气管干细胞增殖分化过程中Shh信号通路的动态观察

目的 探讨大鼠气管上皮损伤后，气管干细胞增殖分化过程中Shh信号通路的动态变化。方法 大鼠麻醉后，暴露气管，于平胸骨上缘处离断，与肺相连一端行气管插管维持呼吸，近端应用5-氟尿嘧啶（5-FU）诱发气管上皮损伤，动态观察修复过程；同时在观察的各个时间点取气管上皮标本通过IKT—PCIK检测Shh的表达情况。结果 5-Fu作用30min后大鼠气管上皮细胞绝大部分脱落，仅残留少量裸核样G0期细胞位于基底膜上，之后这些细胞数目逐渐增多，逐渐经过扁平、立方形态，向纤毛细胞、粘液细胞、基底细胞等分化，于去除5-FU后48h基本恢复假复层纤毛柱状上皮；正常组织及5-FU作用30min时的气管上皮均无Shh表达，去除5-Fu恢复3h后可见Shh轻度表达，于恢复12h表达达高峰，之后表达减弱，48h时Shh表达已极微弱。结论 shh参与了气管干细胞的增殖分化过程。     

气管干细胞增殖分化动物模型的建立

目的 建立研究气管干细胞增殖分化的动物模型。方法 大鼠气管，平胸骨上缘处离断。近端应用氟尿嘧啶（5-Fu）作用30min，动态观察修复过程。结果 5-Fu作用30min后，光镜下可见气管上皮细胞绝大部分脱落，仅剩余少量间隔分布的类似裸核的细胞位于基底膜上，PCNA染色阴性证实这些细胞为Gn期细胞。ABCG2免疫荧光染色大部分细胞为阳性；去除5-Fu3～6h后，上皮细胞彤态变为扁平；9～12h后细胞变为立方，细胞数目逐渐增多；24h上皮细胞数更多，连接成片，可见纤毛；48h接近恢复假复层纤毛柱状上皮。结论 5-Fu诱发气管上皮损伤后，剩余的G0期细胞中舍有气管干细胞，通过这些干细胞的增殖分化使气管上皮得以修复。     

大鼠气管发生的形态学观察

本实验对胚胎第15天至出生后30天的大鼠气管上皮的发生过程进行了观察。证实胚胎第15天的气管上皮为假复层上皮,细胞表面有少量微绒毛;胚胎第17天,气管上皮出现典型的杯状细胞;胚胎第19天出现纤毛细胞;出生5天以后,上皮细胞增殖、聚集并内陷,形成气管腺。杯状细胞的粘液颗粒主要是中性粘多糖,气管腺的粘液颗粒为酸性粘多糖和中性粘多糖。实验结果表明:在胚胎期和生后早期,粘液纤毛运送系主要由纤毛细胞和杯状细胞等组成,出生5天以后,粘液纤毛运送系统主要由纤毛细胞和气管腺组成。     

白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞的神经元样细胞分化伴Shh信号激活

目的 研究Sonic Hedgehog(Shh)信号在白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞(marrow stromal cells,MSCs)分化为神经元样细胞中的作用.方法 采用全骨髓贴壁法分离培养MSCs.MSCs分为3组,白藜芦醇诱导组:用含白藜芦醇的无血清DMEM/F12诱导MSCs分化;对照组:用无血清DMEM/F12诱导MSCs分化;正常组:不做诱导处理.倒置显微镜下观察细胞形态,免疫荧光法、免疫印迹法检测NSE、MAP-2、GFAP、Smo和Gli1蛋白的表达和移位.结果 白藜芦醇诱导后细胞胞体收缩,伸出长突起,类似神经元.免疫荧光显示正常组及对照组MSCs轻度表达神经元NSE蛋白,白藜芦醇诱导组MSCs NSE、MAP-2阳性,但诱导前后细胞始终未表达胶质细胞GFAP蛋白.免疫荧光显示,MSCs具有初级纤毛,并表达Smo和Gli1.白藜芦醇诱导组Smo从细胞质进入初级纤毛,Glil从细胞质进入细胞核,同时,Smo、Glil蛋白的表达增加(P＜0.01).对照组则无明显变化.结论 白藜芦醇能诱导MSCs分化为神经元样细胞;此过程中Shh信号通路被激活,推测Shh信号在MSCs分化过程中可能发挥着重要作用.     

初级纤毛介导的Shh信号对大鼠骨髓基质细胞神经元样细胞分化的影响

目的 探讨初级纤毛介导的Sonic hedgehog(Shh)信号对大鼠骨髓基质细胞(MSCs)神经元样细胞分化的影响。方法 全骨髓贴壁法分离培养大鼠MSCs。实验分为白藜芦醇正常培养组、白藜芦醇诱导组、Smoothened (Smo)激动剂SAG组、Smo抑制剂环巴明组,分别给予相应的药物处理。倒置显微镜下观察各组细胞形态; 免疫荧光法检测各组细胞初级纤毛及Shh信号通路相关蛋白\[Ac-Tu、Patched (Ptc)、Smo、Gli1\]的表达; RT-PCR检测各组细胞Smo、Gli1 mRNA的表达;蛋白质印迹法检测各组细胞Smo和Gli1蛋白的表达。结果 正常培养的大鼠MSCs不表达初级纤毛。经过预诱导或饥饿处理24 h后,MSCs表达初级纤毛及Ptc、Smo和Gli1蛋白,其中Smo和Gli1蛋白位于胞质,Ptc蛋白位于初级纤毛。正常培养时,白藜芦醇不能促使Smo移位及MSCs向神经元样细胞分化。当MSCs表达初级纤毛时,白藜芦醇及SAG可使Smo从胞质进入初级纤毛,同时伴随MSCs向神经元样细胞分化及 Smo、Gli1 mRNA和蛋白表达水平的增加(P<0.05); 加入抑制剂环巴明后,Smo仍主要表达于胞质,Smo、Gli1 mRNA和蛋白的表达水平降低(P<0.05),MSCs向神经元样细胞的分化受抑制。结论 MSCs表达初级纤毛并存在Shh信号,初级纤毛介导的Shh信号参与调控大鼠MSCs的神经元样细胞分化。     

罗丹明123及P-糖蛋白在人支气管损伤修复过程中的表达

目的 研究离体人支气管上皮经氟尿嘧啶(5-FU）损伤前后及修复过程中罗丹明123(Rh123)的染色及P-糖蛋白的表达情况。方法 取5-FU作用前后及修复3、6、24h的人支气管上皮。进行如下实验：采用酶消化法获取细胞悬液，Rh123染色，流式细胞仪分析；用免疫荧光及蛋白印迹法观察P-糖蛋白的表达，RT—PCR法检测P-糖蛋白mRNA的表达。结果 5-FU作用后支气管上皮中Rh123阴性染色细胞占活细胞的比例较正常组增多；随着损伤的修复，Rh123阴性活细胞所占比例逐渐降至接近正常。免疫荧光法可见5-FU作用后的上皮细胞涂片上有P-糖蛋白的表达，在蛋白及mRNA水平，5-FU作用后支气管上皮的P-糖蛋白表达均较正常组增加。结论 5-FU作用后，Rh123染色阴性、表达P-糖蛋白的支气管干细胞占残留活细胞的比例增多。由它们完成损伤的修复。     

小鼠气管–支气管上皮细胞的气–液界面培养

目的建立一种小鼠气管–支气管上皮细胞气–液界面(ALI)培养及纤毛摆动频率测量的方法,最大程度还原气道上皮的生理功能。方法利用1 mg/mLⅪⅤ型链蛋白酶冷消化的方法获取BALB/c小鼠气管–支气管上皮细胞,筛选出最佳消化时长以保证所得细胞的数量及活力。差速贴壁法去除成纤维细胞后,接种于Ⅰ型鼠尾胶原预包被的Transwell小室,用不同培养基进行增殖期和ALI分化期培养。结果采用链蛋白酶冷消化12 h、14 h和16 h所得细胞数目分别为(1.78±0.33)×10~5、(1.93±0.26)×10~5和(2.01±0.28)×10~5,经台盼蓝染色活细胞率分别为(96.86±0.25)%、(94.73±1.63)%和(86.87±5.95)%。1周左右细胞铺满小室,继续ALI培养2～3周后光学显微镜下可见纤毛节律性摆动,电镜及免疫荧光均证实纤毛结构。培养所得细胞纤毛摆动频率与小鼠气管在体纤毛摆动频率与一致。结论本实验建立的气管–支气管上皮细胞分离、ALI培养及纤毛摆动频率测量体系简便、稳定、高效、可靠,为探索气道疾病的致病和治疗机制创造了基础,亦可为其他物种气道上皮和(或)其他器官上皮的培养提供参考依据。     

鞘氨醇激酶2抑制5-氟尿嘧啶诱导的人结肠癌HCT116细胞凋亡

目的 探讨鞘氨醇激酶2(SphK2)在5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导的人结肠癌HCT116细胞凋亡中的作用。方法 采用Hoechst33342染色检测5-FU作用48 h后HCT116细胞凋亡形态学的变化;流式细胞术检测5-FU作用48 h后HCT116细胞的凋亡率,并分析SphK2的干扰或过表达对5-FU诱导的HCT116细胞凋亡率的影响;用蛋白质印迹法观察5-FU诱导HCT116细胞SphK2活性的改变及干扰或过表达SphK2对5-FU诱导凋亡中凋亡标记蛋白的影响。结果 5-FU能诱导HCT116细胞凋亡,细胞出现了明显的核固缩、染色质凝集等凋亡形态变化。细胞SphK2被干扰后,与未被干扰的细胞相比,5-FU诱导后的细胞凋亡率增高(P<0.01),凋亡标记蛋白表达水平升高;而过表达SphK2的细胞在5-FU作用下其凋亡率较对照组(空质粒处理)下降(P<0.01),凋亡标记蛋白表达水平亦下降;5-FU可诱导磷酸化SphK2水平增高。结论 SphK2对5-FU诱导的HCT116细胞凋亡具有负调控作用。     

小白菊内酯对EC9706细胞增殖及VEGF、NF-κB P65蛋白表达的影响

目的:探讨小白菊内酯(PTL)对食管癌EC9706细胞的增殖、血管内皮生长因子(VEGF)及核转录因子-κB P65(NF-κB P65)蛋白表达的影响.方法:倒置显微镜下观察不同浓度(20、40和80 μmol/L)的PTL作用48 h后EC9706细胞的形态学变化;MTT法检测20、40和80 μmol/L PTL及20 μmol/L PTL与25 mg/L 5-氟尿嘧啶(5-FU)联用对EC9706细胞增殖的影响;免疫细胞化学法检测20和40 μmol/L的PTL作用72 h后EC9706细胞VEGF和NF-κB P65蛋白表达的改变.结果:①PTL作用EC9706细胞48 h后,细胞数量减少,细胞固缩变圆,核浓缩、核质分布不清,细胞溶解碎裂.②PTL及联合组作用于EC9706细胞24、48和72 h后,相同时间段各组细胞增殖抑制率差异均有统计学意义(χ224 h=31.420,P<0.001;χ248 h=34.590,P<0.001;χ272 h=38.190,P<0.001).PTL对EC9706细胞的增殖有抑制作用;细胞培养72 h后PTL与5-FU联合组对EC9706细胞的抑制作用与50 mg/L 5-FU组相当.③PTL作用EC9706细胞后,与对照组比较VEGF和NF-κB P65蛋白表达均降低(χ2NF-κB P65=25.120,P<0.001;χ2VEGF=22.190,P<0.001).结论:PTL能抑制EC9706细胞的增殖,增加EC9706对5-Fu的敏感性;PTL的抗肿瘤机制可能与抑制NF-κB传导通路有关.     

Shh mRNA在成年大鼠慢性压迫性脊髓损伤后的表达及其意义

目的:观察成年大鼠慢性压迫性脊髓损伤后与发育相关的重要分子Shh mRNA的表达,探讨其在神经再生过程中的作用.方法:将30只同龄Wistar大鼠置入后路渐进式压迫装置,制作成慢性压迫性脊髓损伤模型.随机分为对照组(5只)和慢性脊髓损伤组(25只).应用原位杂交检测方法,于脊髓损伤后1,3,7,14,28 d对损伤区行Shh mRNA检测.结果:脊髓损伤后7 d,Shh mRNA表达水平达到最大值,在损伤区至远端10 mm处的灰质和白质中均有表达,这种高水平的表达至少维持到损伤后28 d.Shh mRNA在室管膜细胞的表达远远低于在灰质和白质中的表达,其在室管膜区域的表达仅限于损伤区域周围5 mm范围内,分布范围远远小于在灰质和白质中的表达.结论:慢性压迫性脊髓损伤可激活Shh mRNA的表达,其表达对脊髓损伤后神经细胞再生的意义值得进一步探讨.     

5-氟尿嘧啶诱发人支气管上皮损伤前后P糖蛋白表达的研究

目的：研究离体人支气管上皮经5-氟尿嘧啶（5-）FU损伤前后P糖蛋白（P-gp）的表达。方法：5-FU造成离体人支气管环严重损伤，分别取正常组及5-FU作用后的支气管上皮，应用流式细胞仪和蛋白印迹法检测P-gP的表达；RT-PCR法检测其mRNA的表达。结果：5-FU作用后支气管上皮细胞中P-gP阳性细胞所占比例较正常组增高，在蛋白及mRNA水平，5-FU作用后支气管上皮P-gp的表达均较正常组增加。结论：5-FU作用后．表达P-gp的支气管干细胞占残留活细胞的比例增多，由它们完成损伤的修复。     

体外培养人胚鼻咽上皮生物学特性的观察——Ⅱ、人胚鼻咽上皮细胞分化的光镜、电镜研究

人胚鼻咽粘膜主要由假复层纤毛柱状上皮被覆,伴有少量过渡型上皮,未见典型的复层鳞状上皮。前者为鼻咽上皮的原基型,由纤柱细胞、杯状细胞、表面未分化细胞、中间细胞和基底细胞组成。纤柱细胞和杯状细胞均由基底细胞、中间细胞和表面未分化细胞分化而来。过渡型上皮由基底细胞向纤毛细胞和杯状细胞分化过程中不同分化阶段的中间细胞及表面未分化细胞所组成。基底细胞和中间细胞的胞浆内含有胞浆泡状系统和张力原纤维,具有双向分化的能力。过渡型上皮是演变为复层鳞状上皮或发生鳞状上皮化生的基础。     

小鼠鼻腔及气管黏膜上皮细胞的构成和纤毛反应性比较研究

目的比较小鼠鼻腔及气管黏膜上皮细胞的构成以及纤毛摆动频率对外源性刺激的反应性。方法 采用酶消化法获取小鼠鼻腔及气管黏膜纤毛细胞,观察纤毛细胞的得率以及ATP和苯扎溴铵对纤毛摆动频率的影响;采用免疫组化染色及扫描电镜观察鼻腔及气管黏膜上皮的细胞构成。结果 ①培养细胞中小鼠鼻甲的纤毛细胞得率可达(45±5)%,气管组织仅有(15±5)%;②免疫组化染色鼻腔及气管黏膜上皮细胞均有乙酰化α-tubulin阳性表达,鼻腔的纤毛细胞层更连续,细胞更密集;③100μmol/LATP均能引起鼻甲及气管的纤毛摆动频率增加,增加率分别为235.06%和118.49%;0.005%苯扎溴铵均能使2个部位的纤毛摆动频率下降,降至原有频率的50.31%和8.27%。2组频率比较差异均有统计学意义,P值分别为0.013和0.004;④扫描电镜观察,鼻腔黏膜上皮中纤毛细胞的比例(90%)明显高于气管上皮纤毛细胞比例(30%～40%)。结论 小鼠鼻腔和气管黏膜上皮中纤毛细胞的比例存在明显差异;2个部位的纤毛摆动频率对外源性刺激的反应程度存在明显差异;从纤毛细胞的数量上看,鼻腔远远高于气管,其中鼻甲是个不容忽视的丰富资源。     

人胎儿喉黏膜上皮细胞的发育分化特点

[目的]研究中国人胎儿喉黏膜上皮细胞发育分化的特点.[方法]收集9～40周胎儿喉标本33例.应用连续切片HE染色、细胞角蛋白免疫组化染色、扫描电镜和透射电镜观察其黏膜上皮.[结果]9周胎喉黏膜由1～2层低柱状细胞组成,仅表层细胞表达微弱的角蛋白,13周后出现多种类型的上皮细胞,上皮全层均表达细胞角蛋白;会厌舌面、声带被覆鳞状上皮,会厌喉面、室带、喉室及声门下区被覆假复层纤毛柱状上皮,其基底细胞和中间细胞的胞浆内含有丰富的胞浆泡状系统、张力原纤维和桥粒;过渡上皮和纤毛上皮中均散在岛状鳞状上皮但出现时间不一致.[结论]人喉黏膜上皮细胞的分化发生于胎儿9～13周期间;纤毛上皮的基底细胞和中间细胞具有双向分化的潜能;过渡上皮和纤毛上皮中出现岛状鳞状上皮是生理现象,前者由复层立方上皮分化而来,后者由纤毛上皮分化而来.     

大白鼠鼻咽部中间型上皮的超微结构

本文对16例大白鼠鼻咽部中间型上皮(过渡上皮)进行了电镜观察。观察表明中间型上皮的基本特征是细胞胞质内含有发育良好的管泡状系统和较丰富的张力微丝(束)。这种上皮有别于鳞状化生上皮,是一种成熟的且终生存在的上皮,其超微结构介于复层鳞状上皮与假复层纤毛柱状上皮之间的一种中间型上皮。     

新生儿睾丸和副睾的组织学观察

新生男婴睾丸的曲精小管上皮,含精原细胞,可区分A型和B型,支持细胞为不规则形,数量较多。间质细胞,成群分布,细胞多边形,胞质含脂滴,嗜苏丹黑B颗粒或嗜六胺银颗粒,表明其已有分泌功能。输出小管和副睾管已可区分两种上皮细胞。     

Shh信号通路对小鼠胚胎肺发育的调控作用

目的探讨经典Shh信号通路对小鼠胚胎肺发育过程中上皮、间质（支气管软骨、平滑肌）发育的调控作用。方法利用免 疫组化检测Shh通路受体Smo（Smoothened）以及血小板源性生长因子受体（Pdgfr-α）的表达;利用Pdgfr-α间质特异性表达的特 点构建Pdgfr-α-cre,通过他莫昔芬的诱导,在E12.5-E16.5（E, embryo）天转基因小鼠肺间质中特异性敲除Shh 关键信号分子 Smo;利用免疫荧光观察E12.5-E16.5小鼠胚胎肺间质特异性敲除Shh信号通路之后,小鼠胚胎肺发育过程中上皮、间质（支气管 软骨、平滑肌）发育的改变,探讨Shh信号通路在小鼠胚胎肺发育过程中对上皮-间质转化的作用。结果Smo在假腺期早期的肺 上皮与间质中显著表达,后表达量逐渐下调,主要集中在肺间质,Pdgfr-α在假腺期早期胚胎肺中集中在远端肺上皮及间质,后期 逐渐往近端间质发展,直至集中在主支气管周围的近端间质;首次利用Pdgfr-α-Cre系统在间质中特异性敲除Smo,成功制备了 Smo缺失小鼠模型;与对照组肺相比,E12.5-E16.5基因敲除组小鼠的肺体积缩小,支气管分支形成减少;近端上皮指标P63的表 达量下降（P<0.05）;平滑肌标志物表达水平发生改变;支气管软骨发育滞后,黏蛋白表达量下降。结论Shh信号通路的时空特 异表达在小鼠胚胎肺上皮、间质（支气管软骨、平滑肌）发育的起着重要的调控作用。