罗丹明123及P-糖蛋白在人支气管损伤修复过程中的表达

目的 研究离体人支气管上皮经氟尿嘧啶(5-FU）损伤前后及修复过程中罗丹明123(Rh123)的染色及P-糖蛋白的表达情况。方法 取5-FU作用前后及修复3、6、24h的人支气管上皮。进行如下实验：采用酶消化法获取细胞悬液，Rh123染色，流式细胞仪分析；用免疫荧光及蛋白印迹法观察P-糖蛋白的表达，RT—PCR法检测P-糖蛋白mRNA的表达。结果 5-FU作用后支气管上皮中Rh123阴性染色细胞占活细胞的比例较正常组增多；随着损伤的修复，Rh123阴性活细胞所占比例逐渐降至接近正常。免疫荧光法可见5-FU作用后的上皮细胞涂片上有P-糖蛋白的表达，在蛋白及mRNA水平，5-FU作用后支气管上皮的P-糖蛋白表达均较正常组增加。结论 5-FU作用后，Rh123染色阴性、表达P-糖蛋白的支气管干细胞占残留活细胞的比例增多。由它们完成损伤的修复。     

P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白在胃癌的表达与化疗敏感性的相关性研究

目的：探讨胃癌组织中P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gP）、多药耐药相关蛋白（muhidrug resistance-associated protein，MRP）的表达及对胃癌原代细胞培养体外化疗药物敏感性的影响。方法：应用免疫组化法检测P-gP及MRP在48例胃癌及癌旁组织的表达，同时通过胃癌原代细胞培养MTT药敏试验，检测胃癌对7种临床常用化疗药物的敏感性及耐药性，进一步分析药敏试验结果与P-gp、MRP表达的相关性。结果：在48例胃癌中，P-gP及MRP阳性率分别为41．7％、29．2％，共同表达率为25．0％。癌旁组织与癌组织的P-gP、MRP阳性表达率无显著差异。在顺铂（DDP）、丝裂霉素（MMC）、阿霉素（ADM）、鬼臼乙叉甙（VP-16）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、羟基喜树碱（HCVF）、甲氨蝶呤（MTX）中，ADM、VP-16、HCVF耐药组P-gP、MRP阳性表达及共表达率较敏感组显著升高。结论：胃癌组织P-gp、MRP表达可导致胃癌原发性耐药。P-gP、MRP介导的MDR是ADM、VP-16、HCPT耐药的重要因素．     

Runt相关转录因子3在人结肠癌HCT-116/5-FU耐药细胞株中的表达及其与耐药的相关性

目的 建立耐5-氟尿嘧啶(5-FU)的人结肠癌细胞株HCT-116/5-FU,初步探讨Runt相关转录因子3(RUNX3)与结直肠癌耐药的关系。方法 采用低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击法建立人结肠癌耐药细胞株HCT-116/5-FU,CCK-8法检测5-FU对亲本株HCT-116及耐药株HCT-116/5-FU的半数抑制浓度(IC₅₀值),绘制细胞生长曲线,计算细胞群体倍增时间(TD);qRT-PCR和Western blot法检测亲本株HCT-116细胞及耐药株HCT-116/5-FU细胞中RUNX3、P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)和肺耐药蛋白(LRP)的mRNA和蛋白表达。采用siRNA技术敲低HCT-116细胞中RUNX3的表达,分为RUNX3敲低组(si-RUNX3-1组、si-RUNX3-2组)和阴性对照组(si-NC组),qRT-PCR和Western blot法分别在mRNA水平和蛋白水平验证RUNX3的敲低效率;CCK-8法测定si-RUNX3组和si-NC组的IC₅₀值,Western blot法测定两组中P-gp、MRP1和LRP的表达情况。结果 成功构建稳定的人结肠癌耐药细胞株HCT-116/5-FU,耐药倍数为7.7倍;HCT-116/5-FU耐药细胞株群体TD较HCT-116亲本株明显延长(P<0.001),耐药细胞群体TD是亲本细胞的1.38倍(P=0.002),耐药株细胞形态发生变化。耐药细胞HCT-116/5-FU的RUNX3 mRNA表达水平较亲本细胞株HCT-116明显降低(P=0.048),P-gp(P=0.008)、MRP1(P=0.001)和LRP mRNA(P=0.001)表达水平较亲本细胞株HCT-116明显升高;耐药细胞HCT-116/5-FU的RUNX3蛋白质相对表达量较亲本细胞株HCT-116明显降低(P<0.001),P-gp、MRP1、LRP蛋白的相对表达量较亲本细胞株明显升高(P均<0.001)。成功构建了RUNX3低表达的HCT-116细胞模型,si-RUNX3-1组RUNX3 mRNA的表达与si-NC组相比差异无统计学意义(P=0.064),si-RUNX3-2组明显低于si-NC组(P=0.034);si-RUNX3-1组和si-RUNX3-2组RUNX3蛋白的表达量均明显低于si-NC组(P均<0.001),si-RUNX3-2组的敲低效率更高。选用si-RUNX3-2组完成后续实验,si-RUNX3组的IC₅₀值较si-NC组明显升高,下调RUNX3的表达能明显降低HCT-116细胞对5-FU的敏感性(P<0.001);si-RUNX3组的P-gp、MRP1和LRP蛋白相对表达量均明显高于si-NC组(P均<0.001)。结论 RUNX3表达下调能降低人结肠癌HCT-116细胞对5-FU的敏感性,可能与RUNX3表达的降低上调P-gp、MRP1和LRP等耐药蛋白表达,从而增加细胞的耐药性有关。     

化疗前、后胃癌组织中P-糖蛋白的表达

目的 探讨化疗前、后胃癌组织中P-糖蛋白(P-gp)表达强度的变化，从而为胃癌术后化疗方案的选择提供依据。方法 用免疫组化方法检测16例术前行5-氟尿嘧啶(5-FU)化疗前、后胃癌组织中P-gP的表达。结果 12例患者化疗前、后P-gP的表达强度无明显变化。结论 5-FU可作为胃癌术后化疗的选用药物。     

人结直肠癌耐奥沙利铂细胞株的建立及特性

目的建立人结直肠癌耐奥沙利铂细胞株,检测该细胞株的多药耐药性及其可能的机制。方法在人结直肠癌细胞株SW480（亲本细胞）的培养液中,逐渐提高化疗药物奥沙利铂（Oxa）浓度,建立稳定的耐药细胞株（SW480/OxR）,采用细胞增殖试剂WST-1检测细胞对化疗药物Oxa和5-FU的敏感性;实时荧光定量PCR检测MDR-1、Survivin及Oct4的mRNA表达水平;流式间接法检测P-gp、Survivin蛋白阳性细胞比例;Western blot方法检测Oct4蛋白表达。结果 WST-1检测细胞增殖结果为：耐药细胞加药（Oxa及5-FU）72h后细胞数量变化不大（P〉0.05）;耐药细胞MDR-1、Survivin和Oct4的mRNA水平,P-gp＋及Survivin＋细胞比例以及Oct4蛋白水平均明显高于亲本细胞（P〈0.01）。结论耐药细胞具有多药耐药特性,可能与高表达耐药蛋白P-gp、抗凋亡蛋白Survivin及干细胞转录因子Oct4有关。     

PKCα、PKCε及P-gp在卵巢癌中的表达及其临床意义

目的 检测PKCα，PKCε，P-gP在卵巢癌组织中的表达及PKCα，PKC与卵巢癌化疗耐药的关系。方法 用免疫组化SP法测定64例卵巢癌，18例卵巢上皮性交界性肿瘤，15例卵巢上皮性良性肿瘤，15例正常卵巢组织中PKCα，PKCε，P-gp）的表达。结果 PKCα，PKCε，P-gP在卵巢癌中的表达明显高于正常、良性、交界性卵巢上皮性肿瘤中的表达；以上3个指标在卵巢癌中的表达与肿瘤初治时病理类型、病理分级和临床分期无关；复发癌组织中PKCα，PKCε，P-gP的表达均明显高于初治者；卵巢癌中PKCα，PKCε与P-gp之间有密切关系（P〈0．01）。结论 在卵巢癌中PKCα，PKCε表达与P-gp有一致性，说明两者的表达可能在P-gp介导的卵巢癌耐药性的产生中起着重要作用。     

多药耐药基因、谷胱甘肽-S-转移酶-π、胸苷酸合成酶在胃癌中的表达及意义

目的 检测多药耐药基因（P-gp）、谷胱甘肽-s-转移酶-π（GST-π）、胸苷酸合成酶（TS）在胃癌中的表达及其临床指标和预后关系。方法采用SP免疫组化法检测P-gP、GST-π、TS在62例胃癌患者中的表达。结果62例胃癌患者中P-gP、GST-π、TS表达率分别为77．4％、67．7％、12、9％。P-gP、GST-π表达率明显高于TS。结论P-gP、GST-π在原发性胃癌中有较高的表达率，P-gp的表达与分化程度和淋巴结转移有一定关系，可作为治疗和提示预后的指标。GST-π与肿瘤分化程度有一定相关性。P-gP、GST-π过表达导致胃癌化疗失败。鸭表达率低，提示5-FU可作为治疗原发性胃癌化疗的首选药物。     

冷刺激对细颗粒物致气道上皮炎症反应的增敏效应及冷诱导RNA结合蛋白的转录后调控机制

目的探讨冷刺激对细颗粒物(PM2.5)致气道上皮炎症反应的增敏效应及冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)可能的转录后调控机制。方法采用在体、离体实验,并结合人体手术切除肺组织标本的观察,将动物模型和气道上皮细胞16HBE各分为4组(每组n=8),即空白对照组、5℃/18℃组、PM2.5组、5℃/18℃+PM2.5组,分别以酶联免疫吸附试验、实时荧光定量聚合酶链反应、蛋白印迹检测各组气道上皮细胞和大鼠支气管/肺组织的代表性炎症因子及CIRP mRNA和蛋白的表达规律,并进一步采用细胞免疫荧光技术观察CIRP变化的时相动力学规律。同时采用免疫组织化学的方法观察各组大鼠及人体支气管/肺组织CIRP的定位和表达规律。结果在体实验中,相较于对照组,5℃组和PM2.5组CIRP、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α的mRNA及蛋白均呈现表达水平增高的现象(均P0.05),而5℃组+PM2.5组相应的mRNA及蛋白表达则最为显著(均P0.01)。在离体实验的各组实验结果中亦出现同样的规律。CIRP主要定位于胞核内,相较于对照组,18℃组和PM2.5组均出现CIRP胞内移位趋势,而18℃+PM2.5组CIRP胞内移位现象最为明显。在大鼠支气管/肺组织的免疫组织化学中,5℃组CIRP的表达高于对照组,PM2.5组CIRP的表达量相较于对照组也有所增加,而5℃+PM2.5组CIRP的表达量变化最为显著。此外,CIRP在正常人群和慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)患者支气管上皮黏膜中均有表达,且主要位于气道黏膜上皮细胞胞核内。其中慢阻肺患者CIRP的表达量较正常人群显著升高。结论冷刺激对PM2.5所致的气道上皮炎症反应有增敏效应,而CIRP由胞核移位至胞浆形成的转录后调控可能是其重要机制。     

5-氟脲嘧啶联合尼美舒利对人食管癌EC109细胞VEGF表达的研究

目的:通过观察5-氟脲嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)、尼美舒利(Nimesuhde,NIM)单独或联合作用对人食管癌EC109细胞血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响,初步探讨5-FU、NIM抑制食管癌血管生成的机制.方法:培养食管癌EC109细胞,不同浓度5-FU、NIM单独或联合作用24 h后.MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡;RT-PCR检测VEGF mRNA表达情况;Western blot法检测VEGF蛋白表达.结果:NIM与5-Fu联合作用于食管癌EC109细胞株时,其抑制率与凋亡率较两者单独作用时高,且VEGF mRNA及蛋白的表达水平低于两者单独作用时的表达水平.结论:NIM联合:5-FU能有效抑制食管癌EC109细胞增殖,其中抑制VEGF表达可能为其机制之一.     

shRNA沉默DNA-PKcs表达对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU耐药性的影响

目的观察shDNA-PKcs沉默DNA-PKcs基因对肝癌耐药细胞Bel7402/5-FU耐药性的影响。方法采用双酶切、测序分析鉴定shDNA-PKcs干扰质粒;用阳离子脂质体法将shDNA-PKcs质粒转染BEL7402/5-FU细胞,根据荧光细胞数计算转染率,Real-time PCR及Western blot检测沉默效率;MTT法检测细胞药物敏感性;Real-time PCR和Western blot检测P-gp mRNA和蛋白表达。结果双酶切鉴定结果显示质粒约为6300bp,测序结果显示插入序列为shDNA-PKcs序列。荧光细胞计数显示质粒的转染率为62.2%。Real time PCR及Western blot检测结果显示DNA-PKcs mRNA及蛋白水平的沉默效率分别为82.6%、71.8%;MTT检测结果显示shDNA-PKcs实验组的ADM和5-FU的IC50值比对照组ADM、5-FU低（P〈0.05）,DDP和MMC的IC50值与对照组比无统计学意义（P〉0.05）。Real time PCR和Western blot检测结果显示实验组P-gp mRNA、蛋白表达水平均比对照组低（P〈0.01）。结论 shDNA-PKcs干扰质粒能够有效抑制BEL7402/5-FU细胞中DNA-PKcs表达,增加细胞对化疗药物的敏感性,其机制可能与P-gp蛋白的下调有关。     

气管干细胞分化过程中Shh信号通路的动态观察

目的:探讨大鼠气管上皮损伤后,气管干细胞增殖分化过程中Shh信号通路的动态变化.方法:应用5-氟尿嘧啶(5-FU)诱发气管上皮损伤,通过RT-PCR检测气管上皮Shh的表达.结果:5-FU作用30 min后大鼠气管上皮细胞绝大部分脱落,仅残留少量裸核样G0期细胞位于基底膜上.之后细胞数目逐渐增多,经过扁平、立方形态,向纤毛细胞、黏液细胞、基底细胞等分化,去除5-FU后48 h接近恢复假复层纤毛柱状上皮;正常气管上皮及5-FU作用30 min气管上皮Shh无表达,去除5-FU恢复3 h后Shh轻度表达,6 h后表达增强,12 h达高峰,之后表达减弱,48 h已极微弱.结论:Shh参与了气管干细胞的增殖分化过程.     

衰老对小鼠肺干细胞修复能力的影响

目的：研究衰老对小鼠肺组织干细胞在生理状态和支气管上皮细胞（ Clara细胞）损伤后修复能力的影响。方法通过流式细胞术对老龄和低龄组小鼠的肺组织干细胞比例进行分析,研究衰老对肺组织干细胞稳态维持的影响;通过免疫组化染色对肺组织病理切片进行分析,确立支气管上皮细胞（ Clara细胞）损伤模型;通过流式细胞术、免疫组化染色、肺组织病理切片研究老龄和低龄组小鼠在支气管上皮细胞（ Clara细胞）损伤后肺组织干细胞的损伤修复能力。结果老龄组肺组织干细胞比例（肺上皮干细胞／前体细胞,肺间质干细胞／前体细胞）在稳态维持的情况下较低龄组改变不显著;在肺支气管上皮细胞（ Clara细胞）损伤后,老龄组小鼠支气管上皮出现较严重的细胞受损;在接下来的观察中发现,小鼠肺组织前体细胞／肺组织总细胞比例在老龄组显著下降,且增殖细胞在肺组织前体细胞和肺组织干细胞中的比例出现显著下降;同时,小鼠支气管上皮恢复程度在老龄组明显较差。结论在稳态维持的状态下,衰老对肺组织干细胞的比例没有影响。在支气管上皮细胞受到损伤后,肺组织干细胞占肺总细胞比例降低,修复与再生能力显著下降。可能为临床上衰老更易产生肺组织损伤及病变更严重的原因。     

气管干细胞增殖分化过程中Shh信号通路的动态观察

目的 探讨大鼠气管上皮损伤后，气管干细胞增殖分化过程中Shh信号通路的动态变化。方法 大鼠麻醉后，暴露气管，于平胸骨上缘处离断，与肺相连一端行气管插管维持呼吸，近端应用5-氟尿嘧啶（5-FU）诱发气管上皮损伤，动态观察修复过程；同时在观察的各个时间点取气管上皮标本通过IKT—PCIK检测Shh的表达情况。结果 5-Fu作用30min后大鼠气管上皮细胞绝大部分脱落，仅残留少量裸核样G0期细胞位于基底膜上，之后这些细胞数目逐渐增多，逐渐经过扁平、立方形态，向纤毛细胞、粘液细胞、基底细胞等分化，于去除5-FU后48h基本恢复假复层纤毛柱状上皮；正常组织及5-FU作用30min时的气管上皮均无Shh表达，去除5-Fu恢复3h后可见Shh轻度表达，于恢复12h表达达高峰，之后表达减弱，48h时Shh表达已极微弱。结论 shh参与了气管干细胞的增殖分化过程。     

生脉注射液对裸鼠人胃癌SGC7901/VCR细胞移植瘤生长及P-gp表达的影响

目的 观察生脉注射液对裸鼠人胃癌SGC7901/VCR细胞移植瘤生长及P-gP表达的影响.方法 建立裸鼠人胃癌SGC7901/VCR细胞皮下移植瘤模型,将裸鼠随机分为生理盐水组、5-FU组、5-FU 异搏定组、5-FU 生脉组、生脉组,观察裸鼠生长状态,计算移植瘤平均瘤重及抑瘤率,检测P-gP表达.结果 5-FU TG生脉组瘤重、瘤体积与生理盐水组、5-FU组、生脉比较,P<0.05,均有统计学意义;抑瘤率(57.96%)明显高于5-FU组(11.66%);5-FU 生脉组瘤重与5-FU 异搏定组比较有统汁学意义(P<0.05),抑瘤率(57.96%)高于5-FU 异搏定组(27.56%).5-FU 生脉组P-gp表达与生理盐水组、5-FU组、生脉组比较,P<0.05,均有统计学意义;5-FU 生脉组与5-Fu 异搏定组比较,P>0.05,无统计学意义;单药生脉组与生理盐水组比较,P<0.05,有统计学意义.结论 以上实验结果表明生脉注射液能抑制裸鼠人胃癌SGC7901/VCR细胞移植瘤生长,降低P-gP表达.     

Lyn对屋尘螨诱导的人支气管上皮细胞中MUC5AC表达的影响及其机制

目的：探讨Lyn对屋尘螨（HDM）诱导的人支气管上皮细胞中MUC5AC表达的影响,并初步阐明其可能的相关作用机制。方法：选取人支气管上皮16HBE细胞,将其分为PBS组（给予PBS）和HDM组（给予1 μg·L^-1HDM）,采用脂质体转染法将LynsiRNA分别转至PBS组和HDM组细胞。构建人MUC5AC启动子荧光素酶报告基因,采用Promega双荧光素酶报告基因试剂盒检测相对荧光素酶活性（RLU）,采用免疫荧光法检测16HBE细胞中MUC5AC的表达,并在共聚焦显微镜下观察。采用Western blotting法检测16HBE细胞中STAT6的表达水平。结果：双荧光素酶报告基因检测,HDM组16HBE细胞中MUC5AC启动子的RLU高于PBS组（P<0.05）;与未干扰时比较,LynsiRNA干扰后HDM组RLU明显升高（P<0.05）。免疫荧光法检测,HDM组MUC5AC表达水平高于PBS组（P<0.05）;与未干扰时比较,LynsiRNA干扰后HDM组MUC5AC表达水平升高（P<0.05）。Western blotting法检测,LynsiRNA干扰后,HDM组细胞中STAT6表达水平升高（P<0.05）。结论：Lyn缺失能增加人支气管上皮细胞中MUC5AC的表达,其机制可能与Lyn调控STAT6信号途径有关。     

阿苯达唑抑制P-糖蛋白表达对耐顺铂卵巢癌细胞耐药性的影响

目的探讨阿苯达唑(albendazole,ABZ)通过抑制人耐顺铂卵巢癌SKOV-3/DDP细胞P-糖蛋白(P-glycopro-tein,P-gp)的表达对细胞耐药性的影响。方法在体外,用溴化二甲噻唑二苯四氨唑(MTT)比色法检测ABZ对SKOV-3/DDP细胞增殖的影响,求得抑制率为0%、25%、50%、75%所对应的ABZ浓度,并按抑制率将实验分为对照组,25%抑制浓度(IC25)组、半数抑制浓度(IC50)组和75%抑制浓度(IC75)组,每组给予相应浓度的ABZ处理,并按作用时间再将每组分为12、24、36 h亚组。分别用流式细胞仪检测各组细胞表面P-gp的表达。将不同浓度的顺铂(cisplatin,DDP)、表阿霉素(epirubicin,EPI)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)按照分组,联合和序贯ABZ处理细胞后,采用MTT比色法检测SKOV-3/DDP细胞体外增殖情况。结果 ABZ作用SKOV3/DDP细胞后使P-gp表达下降,呈浓度和时间依赖性。联合和序贯ABZ均能降低DDP、EPI和5-Fu对SKOV-3/DDP细胞的作用浓度,有浓度和时间依赖性,且联合作用优于序贯作用。结论在体外ABZ通过抑制SKOV-3/DDP细胞P-gp表达提高细胞对DDP、EPI、5-Fu的敏感性,并能逆转细胞的耐药性。     

Transplantation of human limbal cells cultivated on amniotic membrane for reconstruction of rat corneal epithelium after alkaline burn

Background The transplantation of limbal epithelial cells cultivated on amniotic membrane is a newly developed treatment for limbal stem cell deficiency. The purpose of our study was to investigate the biological characteristics of limbal epithelial cells and evaluate the effect of transplantation of cultivated human limbal epithelial cells on ocular surface reconstruction in limbal stem cell deficiency rat model.Methods Human limbal cells were isolated and cultivated in vitro. Cytokertins 3, 12, and 19 (K3, K12 and K19) and p63 were detected by immunofluorescent staining or RT-PCR. BrdU labelling test was used to identify the slow cycling cells in the cultures. Limbal stem cell deficiency was established in rat cornea by alkali burn.Two weeks after injury, the rats received transplants of human limbal stem cells cultivated on amniotic membrane carrier. The therapeutic effect was evaluated by slit lamp observation, Hemotoxin and Eosin (HE) staining and immunofluorescent staining.Results On day 7 in primary culture, p63 and K19 were strongly expressed by most cells but only a few cells expressed K3. On days 14 and 21, p63 and K19 were still expressed by a majority of cells, but the expressive intensity of p63 decreased in a number of cells, while the proportion of K3 positive cells increased slightly and some cells coexpressed p63 and K3. RT-PCR showed that gene expression of both p63 and K12 were positive in cultivated limbal cells, but in mature superficial epithelial cells, only K12 was detected. BrdU labelling test showed that most cells were labelled with BrdU after 7 days‘ labelling and BrdU label retaining cells were observed after chasing for 21 days with BrdU free medium. For in vivo test, slit lamp observation, HE staining and immunofluorescent staining showed that the rats receiving transplant of human limbal stem cells cultivated on amniotic membrane grew reconstructed corneas with intact epithelium, improved transparency and slight or no neovascularization. A majority of epithelial cells of the reconstructed cornea were positive to antihuman nuclear antibody and cells expressing K3 were found mainly in superfacial epithelium.Conclusions Limbal stem cells can be cultivated in vitro: the cells are characterized by high proliferation and slow cycling and identified as p63/K19 positive and K3/K12 negative. During culture, some stem cells can proliferate and differentiate into mature cornea epithelial cells. Amniotic membrane is a suitable carrier for limbal stem cells. Transplantation of human limbal stem cells cultivated on amniotic membrane can functionally reconstruct rat cornea with limbal stem cell deficiency.