胰岛素在兔角膜碱烧伤后抗凋亡作用的初步研究

目的:研究胰岛素(Insulin,INS)对兔角膜碱烧伤后角膜组织细胞凋亡及Bcl-2表达的影响.方法:建立兔Ⅱ度角膜碱烧伤动物模型,球结膜下分别注射生理盐水(B组)和INS(C组),正常兔眼做对照(A组).用药后不同时间点取材,应用光镜、电镜及细胞凋亡原位末端标记法(TUNEL)分别检测角膜组织凋亡细胞,免疫组化法观察Bcl-2蛋白的表达和变化.结果:正常角膜上皮细胞层仅有极少量凋亡细胞,基质层及内皮细胞层几乎无凋亡细胞,Bcl-2蛋白主要表达在上皮层,基质层及内皮层亦有少量表达.C组在第7、14 d角膜TUNEL染色阳性细胞明显少于B组(P<0.01),Bcl-2蛋白表达明显多于B组(P<0.01).结论:INS可能通过增加Bcl-2蛋白表达抑制碱烧伤角膜组织细胞凋亡.     

细胞凋亡及相关基因bcl-2在大鼠角膜移植物的表达及其意义

目的 探讨细胞凋亡及其相关基因bcl-2与角膜移植急性免疫排斥反应的关系。方法 建立大鼠穿透性角膜移植模型。实验分为3组。A组：非手术基本对照组（Wistar）；B组：同基因角膜移植组（Wistar→Wistar）；C组：同种异体角膜移植组（Wistar→SD）。B、C组分别于术后不同时间（7、10和14d）取角膜植片。细胞凋亡原住末端标记（TUNEL法）检测各组角膜植片细胞凋亡情况，免疫组织化学方法（SABC法）检测植片bcl-2蛋白表达。并以A组正常大鼠角膜做对照。对染色结果采用全自动图像分析系统处理，计算阳性单位PU值。结果 正常角膜上皮细胞层仅有极少量凋亡细胞，基质层及内皮细胞层几乎无凋亡细胞；术后1周各移植组（B组，C组）角膜植片各层均可见散在细胞凋亡，与A组相比差异有显著性（P〈0．01），B组与C组差异无显著意义（P〉0．05）；与A组相比，急性排斥期B、C组角膜植片细胞凋亡均增高，且C组增高曼明显。正常角膜可见bcl-2蛋白表达，主要存在于上皮层；术后1周各移植组（B组，C组）角膜植片bcl～2蛋白表达轻度减低，与A组相比差异有显著意义（P〈0．01）；与B组同一时间点相比，急性排斥期C组角膜植片bcl-2蛋白表达明显减低（P〈0．01）。结论 细胞凋亡在角膜移植急性免疫排斥反应中发挥重要作用，调控基因bcl-2可作为判断急性免疫排斥反应的重要指标。     

家兔PRK术后角膜超微结构的实验研究

目的　评价实验性家兔不同屈光度 Ｐ Ｒ Ｋ 术后角膜创面愈合的过程。方法　应用 Ｓ Ｖ Ｓ Ａ Ｐ Ｅ Ｘ Ｐ Ｌ Ｕ Ｓ 型准分子激光治疗系统对６ 只家兔双眼进行 Ｐ Ｒ Ｋ 术。结果　透射电镜观察：术后３ ｄ ,角膜上皮细胞１ 层或２ 层覆盖切削区,角膜前基质胶原纤维排列紊乱。术后３０ｄ ,可见角膜上皮细胞增生,体积增大,细胞由正常的５ 层或６ 层增加到７ 层或８ 层;上皮细胞间可见桥粒连接,基底膜形成,但有不连续现象;上皮基底细胞于基底膜之间可见半桥粒。术后１００ｄ ,角膜上皮细胞基本恢复正常。扫描电镜观察：术后１００ｄ , 上皮细胞界限分明, 上皮明亮细胞较多,但微绒毛、微皱褶相对减少。结论　 Ｐ Ｒ Ｋ 术后１００ｄ 角膜组织结构基本正常,但仍有组织薄弱处和特殊性改变。 Ｐ Ｒ Ｋ 术后家兔角膜上皮微绒毛、微皱褶相对减少,可能是临床上 Ｐ Ｒ Ｋ 术后部分患者近期角膜干燥的原因之一。     

以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养角膜缘上皮细胞的实验研究

目的 建立以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养兔角膜缘上皮细胞的培养方法 ,观察细胞生物学特性。方法 用含5%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养液对兔角膜缘上皮细胞进行体外组织块法原代培养,待细胞形成单层后,传代种植于去上皮浅层角膜载体上。每天用倒置显微镜观察培养细胞的形态及生长情况,电镜观察培育细胞的超微结构并采用HE染色和抗增殖细胞核抗原（anti-proliferating cell nuclear antigen,PCNA）单克隆抗体免疫细胞化学染色对生长于去上皮浅层角膜载体上的细胞进行检测。结果 原代培养时,48小时后可见组织块边缘有细胞生长游出,10天左右,细胞汇合成单层。传代种植于载体上,细胞24小时贴壁伸展,第5天可见部分区域细胞逐渐融合成片,11天左右细胞形成良好单层。细胞呈卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接;免疫细胞化学染色显示部分细胞PCNA单克隆抗体呈阳性反应。结论 含5%胎牛血清的DMEM/F12培养液适合角膜缘干细胞的体外培养,并能成功地在去上皮角膜浅层载体上培养出类似生理状态下的角膜上皮细胞。     

实验性光损伤大鼠视网膜光感受器细胞凋亡的研究

目的：观察较强可见光所致大鼠视网膜光感受器细胞凋亡现象，探讨视网膜光化学损伤发病机制。方法：取健康成年SD大鼠50只，随机分成正常对照组（CON）、光损伤后1天（D1）、3天（D3）、5天（D5）、7天（D7）组，每组10只。各组大鼠在12h明12h暗环境中饲养7天，然后暗适应36h。D1、D3、D5、D7组大鼠采用4178Lux照度的可见光进行12h间歇光照射，连续3天，总计36h，然后在正常环境中分别饲养1天、3天、5天、7天。10％水合氯醛麻醉大鼠，摘取眼球，制备视网膜石蜡切片及超薄切片，行HE染色、TUNEL法标记及重金属染色，光镜、透射电镜观察，MIAS-1000图像分析系统检测。结果：正常大鼠视网膜组织结构层次清楚，外核层排列规则，染色质电子密度均匀。TUNEL法染色阴性。光照后1天，外核层开始变薄，其厚度减少11.88％。核染色质开始固缩。可见少量TUNEL法标记的阳性细胞核，染色质向核膜下聚集，呈现典型的凋亡细胞表现。光照后3天，外核层厚度减少26.80％。电镜下核染色质向中心聚集。TUNEL法标记的凋亡细胞增加。光照后5天，外核层厚度减少39.76％。TUNEL法标记的凋亡细胞更。光照后7天，外核层厚度和TUNEL法标记的凋亡细胞数与光照后5天基本相似。视网膜色素上皮细胞、节细胞及内核层均无明显变化。也未了现炎症细胞。结论：实验性光损伤导致大鼠光感受器丧失，光感受器丧失的性质为细胞凋亡。实验结果初步证实光感受器细胞凋亡是实验性大鼠视网膜光损伤的重要机制。     

表皮生长因子受体在鼠角膜损伤前后的表达

采用免疫组织化学ＰＡＰ法检测正常及刮除部分角膜上皮３、６、１２、２４ｈ后大鼠角膜内表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）的分布。结果：正常状态下，只有角膜缘干细胞和近前弹力层角膜上皮细胞表达ＥＧＦＲ。角膜上皮缺损后６ｈ，损伤区角膜上皮均表达ＥＧＦＲ。当损伤后２４ｈ，角膜上皮缺损恢复时，在基质层内可见ＥＧＦＲ阳性基质细胞。结果表明：表达ＥＧＦＲ的角膜上皮细胞具有很强的增殖能力，在角膜损伤修复中起重要作用。     

大鼠眼内组织水通道蛋白1的表达

目的：观察水通道蛋白1（AQP1）在正常大鼠眼内组织的表达部位.方法：雄性Wistar大鼠断头放血取出眼球,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋.做矢状面5μm连续切片,每个标本切3张,分别用于AQP1免疫组化染色、阴性对照和HE染色,用已知有AQP1表达的大鼠肾脏肾小管切片为阳性对照.结果：光镜下观察AQP1免疫组化染色切片,细胞中出现棕色粗大颗粒为阳性,反之为阴性.大鼠眼内组织AQP1阳性表达部位有：（1）角膜内皮细胞;（2）虹膜上皮细胞;（3）晶状体上皮细胞;（4）睫状体非色素上皮（NPE）细胞;（5）视网膜神经节细胞层、内核层;（6）视神经胶质细胞.结论：AQP1在眼内与水代谢有关的多个部位呈阳性表达.     

蚕蚀性角膜溃疡组织病理学的观察

目的观察蚕蚀性角膜溃疡角膜、邻近球结膜的组织病理和超微病理特点.方法将手术切下的角膜缘角膜、进行缘角膜、邻近球结膜组织制备成石蜡切片和超薄切片,分别在光镜和透射电镜下观察组织病理变化和超微结构变化.以 Terrien角膜边缘变性的角结膜组织、细菌性角膜溃疡的角膜组织作对照.结果蚕蚀性角膜溃疡的球结膜、巩膜中存在以淋巴细胞、浆细胞浸润为主的慢性免疫炎症反应;角膜缘处角膜上皮、前弹力膜、前基质层、邻近表层巩膜溶解消失,残存的基质层胶原结构紊乱;溃疡进行缘的角膜上皮基底膜结构破坏消失.Terrien角膜边缘变性的球结膜及角膜上皮内可见淋巴细胞浸润;角膜上皮基底膜正常;前弹力层自下向上破坏变薄.在细菌性角膜溃疡病变与正常组织交界处,基底膜未见改变.结论蚕蚀性角膜溃疡的球结膜可能起着局部淋巴结作用.溃疡进行缘的角膜上皮基底膜首先被侵蚀,提示患者的基底膜可能存在异常,需要进一步研究.     

表皮生长因子受体在鼠角膜损伤前后的表达

采用免疫组织化学PAP法检测正常及刮除部分角膜上皮3、6、12、24h后大鼠角膜内表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)的分布。结果:正常状态下,只有角膜缘干细胞和近前弹力层角膜上皮细胞表达EGFR。角膜上皮缺损后6h,损伤区角膜上皮均表达EGFR。当损伤后24h,角膜上皮缺损恢复时,在基质层内可见EGFR阳性基质细胞。结果表明:表达EGFR的角膜上皮细胞具有很强的增殖能力,在角膜损伤修复中起重要作用。     

吸烟小鼠呼吸道上皮凋亡与增殖间的关系

利用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的ｄＵＴＰ缺口末端标记（ＴＵＮＥＬ）技术、增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）免疫组织化学染色对不同阶段吸烟小鼠呼吸道粘膜上皮凋亡细胞、增殖细胞的阳性细胞率与分布进行检测，并结合电镜的形态学观察对照研究。结果：正常呼吸道粘膜上皮凋亡细胞位于表层、增殖细胞带位于基底部，而吸烟小鼠丧失了上述分布特征。小鼠吸烟４周时，呼吸道上皮凋亡细胞和增殖细胞阳性率均明显高于未吸烟正常对照组。吸烟８周时，凋亡细胞和增殖细胞阳性率与吸烟４周时相比明显减少。吸烟１２周时，凋亡细胞明显增多，而增殖细胞明显减少。结论：吸烟小鼠呼吸道上皮开始不仅存在大量细胞凋亡而且出现活跃的细胞增殖，随着吸烟时间延长，呼吸道上皮以细胞凋亡占优势，呈现为细胞损伤逐渐加重而细胞再生修复能力减弱的病变特征     

一个Reis-Bucklers角膜营养不良遗传家系的表型分析

目的 分析与转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β） 基因突变相关的Reis-Bucklers 角膜营养不良（Reis-Bucklers dystrophy,RBCD） 家系的临床表型特征。 方法 于2013 年7 月将海南省三亚市同一家系17 例成员（患者9 例,正常8 例） 纳入本研究。所有成员进行完整的眼科检查,包括视力、眼压、眼前节裂隙灯检查、眼底检查、角膜敏感度检查和泪液分泌检查,并对临床表型资料进行分析。TGF-β 基因的所有外显子（1 ～ 16 号外显子） 应用聚合酶链反应和直接测序法鉴定TGF-β 基因突变。 结果 该家系患者9 例（ 其中男性6 例,女性3 例） 诊断为Reis-Bucklers 角膜营养不良,发病年龄1 ～ 10（3.67±0.90） 岁,首发症状包括畏光流泪,眼睛疼痛。视力下降年龄6 ～ 13 （8.00±0.78） 岁。此家系中的个体患者角膜营养不良的临床表现有明显差异,主要表现有角膜上皮地图样缺损、浅基质层孤岛样变性混浊、角膜表面铁锈样色素沉积和深部角膜基质层水肿。所有患者角膜敏感度都有减弱甚至消失。 结论 在本研究家系中,TGF-β 基因c.418G ＞ T（p.R124L） 突变引起的患者角膜营养不良存在表型异质性,包括角膜上皮地图样缺损,角膜表面糜烂造成的局部隆起和混浊,角膜表面斑片状棕褐色似铁锈样色素沉积,以及水肿累及全基质层等。     

骨形态发生蛋白-7在大鼠角膜碱烧伤修复过程中的表达

目的探讨骨形态发生蛋白-7（BMP-7）在大鼠角膜碱烧伤修复过程中的表达。方法用免疫组织化学方法检测BMP-7在正常对照组及角膜碱烧伤后1、3、5、7和14 d角膜中的定位与蛋白水平的表达,用计算机图像分析系统进行分析。结果BMP-7的表达在大鼠角膜碱烧伤后第1天降低,第3、5天逐渐升高,第7天基本接近正常水平,14 d时表达最强。结论BMP-7可能参与了角膜碱烧伤后炎性反应过程。     

CD86在大鼠角膜移植排斥反应中的表达及意义

目的 观察大鼠角膜组织中共刺激分子CD86(B7-2)的原位表达,以了解共刺激分子在大鼠角膜移植排斥反应中的作用和意义。方法 制作大鼠角膜移植模型,观察角膜透明度、新生血管。采用免疫组化法检测CD86在角膜、脾脏组织中的表达。结果 术后角膜植片均出现不同程度的新生血管,角膜水肿、混浊,基质增厚。CD86在正常的角膜组织中无阳性表达;在移植后出现急性排斥反应的角膜上皮层中有大量阳性细胞表达。在脾脏的阳性细胞表达与文献报道的一致。结论 共刺激分子CD86在移植后发生排斥的角膜组织中的阳性表达,可能与免疫排斥反应有关。     

以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜的构建及移植

目的进行体外分离和培养兔角膜缘干细胞,使之成为一种上皮组织,以便进行角膜移植。方法组织块法体外培养兔角膜缘干细胞：角膜缘组织块作为外植体,在脱细胞猪角膜基质上培养;获得的复合角膜上皮组织移植于兔眼,观察并记录兔角膜组织生长情况,待角膜组织生长良好后做免疫组织化学鉴定。结果兔角膜缘组织应用组织块法在脱细胞角膜基质上生长9~10 d后达到80%汇合状态,显微镜下动态观察细胞生长良好,增殖能力较高,将组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植于兔眼后,4~5 d角膜上皮光滑,20~21 d角膜变为透明,荧光素染色只见缝线处少许着色,期间未见角膜移植排斥反应。术后30 d HE染色显示角膜组织与宿主角膜组织结合良好,上皮细胞可见4~5层结构,可见角膜缘干细胞多呈卵圆形;免疫荧光染色可见培养的细胞P63、CK3单克隆抗体呈阳性表达。结论以组织块法生长的以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜可在角膜缘干细胞缺乏的兔眼上生长良好。     

蒸馏水及泪然在UBM检查中对角膜上皮影响的对比研究

目的 探讨两种不同超声介质在超声生物显微镜（ultrasound biomicroscopy,UBM） 检查中对角膜上皮的影响。方法 采用前瞻性研究方法将2012 年1-4 月在我院行超声生物显微镜的患者随机分为2 组,蒸馏水组（30 例46 眼,采用蒸馏水作为超声介质） 和泪然组（33 例37 眼,采用泪然作为超声介质）,两组均于检查后10 min 及24 h 行角膜荧光素染色（corneal fluorescein staining,CSF） 评分,评估角膜上皮缺损情况。结果 检查后10 min 泪然组角膜荧光素染色评分明显低于蒸馏水组（P ＜0.05）,差异有统计学意义;24 h 后两组角膜上皮荧光素染色均较前明显好转,差异无统计学意义（P ＞0.05）。结论 UBM 检查有损伤角膜上皮的风险,采用泪然作为超声介质能有效保护角膜上皮,缓解检查后不适症状。     

CD86在大鼠角膜移植排斥反应中的表达及意义

目的 观察大鼠角膜组织中共刺激分子CD86(B7-2)的原位表达，以了解共刺激分子在大鼠角膜移植排斥反应中的作用和意义。方法 制作大鼠角膜移植模型，观察角膜透明度、新生血管。采用免疫组化法检测CD86在角膜、脾脏组织中的表达。结果 术后角膜植片均出现不同程度的新生血管，角膜水肿、混浊，基质增厚。CD86在正常的角膜组织中无阳性表达；在移植后出现急性排斥反应的角膜上皮层中有大量阳性细胞表达。在脾脏的阳性细胞表达与文献报道的一致。结论 共刺激分子CD86在移植后发生排斥的角膜组织中的阳性表达，可能与免疫排斥反应有关。     

穿透性角膜移植术后持续戴角膜接触镜的临床观察

目的探讨穿透性角膜移植术（penetrating keratop lasty,PKP）后佩戴软性角膜接触镜来减轻术眼刺激症状、促进角膜上皮愈合的临床疗效。方法共201例（201只眼）PKP病例,其中术后戴软性亲水性角膜接触镜者159只眼,未戴镜者42只眼。定期观察患眼角膜知觉、角膜上皮愈合、新生血管形成、角膜内皮数量和形态。随访期6个月。结果术后4个月,戴镜组角膜知觉减退（P〈0.01）,摘除镜片后1个月角膜知觉可恢复到同不戴镜组相似;戴镜组会更易形成表层植片新生血管,摘除镜片后1个月新生血管大部分消退;戴镜组角膜上皮完整性较未戴镜组好,上皮修复迅速,不易损伤。角膜内皮细胞的形态和数量两组间无明显区别（均P〉0.05）。结论PKP术后佩戴软性角膜接触镜可减轻术后早期刺激症状、保护角膜,加快上皮愈合。     

PEDF对大鼠缺血心脏功能的影响及相关机制的研究

目的研究色素上皮衍生因子（pigmentepithelium—derivedfactor,PEDF）基因转染对大鼠缺血心脏功能的影响,并探讨其可能的作用机制。方法采用冠状动脉左前降支结扎法建立大鼠心肌梗死模型,将72只Sprague—Dawley大鼠随即分为6组（每组12只）：正常（Normal）组,转染PEDF—siRNA～LV（Infarct＋siPEDF）组,转染PEDF—LV（Infarct＋PEDF）组,载体对照（Infarct＋vector）组,溶剂对照（Infarct＋solvent）组,单纯梗死（Infarct）组。病毒转染4周后,超声心动图检测大鼠心脏功能,取各组心肌组织检测心肌局部炎症反应、心肌细胞和内皮细胞凋亡指数。结果超声心动图检测显示：模型建立4周时,与Infarct＋vector组、Infarct＋solvent组及Infarct组相比,Infarct＋siPEDF组左心室射血分数（1eftventricularejectionfraction,LVEF）显著降低,Infarct＋PEDF组LVEF显著升高,差异有统计学意义（P〈0．05）。苏木精～伊红（H—E）染色检测局部炎症反应显示：与Infarct十vector组、Infarct＋solvent组及Infarct组相比,Infarct＋siPEDF组炎症细胞浸润显著增多,TNF—1α及TNFR1表达量显著增加,差异有统计学意义（P〈0．05）;Infarct＋PEDF组炎症细胞浸润显著减少,TNF-α表达量显著减少,差异有统计学意义（P〈0．05）,而TNFRl表达无显著变化。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法（terminaldexynucleotidyltransferase（TdT）-mediateddUTPnickendlabeling,TUNEL）检测细胞凋亡显示：与各对照组相比,Infarct＋siPEDF组内皮细胞凋亡显著减少,心肌细胞凋亡显著增加;Infarct＋PEDF组内皮细胞凋亡数量显著增加,而心肌细胞凋亡数量显著减少,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论PEDF可通过降低局部炎症和保护心肌细胞而改善缺血心脏功能。     

诺帝滴眼液对碱烧伤诱导角膜新生血管的抑制作用

目的 观察自制诺帝滴眼液（Nordy eye drop）对Long．Evans大鼠角膜碱烧伤后新生血管（CRNV）有无抑制作用及其对正常角膜有无毒副作用。方法 采用0．025％、0．1％两个不同浓度诺帝滴眼液滴眼21d，通过裂隙灯、光镜、电镜观察检测诺帝滴眼液的毒副作用。建立角膜碱烧伤后角膜新生血管模型，0．025％、0．1％两个不同浓度诺帝滴眼液4次／d滴眼治疗，0．1％地塞米松磷酸钠滴眼液作为阳性对照、空白溶液作为阴性对照，观察诺帝治疗效果。结果 诺帝滴眼液滴眼21d后观察正常大鼠，无畏光、结膜充血等刺激症状，组织学检查显示结构正常，未见炎性细胞浸润。大鼠角膜碱烧伤后1d时仅见角膜缘血管网扩张，3d时新生血管长入，7～14d达高峰，14d时治疗组和地塞米松组新生血管开始退化；比较各组CRNV面积与角膜面积的比值，治疗组和阳性对照组均小于阴性对照组并有非常显著性差异（P〈0．01）。治疗组与阳性对照组间、0．025％与0．1％治疗组间均无显著性差异（P〉0．05）。结论 0．025％、0．1％的诺帝滴眼液局部滴眼无明显毒副作用，并且对CRNV有显著抑制作用。     

细菌性角膜溃疡角膜组织中MMP-2、MMP-9表达的研究

目的:研究细菌性角膜溃疡患者角膜组织中的基质金属蛋白酶-2、-9(MMP-2、-9)的表达与分布,探讨其含量的变化与角膜病变的相关性.方法:收集细菌性角膜溃疡患者的病变角膜和正常角膜,应用免疫组化染色方法检测MMP-2、MMP-9在角膜分布和表达,应用图像分析系统分析.结果:细菌性角膜溃疡角膜组织中,MMP-2的阳性表达主要分布于角膜基质层;MMP-9的阳性表达主要分布于角膜上皮层和基底膜附近.病变角膜组织中两种酶的阳性表达均具有统计学意义.结论:MMP-2、MMP-9对细菌性角膜溃疡的发展可能起重要作用.MMP-2参与角膜基质层的损害,MMP-9参与角膜上皮层和基底膜的损害.