气管干细胞分化过程中Shh信号通路的动态观察

目的:探讨大鼠气管上皮损伤后,气管干细胞增殖分化过程中Shh信号通路的动态变化.方法:应用5-氟尿嘧啶(5-FU)诱发气管上皮损伤,通过RT-PCR检测气管上皮Shh的表达.结果:5-FU作用30 min后大鼠气管上皮细胞绝大部分脱落,仅残留少量裸核样G0期细胞位于基底膜上.之后细胞数目逐渐增多,经过扁平、立方形态,向纤毛细胞、黏液细胞、基底细胞等分化,去除5-FU后48 h接近恢复假复层纤毛柱状上皮;正常气管上皮及5-FU作用30 min气管上皮Shh无表达,去除5-FU恢复3 h后Shh轻度表达,6 h后表达增强,12 h达高峰,之后表达减弱,48 h已极微弱.结论:Shh参与了气管干细胞的增殖分化过程.     

气管干细胞增殖分化动物模型的建立

目的 建立研究气管干细胞增殖分化的动物模型。方法 大鼠气管，平胸骨上缘处离断。近端应用氟尿嘧啶（5-Fu）作用30min，动态观察修复过程。结果 5-Fu作用30min后，光镜下可见气管上皮细胞绝大部分脱落，仅剩余少量间隔分布的类似裸核的细胞位于基底膜上，PCNA染色阴性证实这些细胞为Gn期细胞。ABCG2免疫荧光染色大部分细胞为阳性；去除5-Fu3～6h后，上皮细胞彤态变为扁平；9～12h后细胞变为立方，细胞数目逐渐增多；24h上皮细胞数更多，连接成片，可见纤毛；48h接近恢复假复层纤毛柱状上皮。结论 5-Fu诱发气管上皮损伤后，剩余的G0期细胞中舍有气管干细胞，通过这些干细胞的增殖分化使气管上皮得以修复。     

罗丹明123及P-糖蛋白在人支气管损伤修复过程中的表达

目的 研究离体人支气管上皮经氟尿嘧啶(5-FU）损伤前后及修复过程中罗丹明123(Rh123)的染色及P-糖蛋白的表达情况。方法 取5-FU作用前后及修复3、6、24h的人支气管上皮。进行如下实验：采用酶消化法获取细胞悬液，Rh123染色，流式细胞仪分析；用免疫荧光及蛋白印迹法观察P-糖蛋白的表达，RT—PCR法检测P-糖蛋白mRNA的表达。结果 5-FU作用后支气管上皮中Rh123阴性染色细胞占活细胞的比例较正常组增多；随着损伤的修复，Rh123阴性活细胞所占比例逐渐降至接近正常。免疫荧光法可见5-FU作用后的上皮细胞涂片上有P-糖蛋白的表达，在蛋白及mRNA水平，5-FU作用后支气管上皮的P-糖蛋白表达均较正常组增加。结论 5-FU作用后，Rh123染色阴性、表达P-糖蛋白的支气管干细胞占残留活细胞的比例增多。由它们完成损伤的修复。     

大鼠气管发生的形态学观察

本实验对胚胎第15天至出生后30天的大鼠气管上皮的发生过程进行了观察。证实胚胎第15天的气管上皮为假复层上皮,细胞表面有少量微绒毛;胚胎第17天,气管上皮出现典型的杯状细胞;胚胎第19天出现纤毛细胞;出生5天以后,上皮细胞增殖、聚集并内陷,形成气管腺。杯状细胞的粘液颗粒主要是中性粘多糖,气管腺的粘液颗粒为酸性粘多糖和中性粘多糖。实验结果表明:在胚胎期和生后早期,粘液纤毛运送系主要由纤毛细胞和杯状细胞等组成,出生5天以后,粘液纤毛运送系统主要由纤毛细胞和气管腺组成。     

人胎儿喉黏膜上皮细胞的发育分化特点

【目的】研究中国人胎儿喉黏膜上皮细胞发育分化的特点。【方法】收集9—40周胎儿喉标本33例。应用连续切片HE染色、细胞角蛋白免疫组化染色、扫描电镜和透射电镜观察其黏膜上皮。【结果】9周胎喉黏膜由1—2层低柱状细胞组成，仅表层细胞表达微弱的角蛋白，13周后出现多种类型的上皮细胞．上皮全层均表达细胞角蛋白；会厌舌面、声带被覆鳞状上皮，会厌喉面、室带、喉室及声门下区被覆假复层纤毛柱状上皮，其基底细胞和中间细胞的胞浆内含有丰富的胞浆泡状系统、张力原纤维和桥粒：过渡上皮和纤毛上皮中均散在岛状鳞状上皮但出现时间不一致。【结论】人喉黏膜上皮细胞的分化发生于胎儿9-13周期间；纤毛上皮的基底细胞和中间细胞具有双向分化的潜能；过渡上皮和纤毛上皮中出现岛状鳞状上皮是生理现象，前者由复层立方上皮分化而来，后者由纤毛上皮分化而来。     

初级纤毛介导的Shh信号对大鼠骨髓基质细胞神经元样细胞分化的影响

目的 探讨初级纤毛介导的Sonic hedgehog(Shh)信号对大鼠骨髓基质细胞(MSCs)神经元样细胞分化的影响。方法 全骨髓贴壁法分离培养大鼠MSCs。实验分为白藜芦醇正常培养组、白藜芦醇诱导组、Smoothened (Smo)激动剂SAG组、Smo抑制剂环巴明组,分别给予相应的药物处理。倒置显微镜下观察各组细胞形态; 免疫荧光法检测各组细胞初级纤毛及Shh信号通路相关蛋白\[Ac-Tu、Patched (Ptc)、Smo、Gli1\]的表达; RT-PCR检测各组细胞Smo、Gli1 mRNA的表达;蛋白质印迹法检测各组细胞Smo和Gli1蛋白的表达。结果 正常培养的大鼠MSCs不表达初级纤毛。经过预诱导或饥饿处理24 h后,MSCs表达初级纤毛及Ptc、Smo和Gli1蛋白,其中Smo和Gli1蛋白位于胞质,Ptc蛋白位于初级纤毛。正常培养时,白藜芦醇不能促使Smo移位及MSCs向神经元样细胞分化。当MSCs表达初级纤毛时,白藜芦醇及SAG可使Smo从胞质进入初级纤毛,同时伴随MSCs向神经元样细胞分化及 Smo、Gli1 mRNA和蛋白表达水平的增加(P<0.05); 加入抑制剂环巴明后,Smo仍主要表达于胞质,Smo、Gli1 mRNA和蛋白的表达水平降低(P<0.05),MSCs向神经元样细胞的分化受抑制。结论 MSCs表达初级纤毛并存在Shh信号,初级纤毛介导的Shh信号参与调控大鼠MSCs的神经元样细胞分化。     

小鼠气管–支气管上皮细胞的气–液界面培养

目的建立一种小鼠气管–支气管上皮细胞气–液界面(ALI)培养及纤毛摆动频率测量的方法,最大程度还原气道上皮的生理功能。方法利用1 mg/mLⅪⅤ型链蛋白酶冷消化的方法获取BALB/c小鼠气管–支气管上皮细胞,筛选出最佳消化时长以保证所得细胞的数量及活力。差速贴壁法去除成纤维细胞后,接种于Ⅰ型鼠尾胶原预包被的Transwell小室,用不同培养基进行增殖期和ALI分化期培养。结果采用链蛋白酶冷消化12 h、14 h和16 h所得细胞数目分别为(1.78±0.33)×10~5、(1.93±0.26)×10~5和(2.01±0.28)×10~5,经台盼蓝染色活细胞率分别为(96.86±0.25)%、(94.73±1.63)%和(86.87±5.95)%。1周左右细胞铺满小室,继续ALI培养2～3周后光学显微镜下可见纤毛节律性摆动,电镜及免疫荧光均证实纤毛结构。培养所得细胞纤毛摆动频率与小鼠气管在体纤毛摆动频率与一致。结论本实验建立的气管–支气管上皮细胞分离、ALI培养及纤毛摆动频率测量体系简便、稳定、高效、可靠,为探索气道疾病的致病和治疗机制创造了基础,亦可为其他物种气道上皮和(或)其他器官上皮的培养提供参考依据。     

小鼠鼻腔及气管黏膜上皮细胞的构成和纤毛反应性比较研究

目的比较小鼠鼻腔及气管黏膜上皮细胞的构成以及纤毛摆动频率对外源性刺激的反应性。方法 采用酶消化法获取小鼠鼻腔及气管黏膜纤毛细胞,观察纤毛细胞的得率以及ATP和苯扎溴铵对纤毛摆动频率的影响;采用免疫组化染色及扫描电镜观察鼻腔及气管黏膜上皮的细胞构成。结果 ①培养细胞中小鼠鼻甲的纤毛细胞得率可达(45±5)%,气管组织仅有(15±5)%;②免疫组化染色鼻腔及气管黏膜上皮细胞均有乙酰化α-tubulin阳性表达,鼻腔的纤毛细胞层更连续,细胞更密集;③100μmol/LATP均能引起鼻甲及气管的纤毛摆动频率增加,增加率分别为235.06%和118.49%;0.005%苯扎溴铵均能使2个部位的纤毛摆动频率下降,降至原有频率的50.31%和8.27%。2组频率比较差异均有统计学意义,P值分别为0.013和0.004;④扫描电镜观察,鼻腔黏膜上皮中纤毛细胞的比例(90%)明显高于气管上皮纤毛细胞比例(30%～40%)。结论 小鼠鼻腔和气管黏膜上皮中纤毛细胞的比例存在明显差异;2个部位的纤毛摆动频率对外源性刺激的反应程度存在明显差异;从纤毛细胞的数量上看,鼻腔远远高于气管,其中鼻甲是个不容忽视的丰富资源。     

鞘氨醇激酶2抑制5-氟尿嘧啶诱导的人结肠癌HCT116细胞凋亡

目的 探讨鞘氨醇激酶2(SphK2)在5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导的人结肠癌HCT116细胞凋亡中的作用。方法 采用Hoechst33342染色检测5-FU作用48 h后HCT116细胞凋亡形态学的变化;流式细胞术检测5-FU作用48 h后HCT116细胞的凋亡率,并分析SphK2的干扰或过表达对5-FU诱导的HCT116细胞凋亡率的影响;用蛋白质印迹法观察5-FU诱导HCT116细胞SphK2活性的改变及干扰或过表达SphK2对5-FU诱导凋亡中凋亡标记蛋白的影响。结果 5-FU能诱导HCT116细胞凋亡,细胞出现了明显的核固缩、染色质凝集等凋亡形态变化。细胞SphK2被干扰后,与未被干扰的细胞相比,5-FU诱导后的细胞凋亡率增高(P<0.01),凋亡标记蛋白表达水平升高;而过表达SphK2的细胞在5-FU作用下其凋亡率较对照组(空质粒处理)下降(P<0.01),凋亡标记蛋白表达水平亦下降;5-FU可诱导磷酸化SphK2水平增高。结论 SphK2对5-FU诱导的HCT116细胞凋亡具有负调控作用。     

小白菊内酯对EC9706细胞增殖及VEGF、NF-κB P65蛋白表达的影响

目的:探讨小白菊内酯(PTL)对食管癌EC9706细胞的增殖、血管内皮生长因子(VEGF)及核转录因子-κB P65(NF-κB P65)蛋白表达的影响.方法:倒置显微镜下观察不同浓度(20、40和80 μmol/L)的PTL作用48 h后EC9706细胞的形态学变化;MTT法检测20、40和80 μmol/L PTL及20 μmol/L PTL与25 mg/L 5-氟尿嘧啶(5-FU)联用对EC9706细胞增殖的影响;免疫细胞化学法检测20和40 μmol/L的PTL作用72 h后EC9706细胞VEGF和NF-κB P65蛋白表达的改变.结果:①PTL作用EC9706细胞48 h后,细胞数量减少,细胞固缩变圆,核浓缩、核质分布不清,细胞溶解碎裂.②PTL及联合组作用于EC9706细胞24、48和72 h后,相同时间段各组细胞增殖抑制率差异均有统计学意义(χ224 h=31.420,P<0.001;χ248 h=34.590,P<0.001;χ272 h=38.190,P<0.001).PTL对EC9706细胞的增殖有抑制作用;细胞培养72 h后PTL与5-FU联合组对EC9706细胞的抑制作用与50 mg/L 5-FU组相当.③PTL作用EC9706细胞后,与对照组比较VEGF和NF-κB P65蛋白表达均降低(χ2NF-κB P65=25.120,P<0.001;χ2VEGF=22.190,P<0.001).结论:PTL能抑制EC9706细胞的增殖,增加EC9706对5-Fu的敏感性;PTL的抗肿瘤机制可能与抑制NF-κB传导通路有关.     

5-氟尿嘧啶和奥沙利铂诱导结肠癌SW620细胞死亡的比较

【目的】研究5-氟尿嘧啶和奥沙利铂分别诱导结肠癌细胞株SW620的细胞凋亡的作用效果。【方法】用80μg／ml 5-氟尿嘧啶和25μg/ml奥沙利铂分别作用SW620细胞8h,并应用AnnexinV—FITX／PI双标记流式细胞术对细胞凋亡进行检测,观察凋亡细胞的比例。【结果】80μg／ml 5-氟尿嘧啶处理8h组与空白对照组比较,凋亡细胞比例上升约11．9％（P〈0．01）;25μg／ml奥沙利铂处理8小时组与空白对照组比较,凋亡细胞比例上升约21．4％（P〈0．01）。【结论】在特定条件下,5-氟尿嘧啶和奥沙利铂均能明显诱导结肠癌细胞株SW620的细胞凋亡;奥沙利铂对结肠癌细胞的诱导凋亡作用要强于5-氟尿嘧啶。     

Shh对发育中小鼠视觉传导通路的影响

目的探察Shh对E13-E15小鼠胚胎中视觉传导通路发育的影响。方法E13至E15小鼠胚胎的眼至视束部分制备成脑厚片,置于含10%的小牛血清的DMEM/F12的培养液中,在37℃恒温滚动培养箱中培养5h。实验组中将Shh抗体加入培养液中。培养结束后,将脑厚片以4%多聚甲醛固定,将DiI颗粒置于视盘。7d后,在手术显微镜下,暴露被标记的视神经纤维,在激光扫描共聚焦纤维镜下观察。结果用Shh抗体阻抑Shh的功能,可引起E13跨越中线的视神经纤维减少以及E15投射至同侧的视束的神经纤维的增多。结论在视交叉形成的早期,Shh引导视神经纤维跨越中线。在视交叉形成的后期,Shh引导视神经转弯。     

Re-epithelializaiton by epithelial inoculation with recipient phenotype in heterotopically transplanted rat allografts

Background Re-epithelialization has remained a major obstacle in both tracheal and lung transplantations.This study examines the realization of re-epithelialization by epithelial inoculation in a rat heterotopic tracheal transplantation model.Methods The original epithelia of tracheas from donor Wistar rats were removed and the tracheas were then inoculated with 106/ml in vitro cultured epithelial cells of the Spraque-Dawley （SD） rat phenotype.These allo-tracheas were then heterotopically transplanted into SD rats.After 28 days,the allo-trachea tissues were recovered and assessed for epithelial morphology and cellular differentiation using immunohistochemical analysis.An additional experimental group was used to compare the outcomes of re-epithelialization in immunosuppressed animals.Results Histological examination showed that allografts with epithelial inoculation maintained patent tracheal lumens,which were obliterated in controls.Recipient immunosuppression facilitated the formation of an integrated ciliated epithelial layer,further demonstrated by the presence of a dense cilia population,a well-developed plasma membrane,and readily recognizable intercellular junctions.Epithelial cellular differentiation markers such as cytokeratin 14 and 18,and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator （CFTR） were all positive in allografts under immunosuppression.Conclusion Concurrent recipient-derived epithelial inoculation with immunosuppression can result in complete reepithelialization with the recipient phenotype and suppress the luminal obliteration process in heterotopic transplantations.     

小GTP酶Arl6调控原纤毛生成和Shh信号转导

目的:研究小GTP酶Arl6对sonic hedgehog(Shh)信号通路的调控作用?方法:构建Arl6敲低稳转细胞株,检测Shh通路靶基因Gli1及Ptch1的mRNA表达水平;激光共聚焦显微镜下观察Arl6在原纤毛的定位,并且检测Arl6敲低细胞中原纤毛的生成情况?结果:Arl6的敲低抑制Shh信号通路的完全激活,在高浓度Shh条件性培养基或Smo激动剂Purm刺激下,靶基因Gli1 mRNA表达水平明显低于对照shControl组(P < 0.01),Ptch1 mRNA的表达水平也明显降低(P < 0.05);Arl6定位于原纤毛的基部小体,Arl6的缺失会影响原纤毛的生成;同时,Shh信号会刺激Arl6的表达(P < 0.05)?结论:小GTP酶Arl6的敲低抑制Shh通路的完全活化,与其抑制原纤毛生成有关?     

Shh在血管瘤中的表达及意义

目的 测定音猬因子(sonic hedgehog,Shh)在血管瘤内皮细胞(Hemangioma endothelial cells,HEC)和脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)中的表达,探讨Shh与血管瘤及人脐静脉的关系.方法 采用实时荧光定量PCR方法,对临床收集的18例手术切除的新鲜增生期血管瘤病变标本和18例新鲜脐静脉标本,进行实时荧光定量PCR检测Shh表达水平.结果 Shh表达水平在增生期血管瘤明显升高,与脐静脉比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 Shh可能促进血管瘤的生长,可能对血管瘤的病理发生过程发挥作用,但对脐静脉无作用.     

人胎儿喉黏膜上皮细胞的发育分化特点

[目的]研究中国人胎儿喉黏膜上皮细胞发育分化的特点.[方法]收集9～40周胎儿喉标本33例.应用连续切片HE染色、细胞角蛋白免疫组化染色、扫描电镜和透射电镜观察其黏膜上皮.[结果]9周胎喉黏膜由1～2层低柱状细胞组成,仅表层细胞表达微弱的角蛋白,13周后出现多种类型的上皮细胞,上皮全层均表达细胞角蛋白;会厌舌面、声带被覆鳞状上皮,会厌喉面、室带、喉室及声门下区被覆假复层纤毛柱状上皮,其基底细胞和中间细胞的胞浆内含有丰富的胞浆泡状系统、张力原纤维和桥粒;过渡上皮和纤毛上皮中均散在岛状鳞状上皮但出现时间不一致.[结论]人喉黏膜上皮细胞的分化发生于胎儿9～13周期间;纤毛上皮的基底细胞和中间细胞具有双向分化的潜能;过渡上皮和纤毛上皮中出现岛状鳞状上皮是生理现象,前者由复层立方上皮分化而来,后者由纤毛上皮分化而来.     

CD3ε和5-氟尿嘧啶在T淋巴细胞凋亡中的协同作用及P53的表达

目的研究CD3ε分子与化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)在T淋巴细胞凋亡中的协同作用及P53的表达,为探索T淋巴细胞凋亡的分子机制打下基础,为相关肿瘤的治疗提供新的实验依据。方法培养人T淋巴白血病细胞株JK,转染了突变的CD3εITAM的TJK及T3JK细胞株。用CD3ε特异的单克隆抗体(200μg／ml)和／或5-FU(2．5μg/ml)刺激不同的T淋巴细胞诱导细胞凋亡,用噻唑蓝比色法检测细胞存活率,并计算细胞死亡率;用瞬时转染野生型或突变型P53表达质粒的方法和Western印迹检测P53蛋白质的表达,分析其在T淋巴细胞凋亡中的作用。结果在CD3ε和5-FU分别诱导T淋巴细胞凋亡过程中,均伴随着P53蛋白质表达增加;两者联合使用使T淋巴细胞凋亡和P53蛋白质表达显著增加;P53过表达可明显增加T淋巴细胞对5-FU的敏感性。结论抗CD3ε抗体和5-FU联合作用可显著提高P53蛋白质表达,两者在T淋巴细胞凋亡中具有协同效应。