微生物内氨基酸和小肽的分析方法及其应用进展

氨基酸和小肽是微生物内重要的活性组分和代谢产物.随着现代分析技术的日益革新,微生物氨基酸和小肽的定性定量分析方法也在不断发展.本文首先从淬灭、提取、样品衍生化和浓缩几个方面对微生物样品前处理方法做了介绍;进而分别从分离技术和检测方法两方面综述了氨基酸和小肽研究中所采用相关技术的特点及应用实例,并系统分析了各种方法的优缺点,同时展望了其发展趋势.     

微生物内氨基酸和小肽的分析方法及其应用进展

氨基酸和小肽是微生物内重要的活性组分和代谢产物。随着现代分析技术的日益革新,微生物氨基酸和小肽的定性定量分析方法也在不断发展。本文首先从淬灭、提取、样品衍生化和浓缩几个方面对微生物样品前处理方法做了介绍;进而分别从分离技术和检测方法两方面综述了氨基酸和小肽研究中所采用的相关技术的特点及应用实例,并系统分析了各种方法的优缺点,同时展望了其发展趋势。     

海洋天然产物中活性肽类成分研究进展

生物体内的活性肽是介于氨基酸与蛋白质之间的分子聚合物，它小至由2个氨基酸组成，大至有数百个氨基酸通过肽键连接组成，具有十分重要的研究价值和生理学意义。从1977年以来，各国已从海藻、海绵、腔肠动物、软体动物和微生物体内，分离得到了数千种的新型化合物，包括肽类、生物碱类、萜类、多糖类、大环类酯类、聚醚类等化合物。其中，许多具有抗癌、抗病毒、抗菌和抗真菌、治疗心血管疾病、神经系统活性、提高免疫力等生理活性，这方面的相关报道也已很多，对海洋生物的活性物质的研究起到了十分重要的指导作用。其中，对海洋天然产物中活性多肽成分的研究，现在已经进入了一个快速发展的阶段，并取得了一些显著的成果。现就海洋生物中活性肽类成分的种类、结构、生理活性等方面的研究与开发及其应用前景进行介绍。     

硒蛋白P同功型突变体短肽hSel P82m分析

目的: 切割硒蛋白P同功型突变体活性肽hSel P137m,以得到可能具备相同生物学活性而氨基酸数目更少的短肽.方法: 利用生物信息学技术分析hSel P280m,hSel P137m的活性功能域,用羟胺切割hSel P137 m,并用SDS-PAGE及蛋白质印迹加以分析验证.结果: 切割hSel P137m后得到了82(28aa-109 aa)个氨基酸的多肽,在特定的位置出现了预期的目的蛋白条带.利用生物信息学技术加以分析,认为hSel P82m基本具备hSel P137m的生物学活性.结论: 经切割硒蛋白P同功型突变体活性肽hSel P137m,成功得到82个氨基酸的短肽hSel P82m,并且认为其基本具备hSel P137m的生物学活性.     

生物活性肽的研究进展

生物活性肽(biologically active peptides或biopeptides)是指对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物。自从1975年，Hughes等首先报道从动物组织中发现了具有类吗啡活性的小肽以来，已经从动、植物和微生物中分离出多种多样的生物活性肽。生物活性肽的结构可以从简单的二肽到较大分子的多肽。它们具有多种多样的生物学功能，     

复肝肽口服液中氨基酸含量测定

目的用氨基酸分析仪测定了复肝肽口服液中各种氨基酸的组成。方法复肝肽是一种天然活性物质,其口服液样品经酸水解处理,用氨基酸分析仪进行分析。结果复肝肽口服液中含有天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸和色氨酸等18种氨基酸,其中人体必需氨基酸的含量占总氨基酸含量的40．78％。结论说明复肝肽口服液在营养学上有一定的研究价值,在食品中具有保健作用。     

衍生性聚偏二氟乙烯膜用于蛋白质及肽的固相序列测定

目的：研究衍生聚偏二氟乙烯（ＰＶＤＦ）膜用于蛋白质及肽的固相序列测定的可行性。方法：在ＰＶＤＦ膜上引入对苯二异硫氰酸基（ＤＩＴＣ）制成能与蛋白质及肽共价偶联的膜载体。用这种膜载体与蛋白质或肽样品偶联后,进行Ｅｄｍａｎ降解及氨基酸顺序分析。体化学性能稳定,偶联操作简单,结果准确,与蛋白质及肽的偶联率为７８．１９％,Ｅｄｍａｎ降解的重复回收率为９０．２７％,所测氨基酸序列与已序列安全相同。结论：衍生     

乙醇沉淀操作对羚羊角塞注射液中肽类成分和游离氨基酸含量的影响

利用程序升气相色谱法、凝胶色谱法和阴、阳离子交换色谱法及ＵＶ光谱监测等方法研究了羚羊角塞注射液制备过程中,乙醇沉淀操作对其中的肽类和１８种游离氨基酸含量的影响。实验结果表明该操作使游离氨基酸总量损失６１％,而总氨（即肽类和氨基酸）损失约７０％,阳离子交换色谱法和凝胶色谱法可分离纯化该注射液中的肽类成分,为乙醇沉淀工艺的使用和改进提供了实验依据。     

从噬菌体展示随机肽库中筛选豌豆凝集素的结合肽

目的:从噬菌体展示随机肽库中筛选能与豌豆凝集素(PSA)特异结合的短肽.方法:①用豌豆凝集素(PSA)作为靶蛋白,对噬菌体展示的随机六肽库进行亲和筛选;②α-甲基-D-甘露糖苷对筛选出的噬菌体和PSA结合的影响实验(点印迹法); ③选择性地合成了3条6肽ARMWSF、RYDYSY、LRLRQL,用不同浓度的6肽对PSA、ConA与HRP的结合进行竞争抑制实验.结果:经过三轮筛选后,这些噬菌体展示肽有明显的富集,从第三轮挑选的22个克隆的插入氨基酸序列可分为三大类;点印迹结果表明,这些噬菌体展示肽能与PSA特异结合,而α-甲基-D-甘露糖苷不同程度地抑制这种结合; LRLRQL不溶于水,ARMWSF和RYDYSY对PSA和HRP的结合有抑制,而对ConA和HRP的结合没有明显抑制.结论:人工合成的2条6肽和PSA的结合部位与α-甲基-D-甘露糖苷和PSA结合的部位并非相同.     

表皮生长因子受体与Dok1 PTB结构域结合关键位点的确定

目的:确定表皮生长因子受体(EGFR)与Dok1 PTB结构域结合的关键氨基酸残基位点.方法:合成包含磷酸化的酪氨酸残基的EGFR胞内域的5个小肽片段,利用谷胱苷肽S转移酶共沉淀技术确定能够抑制Dok1 PTB结构域与激活的EGFR结合的小肽.结果:pY1086或pY1148小肽能抑制激活的EGFR与Dok1 PTB结构域的结合.结论:pY1086和pY1148是激活的EGFR与Dok1 PTB结构域结合的关键位点.     

特洛伊肽运载核酸的研究进展

特洛伊肽(trojan peptides),又称细胞穿透肽(cell-penetrating peptides,CPP)或蛋白转导域(protein transduction domains,PTD),是一类少于30个氨基酸的小肽片段,它们一般含有多个碱性氨基酸,能够高效跨越细胞膜并将多种不同类型的大分子物质(如多肽,蛋白质,核酸等)运送至细胞内.本综述主要阐述了利用特洛伊肽将质粒DNA和siRNA运送至培养的哺乳动物细胞以及动物体内的研究进展,并阐明了这一运载系统在基因功能研究和临床应用上的巨大潜力和意义.     

僵蚕提取物中氨基酸种类与含量测定

目的:研究僵蚕提取物中组成蛋白质的氨基酸残基种类与含量,为其质量控制和抗凝活性作用物质基础研究提供依据.方法:将样品用盐酸水解后采用RP-HPLC法测定15种氨基酸残基的种类与含量.结果:僵蚕提取物含有15种氨基酸残基,其总量为48.7%,其中谷氨酸、丙氨酸和缬氨酸残基较多,蛋氨酸和辅氨酸残基在水解过程中被破坏而未测出.结论:僵蚕提取物中的主要成分为蛋白质、多肽类成分,它们含有所测的15种氨基酸残基.该定量方法准确、可控,可用于僵蚕样品中氨基酸残基的分析.     

Selection and application of serotypical synthetic peptides derived from hepatitis C virus NS5A region

Background   Numerous studies have reported a relationship between hepatitis C virus (HCV) genotype and the response to interferon therapy. Despite high sensitivity and specificity, genotyping methods can be performed only on HCV RNA positive samples. Serotyping might be a rapid and cost effective method for determining HCV genotypes, especially in patients with previously undetectable HCV RNA. In this study, an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method for HCV serotyping with the genotype specific, synthetic peptides derived from HCV nonstructural 5a (NS5A) region was developed.
Methods  Based on 45 sequences, representing HCV genotypes 1-6 from Genebank, we synthesised 305 overlapping 30-mer peptides within NS5A region at positions 2182-2343 of HCV. All peptides for antigenic reactivity were tested by enzyme immunoassay with 69 human sera with antiHCV positive representing genotype 1-6. Forty hepatitis C patient sera were serotyped using serotype specific, synthetic peptides and genotyped by sequencing analysis.
Results  The correspondence of amino acids in HCV NS5A region with amino acids in positions 2182-2343 was very low among different genotype peptides. The highly conserved sequences were residues 2182-2211(R1), 2272-2301 (R7) and 2302-2331 (R9): the highly variable 2212-2241 (R3) and 2257-2286 (R6). Using 305 peptides, antigenic regions were located in R3, R7 and R9. Eighteen peptides from highly conserved region representing genotypes 1 to 6 showed broad immunoreactivity with sera containing antibody to all HCV genotypes. Immunoreactivity of the peptides from highly variable region was stronger with similar genotype sera.  Twelve unique peptides showed highly, genotype specific, reactivity with types 1 and 3 sera. Type 2 genotype specific peptides had cross reaction with type 3 serum. No type 4, 5 or 6 specific peptides were selected. The serotyping results showed high agreement with sequencing analysis.   
Conclusions  The major antigenic regions in HCV NS5A region were at 2212-2241(R3), 2272-2301(R7) and 2302-2331(R9).  Eighteen peptides from highly conserved region show genotype independent, immunoreactivity, useful for antiHCV antibody test. Twelve peptides from highly variable region show genotype 1 and 3 dependent immunoreactivity, useful for determining HCV serotype, especially for patients with previously undetectable HCV RNA.

     

人巨细胞病毒PPUL44蛋白单克隆抗体CH13抗原决定簇位点的确定

目的 :确定人巨细胞病毒 PPU L44蛋白单克隆抗体 CH13在 PPU L44上的抗原决定簇位置 ,探讨随机多肽文库在研究相互作用蛋白质的氨基酸序列方面的应用。方法 :用 CH13在一个随机多肽文库中筛选出能与CH13结合的克隆 ,测定上述克隆随机多肽的 DNA序列 ,用随机多肽的氨基酸同源序列与 PPUL44蛋白质的氨基酸序列比较。结果 :能与 CH13结合的随机多肽的氨基酸序列显示出高度的一致性 ;随机多肽同源序列NEGEAFGPDVSG与 PPUL44蛋白位于第 32 1～ 332的氨基酸序列高度同源 ;而随机多肽序列 FQIL VCVESVL R与 PPU L44位于第 181～ 184的氨基酸序列有 4个相邻的氨基酸一致。结论 :CH13的抗原决定簇位于 PPU L44蛋白第 32 1～ 332氨基酸序列附近 ;CH13与 PPU L44位于第 181～ 184氨基酸序列可能有一定反应。随机多肽文库在研究相互作用蛋白质的氨基酸序列方面具有广泛的应用前景。     

哺乳动物MHC I类分子α链的信号肽预测及保守性分析

目的 主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）由一紧密连锁、高度多态的基因座组成,在脊椎动物的移植排斥反应、免疫应答和免疫调控等方面发挥极其重要的作用。MHCⅠ类分子由α链和β微球蛋白以非共价键结合组成,其中α链直接参与抗原肽的呈递,显示极为丰富的多态性。本研究旨在分析哺乳动物MHCⅠ类分子α链的信号肽是否呈现出多态性,并明确其分子生物学特征。方法 利用NCBI网站收集人等8种哺乳动物编码MHCⅠ类分子α链的mRNA序列,采用信号肽在线预测软件SignalP 4.1和LipoP1.0分析α链信号肽存在的概率、长度及信号肽酶切位点;利用Mega4.1软件进行信号肽氨基酸序列比对,分析其保守性。结果 8种哺乳动物MHCⅠ类分子α链N端的前24个氨基酸均为其信号肽区,信号肽酶切位点全部属于信号肽酶Ⅰ型,且信号肽酶切位点的-3、 -1、1、2、3位置上的氨基酸非常保守,是信号肽酶识别的关键位点。氨基酸序列比对分析发现α链信号肽24个氨基酸中有13个位点的氨基酸相同,占信号肽氨基酸总数的54.17%。结论 8种哺乳动物MHCⅠ类分子α链的信号肽具有较强的保守性,这可能与信号肽指导蛋白质分选和蛋白质定位的功能相关。     

叔丁氧羰基保护的环状氨基酸的合成及其在多肽固相合成中的应用

目的 合成叔丁氧羰基（Boc）保护的环状氨基酸Acc5、Acc6,并将这类构型限制型氨基酸用于多肽的固相合成,考察环状氨基酸在多肽固相合成中的应用以及在强酸条件下的稳定性.方法 环状氨基酸通过相应的环酮与KCN和铵盐反应得到含有氰基的环状化合物,再通过氰基的酸性水解而得到,最后在弱碱性条件下与二碳酸二叔丁酯（Boc2 O）反应,得到Boc保护的环状氨基酸;通过1 H NMR和ESI-MS表征其结构;采用对甲基二苯甲基氨基树脂,通过Boc、芴甲氧羰基（Fmoc）的氨基保护策略,对肽序列进行固相合成,最后在强酸HF条件下裂解,通过HPLC对粗肽进行纯度分析,ESI-MS表征其结构.结果 1 H NMR和ESI-MS图谱显示环状氨基酸Acc5和Acc6均为目标化合物.HPLC结果显示,得到的2个促性腺激素释放激素类似物（GnRH）,粗肽纯度良好,且易于纯化;ESI-MS图谱确证肽序列结构正确.结论 环状氨基酸在固相合成工艺中有很好的缩合效率,并且能够在强酸裂解条件下保持稳定.     

氨基酸类神经递质对神经系统的影响及其含量测定方法的研究

氨基酸类神经递质是脑内重要的一类神经递质,调控人脑的功能,神经系统疾病,如阿尔茨海默病与脑内氨基酸关系密切。目前应用较为广泛的氨基酸含量测定方法有高效液相色谱法、氨基酸分析仪测定法、色谱-质谱联用法,气相色谱法等,但这些测定方法都有一定的局限性,因此快速选择并确立一种合适的氨基酸和多肽类神经递质的高效测定方法显得尤为重要。该文综述了近年来血液与组织样品中氨基酸类神经递质的含量测定方法,以期为更多的研究者提供参考。     

环状氨基酸的合成及其应用

环状氨基酸是一种构型限制型氨基酸，因为它们的构象限制性特点有利于肽的生物活性构象的形成和稳定，在修饰多肽时引起的构象效应和生物学效应有着重要的理论和应用价值，常用于修饰生物活性肽，以改善其药学性质。研究表明，环状氨基酸的引入是一种改善多肽性质的有效方法之一。本文就环状氨基酸的结构特点、合成，尤其是多肽修饰方面进行了综述。     

肉桂提取物醇质体透皮吸收研究

目的 合成一长链肽47肽。方法 采用Fmoc/t-Bu正交保护多肽固相合成策略,使用9-芴甲氧羰基（Fmoc）保护氨基酸的α-氨基,用Liberty微波多肽合成仪,每个耦合循环用20%哌啶脱除Fmoc保护基团,连续添加氨基酸,并用茚三酮法检测反应终点,有效检测反应的进度,最后用82.5%的三氟乙酸将多肽从树脂上切割下来,得到47肽粗品。经过反相高效液相制备系统纯化得到多肽纯品,用反相高效液相分析仪和傅里叶高分辨质谱仪验证该产物。结果 高分辨质谱仪验证了该产物,纯品质量分数达98%。结论 微波可促进多肽特别是长链肽的合成。