Characterization and safety assessment of bioengineered limbal epithelium

Transplantation of cultivated limbal epithelium on substrates such as amniotic membrane is an established treatment for severe ocular surface disease with limbal stem cell deficiency. In this study, we adapted an established method to generate sheets of limbal epithelium on amniotic membrane and characterized the cells contained in these sheets and tested them for safety with regard to microbial contamination. Human limbal biopsies were cultivated on denuded amniotic membranes. After three weeks of culture, the phenotypes of cultivated cells were analyzed by immunohistochemistry and real-time RT-PCR for the expression of a panel of specific markers. Cultivated limbal epithelial cell sheets were also analyzed by scanning (SEM) and transmission (TEM) electron microscopy. Sterility tests and mycoplasma assays were conducted for the safety of product. A confluent layer of polygonal cells was formed in 2 weeks and 1-3 stratified layer of cells were observed after three weeks of culture. Cultivated cells were positive for p63, K3, K19, and involucrin but negative for K14, integrin alpha9 and ABCG2 when analyzed by immunohistochemistry. Expression of molecular markers was detectable with real-time RT-PCR. SEM showed multilayer of flat squamous polygonal epithelial cells. Desmosomal and hemidesmosomal attachments were evident. Our study showed that cultivated limbal epithelium consists of limbal progenitors as well as differentiated corneal epithelial cells. SEM and TEM analysis showed cultivated cells demonstrated typical features of corneal epithelium. The risk of contamination is low and can be prevented by culturing the cells in a clean room facility complying to Good Manufacturing Practice standard.     

兔角膜缘上皮细胞培养联合羊膜行自体移植的实验研究

目的：用体外培养的角膜缘上皮细胞联合人羊膜的方法，行自体移植治疗角膜缘干细胞完全缺乏的兔眼。方法：制作10只兔右眼于细胞缺乏的模型，取其中7只兔的左眼上方角膜缘取一小块组织进行体外培养，并传代在无上皮细胞的人羊膜上。1个月后，手术切除10只兔受伤眼角膜表面被覆的新生血管膜和结膜上皮，7眼接受了含自体培养上皮细胞的羊膜移植，另3眼仅移植无上皮细胞的羊膜。结果：1周后原代培养的角膜缘上皮细胞融合，传代至无上皮细胞的人羊膜上继续生长2～3周，角膜上皮细胞可牢固的附着于羊膜上。移植了含有角膜上皮细胞的羊膜的兔子，术后早期都形成了角膜上皮化，并明显抑制了新生血管的再生，而接受羊膜移植的兔子，术后又出现明显的新生血管。结论：利用无上皮细胞的羊膜作为载体，培养角膜缘上皮细胞并自体移植可以恢复角膜上皮化、抑制新生血管生长。     

去上皮羊膜上培养兔角膜缘干细胞的实验研究

目的探讨去上皮羊膜上培养兔角膜缘干细胞的可行性。方法取小块兔角膜缘组织,采用组织块 细胞悬液共培养,待细胞长至对数生长期,分别传代于去上皮羊膜和完整羊膜,甲基偶氮蓝比色(MTT)法对比两组细胞增殖率,并行AE_5免疫鉴定。结果原代细胞接种7d左右,生长至对数生长期,细胞融合成单层。去上皮羊膜组细胞传代培养效果明显优于完整羊膜组。AE_5单克隆抗体染色强阳性。结论去上皮羊膜上培养出的兔角膜缘组织既有角膜上皮特性,又具有强的增殖潜力。     

以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜的构建及移植

目的进行体外分离和培养兔角膜缘干细胞,使之成为一种上皮组织,以便进行角膜移植。方法组织块法体外培养兔角膜缘干细胞：角膜缘组织块作为外植体,在脱细胞猪角膜基质上培养;获得的复合角膜上皮组织移植于兔眼,观察并记录兔角膜组织生长情况,待角膜组织生长良好后做免疫组织化学鉴定。结果兔角膜缘组织应用组织块法在脱细胞角膜基质上生长9~10 d后达到80%汇合状态,显微镜下动态观察细胞生长良好,增殖能力较高,将组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植于兔眼后,4~5 d角膜上皮光滑,20~21 d角膜变为透明,荧光素染色只见缝线处少许着色,期间未见角膜移植排斥反应。术后30 d HE染色显示角膜组织与宿主角膜组织结合良好,上皮细胞可见4~5层结构,可见角膜缘干细胞多呈卵圆形;免疫荧光染色可见培养的细胞P63、CK3单克隆抗体呈阳性表达。结论以组织块法生长的以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜可在角膜缘干细胞缺乏的兔眼上生长良好。     

P63标记角膜缘干细胞的可行性研究

目的探讨p63蛋白（P63）作为角膜缘干细胞阳性标记物的可行性和意义，为研究和鉴定角膜缘干细胞存活、增殖和分化情况提供依据。方法取正常新西兰兔角膜全层标本5份（包括角膜缘和结膜），同时取角膜缘干细胞移植后3个月上皮生长良好的角膜全层标本和角膜失代偿标本各5份。免疫组织化学SP三步法检测P63在不同组标本供体干细胞的表达情况。结果P63在角膜缘干细胞核内呈高表达，而短暂扩充细胞虽然也具备一定的增殖和分化能力，但是P63表达较少。角膜中央和结膜呈阴性表达。结论P63可以特异性地标记角膜缘干细胞，对角膜缘干细胞的研究和鉴定及其在眼表重建的应用具有一定的价值。     

兔结膜基质诱导人骨髓间质干细胞分化的初步研究

 【目的】观察人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在保存人羊膜及兔眼表结膜基质上分化的情况。【方法】24只新西兰兔随机分为2组。实验组：培养有人MSCs的羊膜移植组，将人MSCs接种在保存人羊膜上培养4d，用5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记后移植到兔眼表结膜缺损区；对照组，单纯羊膜移植组。分别于移植后1，2，3，4，6和8周，摘取各组实验眼行组织学和免疫组织化学检查，组织学检查移植到兔结膜基质的MSCs的存活、形态变化以及移植局部的反应等情况；免疫组织化学检测移植到结膜基质的带有BrdU标记的细胞角蛋白3／12（CK3／CKl2）和角蛋白13（CK13）的表达。【结果】MSCs接种到羊膜后能在羊膜上生长，与羊膜共培养4d后，MSCs贴附羊膜生长迅速，组织学特征无明显改变。用羊膜负载MSCs移植到兔结膜缺损区，术后免疫组织化学检测结膜上皮层CK13表达阳性，CK3／CK12表达阴性，在重建的结膜上皮层可检测到BrdU核阳性细胞，未见异常增殖细胞。【结论】人羊膜可作为MSCs的载体，采用人羊膜负载MSCs行兔结膜移植，MSCs能在兔结膜上皮层存活并增殖。     

角膜缘干细胞移植后供体干细胞的检测与分析

目的观察新西兰兔角膜缘干细胞移植后供体干细胞数量的变化与角膜上皮化的关系,为角膜缘干细胞移植手术效果提供理论依据.方法新西兰兔30只,分为自体移植和异体移植两组,建立角膜缘干细胞缺损动物模型,分别进行自体和异体角膜缘干细胞移植.术后1周、1月、3月空气栓塞各处死5只,取包括角膜缘的角膜标本,免疫组织化学p63蛋白抗体检测供体干细胞的存活数量和增殖分化状况,比较两组的移植效果.结果自体移植术后1周,供体干细胞仍然局限于受体角膜缘;1个月后,上皮细胞覆盖角膜全层,但是层次非常少;3个月后,干细胞的储备数量基本上恢复到正常水平,角膜完全上皮化.异体移植1周,干细胞的数量有一定的减少;1个月后,角膜缘干细胞储备数量明显减少;3个月后,角膜缘已经检测不到干细胞.结论干细胞的储备数量和增殖分化状况直接影响到角膜上皮化的结局;有效的干细胞检测结果可以为临床角膜缘干细胞移植效果提供依据,p63蛋白抗体可以作为一个检测角膜缘干细胞的特异指标.     

人孕中期胎儿结膜上皮干细胞定位特征的免疫组化研究

目的研究孕中期不同胎龄胎儿结膜上皮细胞中,角蛋白7、14、19p63和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达及分布情况,探讨人胎儿结膜上皮干细胞的定位特征。方法取正常引产6h内的孕中期不同胎龄胎儿眼球前部组织,采用HE、免疫组化染色法,观察角蛋白p63和PCNA的表达及分布情况。结果PCNA及p63表达情况一致,主要表达在睑缘皮肤黏膜交界处及角膜缘上皮深层细胞。角蛋白19主要表达在穹窿部及球结膜上皮细胞。角蛋白14表达在睑缘皮肤黏膜交界处及睑结膜上皮细胞。角蛋白7表达在穹隆部至角膜缘上皮细胞。结论细胞角蛋白7、14、19和p63及PCNA在人孕中期不同胎龄的胎儿结膜上皮细胞的特征性表达表明,人孕中期胎儿结膜上皮细胞普遍具有增殖的活性,干细胞位于睑缘皮肤黏膜交界处和角膜缘上皮细胞的深层。     

自体角膜干细胞移植治疗翼状胬肉的临床分析

目的:观察自体角膜干细胞移植治疗翼状胬肉的临床疗效。方法:对18例19眼初发性翼状胬肉进行自体角膜干细胞移植,随访10~36月。结果:自体角膜缘移植片早期轻度水肿,1周内水肿消失,2~3周巩膜裸露区结膜上皮修复,长入新生血管。随访期内,无胬肉复发,无明显并发症。结论:自体角膜干细胞移植治疗初发性翼状胬肉安全、有效。     

Transplantation of corneal stem cells cultured on amniotic membrane for cornea l burn: experimental and clinical study

目的：探讨离体培养的角膜干细胞增殖分化特性,观察干细胞羊膜移植片治疗角膜缘功能障碍的效果。方法：用克隆形成率（colony-forming efficiency,CFE）、免疫组织化学染色等方法观察培养角膜干细胞的增殖力和分化表达状况。角膜干细胞培养后接种生长于羊膜上进行干细胞羊膜片移植,观察角膜上皮、组织浸润和新生血管情况。结果：原代和传第1代角膜干细胞具有高增殖力,部分表达角质蛋白K3,角膜干细胞在羊膜上能够继续增殖分化为多层细胞结构的角膜上皮细胞层;角膜干细胞移植术后可以在角膜比存活,角膜比移植片紧密贴附,角膜上皮完整,经度基质炎性浸润,浅层新生血管减少,深层新生血管充盈减轻,睑球粘连得到松解。结论：角膜缘干细胞羊膜片移植治疗角膜缘功能障碍能够使患获得进一步进行角膜移植的条件。     

自体角膜缘上皮移植和羊膜移植治疗翼状胬肉的疗效观察

目的 :比较自体角膜缘上皮移植和羊膜移植治疗翼状胬肉的疗效。方法 :随机将翼状胬肉 5 8例、6 2眼分为A、B两组 ,按Prabhasawat等提出的疗效标准进行疗效分级评价。A组 30例、32眼行自体角膜缘上皮移植术 ;B组 2 8例、30眼行羊膜移植术。术后随访 1年 ,比较两组的治愈情况、视力及角膜散光度。结果 :A组 32眼中 31眼获得临床治愈 ,治愈率 96 .87% ,出现明显纤维增生 1眼 ,占 3.13% ;B组 30眼中 2 4眼获得临床治愈 ,治愈率 80 % ,出现明显纤维增生 4眼 ,占 13.33% ,真性复发 2眼 ,占 6 .6 7%。两组治愈率差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ,术前术后视力及角膜散光度差异有高度显著性 (P <0 .0 1)。 结论 :自体角膜缘上皮移植有利于重建角膜缘屏障功能 ,临床疗效优于单纯羊膜移植术。手术切除翼状胬肉能有效地减轻角膜散光 ,提高视力。     

角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉复发原因分析

目的为探讨角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉的临床效果。方法采用角膜缘干细胞移植联合常规单纯切除手术治疗原发性及复发性翼状胬肉79例（85眼）,术后随访12～18个月,观察角膜创面愈合时间及复发率。结果81眼（95．29％）治愈;4眼（4．71％）复发,角膜缘干细胞移植后角膜创面愈合时间平均3．46d。复发原因可能与胬肉组织残留及止血不彻底、移植结膜片固位不好或正反面翻转、移植结膜片面积较巩膜暴露区过小、术后停药早及年龄等有关。结论角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉安全有效,胬肉组织切除干净、止血彻底、结膜瓣的制作及固位、术后皮质类固醇药物的应用是成功的关键。     

兔角膜缘干细胞的形态学研究

目的 探讨兔角膜缘干细胞(1imbal stem cells,LSCs)的形态学特征、数量及分布.方法 健康成年新西兰大耳兔30只,体质量2.0～2.5 kg,雌雄不分,取双侧眼球,常规石蜡切片,HE染色及免疫组化p63染色显示角膜缘一般特征及LSCs的分布,并用BioMias图像分析软件对LSCs进行计数.另外取3只兔眼角膜缘制作超薄切片,透射电镜观察.结果 ①角膜缘上皮细胞排列紧密,层数较多,基底层细胞呈矮柱状或立方形,核大而圆,位于细胞中央,着色较深.LSCs(p63阳性细胞)呈矮柱状或立方形,多位于角膜缘上皮基底层,在角膜缘浅层及角膜边缘有少量分布,在角膜中央上皮未见LSCs出现.②透射电镜观察LSCs核较大,形状不规则,核内常染色质较多,异染色质散在分布,未凝集成块.细胞质少,含较丰富的游离核糖体,其他细胞器少,细胞间可见较多的缝隙连接.③图像分析显示高倍镜视野下角膜缘上皮LSCs数量为(35.25±8.93)个.结论 ①LSCs具有原始细胞的超微结构特征,与其他干细胞形态相似.②LSCs主要位于角膜缘上皮基底层,在角膜缘浅层上皮及角膜边缘上皮内也有少量LSCs存在,在中央角膜上皮未见LSCs分布.     

Amniotic membrane utilization in ophthalmological surgical procedures

The amniotic membrane, which is the innermost layer of the fetal membranes, is composed of a single layer of epithelial cells that lie on a basement membrane, and of a non-vascular collagenous stroma. These three components give the amniotic membrane its beneficial properties. The first therapeutic application of the amniotic membrane was in 1910, when it was used in skin transplantation. Thereafter, it was used in surgical procedures related to the abdomen, genitourinary tract and to the head and neck. In ophthalmology, De Roth, in 1940, was the first to use the amniotic membrane for conjunctival reconstruction. However, it was only in 1995 that publications on the subject started appearing again, when Tseng and many others began using the amniotic membrane again in the treatment of ocular surface (cornea and conjunctiva) diseases. In cases of total stem cell deficiency, amniotic membrane transplantation has been shown to be very useful when used in conjunction with limbal autografts or allografts. At this stage, however, further studies are needed to elucidate the real potential of the amniotic membrane in the treatment of different ocular surface (and other) disorders, and its exact mechanism(s) of action. This will help establish the applications of such treatment in medicine, in general, and in ophthalmology, in particular.     

自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉60例

目的 观察自体角膜缘干细胞移植对翼状胬肉疗效的影响。方法 在手术显微镜下,采用自体角膜缘干细胞移植治疗初发性和复发性翼状胬肉60例(65眼),术后随访观察6个月～4年,结果 54例(58眼)痊愈,6例(7眼)复发,术后复发率为12．07％。结论 自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉,有助于角膜、结膜的重建,阻止新生血管及结膜上皮侵入角膜,有效抑制了胬肉的复发,是治疗翼状胬肉的理想手术方法。     

角膜缘上皮移植和选择性联合羊膜移植治疗化学伤后眼表疾患

目的：观察因化学性烧伤后的眼球表面疾病治疗效果。方法：采用角膜缘上皮移植和选择性联合羊膜移植治疗眼化学性烧伤。结果：形成了稳定的眼球表现,视力均有不同程度提高。结论：本术式针对眼化学烧伤能有效修复角膜缘缺损,重建眼球表面而获理想临床疗效。     

三种手术方法预防翼状胬肉复发疗效分析

目的　探讨预防翼状胬肉复发的手术方法。方法　将 115眼翼状胬肉随机分为三组 ,分别予不同手术方法治疗。A组 3 5眼行翼状胬肉切除巩膜暴露 +丝裂霉素C(MitomycinC ,以下简称MMC)棉片敷贴 ;B组 3 7眼行翼状胬肉切除 +角膜缘干细胞移植 ;C组 43眼予翼状胬肉切除 +角膜缘干细胞移植 +MMC。观察三组复发率 ,角膜上皮愈合时间及并发症发生情况。结果　随访 1～ 3年半 ,A组复发率 2 5 .71%,B组复发率 13 .5 1%,C组复发率为 0 ,C组显著低于A、B组 (P<0 .0 5 )。A组角膜上皮愈合天数为 6± 1.17d ,B组为 5± 0 .96d ,C组为 4± 0 .64d ,C组愈合时间显著快于A、B组 (P <0 .0 1)。A组 2例浅层巩膜融解 ,C组 1例浅层角膜融解 ,均在 1周内治愈 ,未见其他严重并发症。结论　翼状胬肉切除 +角膜缘干细胞移植 +MMC治疗翼状胬肉疗效确切 ,并发症少 ,复发率低 ,值得临床推广。     

胬肉切除联合羊膜和自体角膜缘干细胞移植临床疗效观察

目的:探讨胬肉切除联合羊膜和自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉的疗效。方法:采用胬肉切除联合羊膜和自体角膜缘干细胞移植治疗30例翼状胬肉患者,并以同期30例翼胬肉切除联合角膜缘干细胞移植为对照,对比两种手术方法的疗效。结果:两组患者上皮愈合时间和术后不适症状消失时间差异不大,无统计学意义(P>0.05),但是胬肉切除联合羊膜和自体角膜缘干细胞移植治疗复发率(2.9%)明显低于对照组(11.4%)(P<0.05)。结论:治疗翼状胬肉在胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植的基础上再联合羊膜移植,术后恢复快,复发率低,疗效理想。     

表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤修复糖尿病难愈创面

目的探讨表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤修复糖尿病难愈创面的可行性和方法。方法分离培养SD大鼠皮肤表皮干细胞(ESCs),并用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记。建立糖尿病SD大鼠创面模型,随机分为A、B、C 3组,A组创面移植羊膜负载BrdU标记的ESCs组织工程皮肤;B组创面移植羊膜;C组为空白对照组,创面未给予干预。观察创面愈合情况、计算创面愈合率,HE及免疫组织化学SP法检测创面愈合组织中BrdU及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。用图像分析软件测量阳性细胞积分光密度平均值。结果与B、C组比较,A组创面愈合速度加快,创面愈合率明显增高,组间比较差异有显著性统计学意义(P0.01)。A组创面及新生表皮中可见BrdU阳性细胞,B、C组皮肤创面组织中始终未见BrdU阳性细胞。各组创面组织中可见PCNA阳性细胞表达,但A组的阳性细胞积分光密度值与B、C组比较差异显著(P0.01)。结论表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤可有效促进糖尿病创面愈合。     

羊膜移植术和羊膜联合角膜缘上皮移植术治疗复杂性翼状胬肉

目的 :比较羊膜移植术与羊膜联合自体角膜缘上皮移植术治疗各种复杂性翼状胬肉的疗效。方法 :对 42例 ( 48眼 )复发性翼状胬肉和假性胬肉并睑球粘连患者分别行羊膜移植术 ( 2 0例 ,2 2眼 )和羊膜联合自体角膜缘上皮移植术 ( 2 2例 2 6眼 ) ;术后随访 6～ 12 (平均 8.5 )个月。结果 :术后 2周 ,羊膜联合自体角膜缘上皮移植术组 ,除 2眼外角膜创面完全上皮化 ,达到无瘢痕性愈和 ;而羊膜移植术组有 8眼角膜创面未完全修复 (P <0 .0 5 )。随访 1年 ,羊膜联合自体角膜缘上皮移植术组未见无排斥反应发生和胬肉复发 ,而羊膜移植术组有 3眼出现不同程度胬肉复发。结论 :羊膜联合自体角膜缘上皮移植术较单纯羊膜移植术治疗复发性或假性翼状胬肉 ,能更有效地抑制结膜下纤维增生、重建角膜缘屏障、促进角膜创面修复 ,从而提高治疗效果 ,降低复发率