-1组、40 mg.L-1组、80 mg.L-1组及160 mg.L-1组吸光度均高于对照组(P<0.05);40 mg.L-1组、80 mg.L-1组和160 mg.L-1组吸光度均高于10 mg.L-1组和20 mg.L-1组(P<0.05);80 mg.L-1组吸光度高于40 mg.L-1组和160 mg.L-1组(P<0.05);其余各组间两两比较无统计学差异(P>0.05)。结论体外培养条件下EDS能促进hESCs增殖,该作用在EDS浓度为80 mg.L-1时最为显著。     

尿微量白蛋白和β2-微球蛋白在早期糖尿病肾病中的诊断价值

目的:探讨尿微量白蛋白(Malb)和β2-微球蛋白(β2-MG)在诊断早期糖尿病肾病(DN)中的价值.方法:将我院糖尿病患者根据病程分为A组和B组,选择健康人群作为对照组,检测三组尿微量白蛋白和β2-微球蛋白等水平.结果:A、B组患者BUN、Cr、Malb及β2-MG均高于对照组(P＜0.05);A组BUN、Cr、Ma...     

继发于危重症的室速风暴及其治疗

目的：观察静脉应用β-受体阻滞剂治疗室速风暴的临床疗效及其安全性。方法：2005年1月-2008年1月我院收治的室速风暴患者41例，随机分为对照组和倍他乐克干预组。其中，对照组26例患者仅于静脉应用利多卡因或胺碘酮基础上采用电复律治疗；倍他乐克干预组15例患者在上述治疗基础上静脉给予倍他乐克。结果：倍他乐克干预组终止反复室速、室颤成功率显著高于对照组（93.33％ VS 34.61％，P〈0.05），终止室速及室颤所需放电次数[（4.27±1.28）次]显著少于对照组[（7.77±3.46）次，（P〈O.05）]。倍他乐克干预组房室传导阻滞的发生率显著高于对照组（33．33％ VS 3．85％，P〈0.05）。对照组与倍他乐克干预组低血压（57．69％ VS 73.33％）及交界性或室性逸搏（61．54％ VS 73．33％）的发生率无显著差异（P〉0．05）。结论：对于继发于危重症的反复性室速和室颤应认识到有交感风暴的存在，常规治疗基础上，及时、足量地静脉注射β-受体阻滞剂治疗室速风暴是非常有效而且安全的。     

血清孕酮及血β-HCG在诊断异位妊娠中的价值

目的：探讨血清孕酮及血β-HCG在诊断异位妊娠中的价值。方法：检测62例异位妊娠患者及72例同期先兆流产患者（经保胎治疗成功者）血清孕酮及β-HCG值。结果：异位妊娠组血清孕酮及血β-HCG值明显低于先兆流产组（P〈0.05）,48小时后复测血β-HCG值,异位妊娠组β-HCG值上升〉50%占17.7%,先兆流产组β-HCG值上升〉50%占98.7%,两组比较有统计学意义（P〈0.01）。结论：血清孕酮及血β-HCG对异位妊娠及先兆流产有良好的鉴别诊断价值。