共培养大鼠内皮祖细胞对白体骨髓基质干细胞成骨作用的影响

目的探讨体外培养大鼠外周血内皮前体细胞（EPCs）与自体骨髓基质细胞（BMSCs）共培养时对BMSCs成骨作用的影响。方法采用密度梯度离心法分离、培养大鼠BMSCs和EPCs,培养细胞分为四组：A组（BMSCs组）、B组（EPCs组）、C组（BMSCs成骨诱导组）及D组（BMSCs和EPCs联合培养组）。通过观察细胞克隆形态、免疫细胞化学、细胞增殖、碱性磷酸酶活性,从酶学、组织学及生化等不同方面观察EPCs对BMSCs成骨活性及生长情况的影响。结果免疫细胞化学染色证实C组培养的细胞具有晚期EPCs的特性。倒置相差显微镜、HE染色均证实共培养的BMSCs和EPCs生长良好,并能够形成与单纯成骨诱导培养的BMSCs相似的钙结节。MTr检测结果：各组细胞增殖差异无统计学意义（P〉0．05）。碱性磷酸酶活性检测结果：C、D组显著高于A、B组（P〈0．05）。结论EPCs和BMSCs联合培养具有良好的细胞相容性,EPCs能够增强成骨细胞的ALP活性,提高成骨细胞的增殖能力。     

成骨细胞移植对实验性家兔股骨头坏死的治疗作用

目的 比较骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)及其成骨诱导后移植,对实验性家兔股骨头坏死的治疗作用.方法 采用24只成年家兔,随机分为BMSCs移植组(A组)与BMSCs诱导分化的成骨细胞移植组(B组),将细胞移植于坏死股骨头的钻孔区内.对术后2、4、6、8周的股骨头标本,进行X线、组织学和骨形态发生蛋白(bone morphgenetic protein,BMP)免疫组织化学观察和图像分析.结果 ①X线观察显示,随着时间的进展,A、B 2组钻孔区密度逐渐增高,6周时出现骨小梁结构,8周呈现正常的骨小梁结构.②组织学观察表明,在A、B 2组钻孔区内,术后2周时有大量的成骨细胞;4周时充满骨小梁;8周时骨小梁趋于成熟,2组间骨小梁面积的图像分析,其差异无统计学意义(P＞0.05).③免疫组织化学观察显示,在A、B 2组术后2周时,移植的BMSCs呈现BMP免疫阳性反应;然而,向成骨细胞诱导分化的BMSCs移植后,只有部分细胞出现BMP免疫阳性反应.结论 BMSCs及其成骨诱导后移植,对实验性家兔股骨头坏死的治疗,呈现相似的结果;股骨头内部的微环境,对BMSCs具有明显的向成骨细胞诱导分化作用.     

富白细胞和血小板纤维蛋白凝胶对BMSCs在兔股骨头缺血性坏死中成骨作用的影响

目的 观察富白细胞和血小板纤维蛋白凝胶(L-PRF)联合骨髓间充质干细胞(BMSCs)在兔股骨头缺血性坏死(ANFH)试验中对成骨作用的影响.方法 48只新西兰白兔随机分为A、B、C、D 4组(各组12只),均造双侧ANFH模型.后给予ANFH修复方法:A组单纯行髓芯减压;B组行髓芯减压联合L-PRF凝胶移植;C组行髓芯减压联合BM-SCs移植;D组行髓芯减压联合BMSCs和L-PRF凝胶移植.A、B、C、D组于术后4、8、12周摄X片后,每组随机选取4只行相关组织学检查、新生骨体积分数、新生血管计数、X射线评分.结果 各组股骨头坏死中呈现不同程度的新骨形成.C、D组新骨的体积分数,血管计数及X射线评分较A、B组差异显著,其中D组比其余各组均高,B组强于A组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 L-PRF凝胶在医治兔AN-FH模型中对BMSCs成骨有促进作用,并拟使用L-PRF凝胶和BMSCs兼并髓芯减压治疗ANFH提供理论指导.     

骨髓基质干细胞联合rhBMP-2/rhVEGF治疗兔早期激素性股骨头缺血性坏死的实验研究

目的探讨BMSCs联合rhBMP-2/rhVEGF对早期激素性股骨头缺血性坏死的治疗作用。方法选取建立早期激素性股骨头坏死动物模型新西兰大白兔30只,随机分为5组,每组6只。A组:模型对照组;B组:单纯减压;C组:减压后植入BMSCs;D组:减压后植入BMSCs联合rhBMP-2;E组:减压后植入BMSCs联合rhBMP-2/rhVEGF。治疗后4、8周时各组取3只兔采用X线观察股骨头结构变化,病理组织学。结果 E组股骨头结构清晰,骨小梁结构完整,骨质破坏明显修复,空骨陷窝减少,大量新生的血管,其骨陷窝阳性数及与血管数目与各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 BM-SCs联合rhBMP-2/rhVEGF治疗早期激素性股骨头坏死,促进作用血管形成,显著改善坏死股骨头的血运,促进骨修复。     

骨髓间充质干细胞外泌体促进大鼠脑微血管内皮细胞的增殖和迁移

  目的  探讨骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchyml stem cells, BMSCs）外泌体正常状态下对大鼠脑微血管内皮细胞的增殖和迁移的影响。  方法  提取大鼠BMSCs并进行鉴定,将其与脑微血管内皮细胞（bEnd.3细胞）通过Transwell小室共培养24 h（BMSCs共培养组）;提取BMSCs外泌体进行鉴定,荧光显微镜下定性观察细胞吞噬外泌体的行为,CCK8 法检测细胞活力选定最佳BMSCs外泌体工作浓度,将其与bEnd.3细胞共培养24 h（BMSCs外泌体共培养组）。另设bEnd.3细胞单独培养组。培养24 h后通过EDU和细胞划痕实验,分别检测以上3组bEnd.3细胞的增殖和迁移能力。  结果  第3代BMSCs表面CD90、CD29为阳性,CD45显示为阴性,可成骨、成脂,表明所提取的BMSCs纯度较高。透射电镜下BMSCs外泌体形态为类圆形,直径在100 nm左右;NTA分析发现BMSCs外泌体的直径分布范围为50～600 nm,其中粒径峰值为150 nm;免疫荧光显示内皮细胞能够吞噬BMSCs外泌体;CCK8显示20 μg/mL外泌体加入对细胞增殖影响达到最佳。EDU检测显示,相较于对照组,BMSCs共培养组、BMSCs外泌体共培养组均可促进bEnd.3细胞的增殖（P<0.05）,且促进增殖的能力相当（P>0.05）。细胞划痕实验示,BMSCs外泌体共培养组细胞的迁移率高于对照组（P<0.05）,但与BMSCs共培养组差异不明显（P>0.05）。  结论  BMSCs外泌体可代替BMSCs,有效促进脑微血管内皮细胞的增殖和迁移,并为卒中后的血管新生提供新的潜在治疗手段。     

NGF β/HIF-1α双重转染的骨髓间充质干细胞对神经元轴突再生的作用

目的 观察神经生长因子β （nerve growth factor β,NGF β）/低氧诱导因子-1 α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）双重转染的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）对神经元轴突再生微环境的改善作用,为完善微环境中轴突再生的理论提供资料.方法 分别构建携带编码NGFβ、HIF-1α的慢病毒载体,用最佳感染复数（multiplicity of infection,MOI）转染BMSCs后,Western blot检测转染后的BMSCs表达NGF β、HIF-1α的情况.培养SD大鼠皮质神经元并将其与转染后的BMSCs用Transwell双层培养板构建共培养体系.将共培养体系在厌氧培养罐中培养48 h后,用ELISA方法检测神经元培养上清液中NGF β、HIF-1α、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达水平,并用Image pro-Plus软件测量神经元轴突的长度.实验分组：A组：单独培养神经元;B组：BMSCs与神经元共培养;C组：NGF β转染的BMSCs与神经元共培养;D组：HIF-1 α转染的BMSCs与神经元共培养;E组：NGFβ/HIF-1α双重转染的BMSCs与神经元共培养.结果 Le-RFP-NGFβ和Le-GFP-HIF-1 α基因转染BMSCs转染率分别为84.83％和89.63％.Western blot检测显示,转染后的BMSCs能表达目的蛋白NGFβ和HIF-1α.共培养体系ELISA检测结果显示,C组和E组的NGFβ的表达量明显高于A、B组（P＜0.05）;D组和E组的HIF-1α的表达量明显高于A、B组（P＜0.05）.D、E两组的VEGF表达量高于A、B两组（P＜0.05）.Image pro-Plus测量神经元轴突长度结果显示,C、D、E组大于A、B两组（P＜0.05）,E组大于C、D组（P＜0.05）.结论 与NGF β/HIF-1α双重转染BMSCs共培养的神经元轴突生长情况良好,在共培养环境中对神经元存活发挥重要作用的NGFβ、HIF-1α、VEGF等因子高表达.     

骨髓基质细胞移植对大鼠脊髓损伤后COX-2基因表达的影响

目的观察骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）移植对大鼠脊髓损伤后COX-2 mRNA表达的影响。方法分离培养BMSCs并传代。取Wistar雌性大鼠72只随机分为3组：A组18只（假手术组）、B组27只（细胞培养基对照组）和C组27只（BMSCs组）。B组和C组脊髓损伤后进行DMEM或BMSCs损伤周围区注射。应用RT-PCR法和免疫荧光方法检测损伤脊髓组织内COX-2 mRNA的表达及COX-2蛋白分布情况。结果 COX-2 mRNA在A组大鼠脊髓组织中低水平表达。脊髓损伤移植术后,C组COX-2 mRNA表达水平均显著高于相应时间点的B组（P〈0.01）。免疫荧光结果显示,A组COX-2仅表达于脊髓内的血管。脊髓损伤后,B组和C组COX-2表达分布则发生变化,主要见于损伤周围区脊髓内的血管和少数脊髓腹侧灰质内的神经元。结论 BMSCs移植能够增加脊髓损伤后COX-2 mRNA的表达。     

自体骨髓单个核细胞与藻酸钙凝胶修复激素性股骨头坏死的实验研究

目的 探讨自体骨髓单个核细胞与藻酸钙凝胶移植对激素性股骨头坏死的疗效及其促进成骨及血管化作用.方法 选用成年新西兰雄兔75只,造模型后,随机分为A、B、C、D 4组.A组不给予任何处理;B组在数字减影型X射线机(DSA)下用12号穿刺针减压;C组在DSA导视下穿刺注入0.5 ml的5×106的骨髓单个核细胞;D组用0.5 ml的5×106骨髓单个核细胞与藻酸溶液(方法同B,C组)注入股骨头内.术后4周及8周各组兔先行MRI扫描,之后处死动物取股骨头行常规组织学染色及用扫描电镜观察超微结构.结果 术后第8周,D组 MRI示低信号区明显缩小 ;组织病理学及扫描电镜表现空骨陷窝减少,成骨细胞多,新骨形成;D组空骨陷窝阳性数和微血管密度与A、B 和C组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 自体骨髓单个核细胞和藻酸钙凝胶移植对激素性股骨头坏死修复作用较为理想,并能够促进坏死区骨的再生和血管化.     

骨髓基质细胞移植对大鼠脊髓损伤后环氧化酶-2和血管内皮生长因子表达的影响

目的：观察骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）移植对大鼠脊髓损伤后环氧化酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）蛋白表达的影响。方法大鼠随机分为3组：A为假手术组,B为细胞培养基（DMEM）对照组,C为BMSCs移植组。B组和C组大鼠进行脊髓压迫损伤模型制作。脊髓损伤后, B组和C组大鼠分别给予DMEM培养液或BMSCs脊髓损伤周围区注射。术后应用Western Blot方法检测COX-2、VEGF蛋白在损伤脊髓组织中的表达变化。结果 COX-2、VEGF蛋白在A组大鼠未损伤脊髓组织中均低水平表达。B组与A组相比,脊髓损伤后COX-2蛋白表达水平明显增加（P＜0.01）,VEGF蛋白表达水平则短暂显著增加（P＜0.05）。C组与B组相比, COX-2和VEGF蛋白表达水平均显著增加。结论 BMSCs移植能够增加脊髓损伤后COX-2、VEGF蛋白的表达。     

PVT1促进在胶质瘤C6细胞微环境中的BMSCs增殖和迁移

  目的  探讨与胶质瘤C6细胞间接共培养后骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖和迁移能力的变化以及长链非编码RNA（lncRNA）浆细胞瘤变异异位基因1（plasmacytoma variant translocation 1 gene,PVT1）在这种变化中的作用。  方法  分离、培养、鉴定BMSCs后,采用Transwell小室将生长状态良好的BMSCs与胶质瘤C6细胞间接共培养（共培养组）,单独培养的正常BMSCs为对照组。CCK8及软琼脂克隆形成实验检测2组细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,划痕实验及Transwell法检测细胞的迁移能力,实时定量PCR（qRT-PCR）检测PVT1基因的表达。在共培养组BMSCs中转染si-PVT1（si-PVT1组）和si-NC（si-NC组）,转染后重复上述检测,并增加qRT-PCR检测周期蛋白基因CyclinD1及迁移相关基因基质金属蛋白酶2、9（ MMP2、 MMP9）的表达。  结果  所用BMSCs具有成骨、成脂分化能力。与对照组相比,共培养组BMSCs体积变小,排列紊乱,细胞间接触抑制消失,增殖及迁移能力增强,S期及G₂期细胞比例增加,PVT1表达增加（P<0.05）。与si-NC组比较,si-PVT1组抑制共培养BMSCs的增殖及迁移能力,G₁期细胞比例增加,S期细胞比例减少,PVT1、CyclinD1及 MMP2、MMP9 mRNA表达也降低（P<0.05）。  结论  胶质瘤C6细胞微环境中BMSCs增殖及迁移能力增强可能与PVT1高表达有关。     

自体内皮祖细胞促进组织工程骨血管化的体内外实验研究

目的：探讨自体内皮祖细胞（EPCs）在体内、外促进组织工程骨血管化的能力。方法将兔自体外周血 EPCs 及骨髓间充质干细胞（BMSCs）按联合培养时细胞增殖率最大时配比（EPCs ∶ BMSCs ＝1∶2）体外培养（联合培养组）,在体外采用实时定量 PCR 方法检测成骨相关细胞因子 Osteonectin 、Osteopotin 、Col-1及成血管相关细胞因子血管内皮生长因子（VEGF）表达,于培养3、7、14 d 观察表达量的变化并与单纯 EPCs 及 BMSCs 组比较;将单纯 EPCs 、BMSCs 及联合培养组的组织工程骨移植到兔四肢肌袋内,于移植后2、4、8周观察组织工程骨生长情况,同时制成组织切片行 CD34、CD105、ZO-1免疫组织化学染色,采用 Im-age-Pro plus 6．0图像分析软件,测量光密度值,比较3组工程骨表达量变化。结果3、7、14 d Osteonectin 、Osteopotin 、Col-1、VEGF 各组表达均逐渐增高,其中联合培养组增高最明显,且各时间点表达量最高（P＜0．01）;2、4、8周兔四肢肌袋内的组织工程骨中联合培养组细胞复合的工程骨随时间延长成骨增加最明显,新生血管长入最多,免疫组织化学显示 CD34、CD105、ZO-1表达最明显（P＜0．01）。结论自体 EPCs 与 BMSCs 相互作用,在体内、体外均可促进组织工程骨血管化。     

富血小板血浆诱导骨髓基质干细胞联合软骨支架治疗兔激素性股骨头坏死

目的 观察自体富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)诱导骨髓基质干细胞联合同种骨软骨支架治疗早期兔激素性股骨头坏死的疗效,探索早期股骨头坏死治疗的新方法.方法 采用含有抗凝剂的真空采血管从实验兔的耳中央动脉采取动脉血5 mL,再通过离心方法获取PRP,用16号骨髓穿刺针从实验兔自体股骨髓腔抽取骨髓5 mL,把抽取的骨髓进行密度梯度离心,获取兔骨髓基质干细胞,并进行细胞原代培养和成骨诱导.对已获取PRP和骨髓基质干细胞的实验兔进行激素性股骨头坏死造模,取同种股骨髁部骨软骨制作软骨支架,最后以制备的软骨支架为载体,将经过成骨诱导的骨髓基质干细胞移植到软骨支架上,形成细胞-支架复合物,用16号骨髓穿刺针对坏死的股骨头进行髓芯减压术,术中将细胞-支架复合物植入坏死的股骨头下.实验动物共分为4组,每组20只,A组为空白对照;B组仅进行髓芯减压;C组髓芯减压后植入经过成骨诱导培养的细胞;D组髓芯减压后植入细胞-支架复合物.实验后在第2、4、8周各组分别处死6、6、8只,每只实验兔的股骨头行大体标本及组织学检查.结果 D组治疗效果最显著,通过空骨陷窝计数发现D组与其他各组的差异有统计学意义(P<0.05).结论 骨髓基质干细胞通过PRP的诱导向成骨细胞分化;软骨支架材料为骨髓基质干细胞向成骨细胞分化提供良好的空间结构,有利于其向成骨细胞分化;PRP和软骨支架材料联合应用可促进早期兔激素性股骨头坏死的修复.     

VEGF-165基因修饰的MSCs诱导分化后治疗兔股骨头缺血性坏死的实验研究

目的：探讨VEGF-165基因联合单纯骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stemcells,MSCs）治疗激素性股骨头坏死的可行性。方法：1）体外分离、培养兔MSCs,纯化并鉴定兔MSCs;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后以1μgPeDNA3．1-hVEGF165：3μl阳离子脂质体Lipofectamine的比例转染,通过ELISA检测转染后细胞中外源性VEGF的表达。2）测定在正常条件培养和成骨备件培养下,转染后细胞上清中碱性磷酸酶、骨钙素的水平。3）实验动物连续三天大剂量（40mg／kg）臀部肌肉注射甲泼尼龙琥珀酸钠,通过MRI和组织病理学检查,建立动物模型。4）随机分成4组,每组14只。经皮穿刺于右侧股骨头,（1）生理盐水组,（2）单纯MSCs组,（3）hVEGF165基因转染MSCs组,（4）诱导分化后的hGVEF165基因转染MSCs组。8周后,组织病理学检查成骨和细胞成活情况。结果：1）hVEGF165基因转染的MSCs能成功分泌VEGF蛋白。2）成骨条件培养下,基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的分泌量明显高于未转染组（P〈0．05）;而在正常条件培养下,基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的表达分泌量较低。3）成功建立ANFH模型。4）组织学评分：生理盐水组1．8±0．72;单纯MSCs组8．54±0．37;hVEGF165基因转染MSCs组11．96±0．26;诱导分化后的hGVEF165基因转染MSCs组13．7±0．43,各组间差异有显著性（P〈0．05）。诱导分化转基因干细胞组与单纯干细胞组和生理盐水组之间差异非常显著（P〈0．01）。结论：诱导分化后的hVEGF165基因转染MSCs组成骨能力更好,修复股骨头缺血性坏死的能力也是最强。     

VEGF165基因转染兔骨髓间充质干细胞治疗兔激素性股骨头坏死的实验研究

目的以hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞移植治疗兔激素性股骨头坏死模型,通过影像学观察、病理学及免疫组织化学检查等方法评价疗效。方法使用马血清与醋酸泼尼松龙制备兔激素性股骨头缺血性坏死动物模型后分为4组,分别进行以下治疗：A组（不作任何处理）;B组（髓心减压＋自体骨移植）;C组（髓心减压＋骨髓间充质干细胞＋自体骨移植）;D组（髓心减压＋Ad-VEGF165转染骨髓间充质干细胞＋白体骨移植）。术后3周处死行病理学、免疫组织化学检查及Western Blot检测股骨头内VEGF的表达,比较各组间的差异。结果D组在软骨下血管、VEGF阳性面积百分比、股骨头内VEGF的相对浓度均高于其他各组;在VEGF平均灰度值、空骨陷窝率低于其他各组,且各组间差异有统计学意义。结论转染了Ad—VEGF165的骨髓间充质干细胞在宿主股骨头局部可以表达VEGF蛋白,且较单纯的骨髓间充质干细胞移植表达的强度更高,对激素性股骨头坏死进行早期治疗具有确切疗效。     

骨髓基质干细胞复合同种骨移植治疗创伤性股骨头坏死实验研究

目的探讨骨艇基质干细胞复合同种骨移植在治疗创伤性股骨头坏死中的成骨作用。方法6月龄SD大鼠36只,随机分为模型组、髓芯减压组及复合骨组。每组12只。取4周龄SD大鼠骨髓基质干细胞体外分离培养,取生长状态良好的第三代细胞复合同种骨粉;采用圆韧带离断方法制备大鼠创伤性股骨头坏死动物模型;于术后1、2、4、6周分别处死动物;光镜下观察三组间病理形态学改变;骨形态计量学参数测量及计算新骨生成量,得出骨小梁相对体积（BV／TV）、骨小梁厚度（Tb．Th）、骨小梁数量（Tb．N）、骨小梁分离度（Tb．Sp）。结果成功的复制出大鼠股骨头坏死模型,呈现出典型股骨头坏死不同时期病理改变;术后6周,骨形态计量学参数检测结果：复合骨组新骨生成量均多于模型组及髓芯减压组,其参数BV／TV、Tb．N、Tb．Th、Tb．Sp与其他二组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论BMSCs复合同种骨支架可作为“活骨”用于ONFH模型治疗并在其修复中可提高诱导成骨能力及股骨头坏死的骨修复能力,其作用优于单纯髓芯减压。     

Bcl-2基因转染骨髓干细胞治疗激素性股骨头坏死的疗效研究

研究Bcl-2 基因转染的骨髓间充质干细胞（BMSCs）结合髓芯减压法对兔早期激素性股骨头坏死的疗效。方法使用共计40只家兔复制早期激素性股骨头坏死模型,其中成功的模型家兔共28 只。随机分为4 组：空白对照组6 只,不作任何处理;髓芯减压组6 只,单纯减压;BMSCs 治疗组8 只,在减压同时植入BMSCs;Bcl-2 治疗组8 只,在减压同时植入Bcl-2 基因转染的BMSCs。植入后分别在第8、12 周各取股骨头标本行病理学检查及骨细胞凋亡检测,观察骨细胞生长及凋亡情况。结果成功复制兔早期激素性股骨头坏死动物模型;培养出BMSCs后进行传代;Bcl -2 基因转染成功;治疗12 周后,Bcl-2 治疗组动物的一般情况改善,组织切片和细胞凋亡检测结果显示,Bcl-2 治疗组的空骨陷窝和骨细胞凋亡数量与其他3 组比较,差异有统计学意义（p <0.05）。结论使用髓芯减压将Bcl-2 基因修饰的BMSCs 移植到兔早期激素性股骨头坏死动物模型体内,具有较好的成骨治疗作用。