云南省丽江市古城区鼠疫疫源地噬菌体的分离及鉴定

目的 调查丽江市古城区野鼠鼠疫疫源地宿主动物携带鼠疫噬菌体情况,并探讨其流行病学意义,为野鼠鼠疫疫源地宿主动物的防制提供科学依据。方法 2017年9月于丽江市古城区5个乡镇共13个野鼠鼠疫疫源地的鼠疫流行自然村采用5 m夹线法进行捕鼠,以鼠疫疫苗株EV76为饲养菌（即鼠疫噬菌体的宿主菌）,采用双层平板法分离鼠疫噬菌体,对所分离噬菌体进行噬菌斑观察和电镜下形态鉴定。结果 在丽江古城区5个乡镇共捕鼠766只,其中七河321只,文化镇131只,开南良美48只,大东乡117只,金安乡149只,采集鼠回盲段样本766份,在34份样本中分离34株鼠疫噬菌体,鼠疫噬菌体分离率4.43%;5个乡镇均分离到鼠疫噬菌体,其中七河噬菌体阳性率较高（6.85%）。34株鼠疫噬菌体中,29株分离自齐氏姬鼠,2株分离自大绒鼠,3株分别来自灰麝鼩、斯氏家鼠和树鼩。齐氏姬鼠的噬菌体阳性率显著高于其他鼠种,其所分离鼠疫噬菌体的噬斑出现特大（直径2.5~<3.5 mm）、大（直径1.5~<2.5 mm）、中（直径0.5~<1.5 mm）及小（直径<0.5 mm）四种噬菌斑。结论 丽江市古城区野鼠鼠疫疫源地宿主动物中携带一定数量的鼠疫噬菌体;因齐氏姬鼠的噬菌体携带率远高于其他鼠种,证明齐氏姬鼠是该疫源地的主要宿主。     

1株温和性噬菌体的发现及其流行病学意义

目的对云南省野鼠鼠疫疫源地齐氏姬鼠盲肠内容物中分离的1株鼠疫噬菌体(L128m)进行鉴定,探讨鼠疫自然疫源地微生态因素保存鼠疫自然疫源性发挥的作用。方法以鼠疫疫苗株EV 76为宿主菌,采用双层琼脂平皿法从云南省鼠疫疫源地齐氏姬鼠盲肠中分离1株温和噬菌体;描述其形态特征;测定裂解能力、宿主谱。结果鼠疫噬菌体L128m形成的噬菌斑中心和边缘均模糊,直径为0.9~1.0 mm,其为溶原性噬菌体;通过液体增殖培养后其效价达到106~P FU/ml;电镜观察其形态呈蝌蚪形,头部为正多面体结构,头部直径约为61 nm,尾部长约155 nm,带有一伸缩的尾鞘,归类为肌尾噬菌体。宿主谱评价发现仅裂解鼠疫疫苗株。结论从1只齐氏姬鼠盲肠内容物中分离的鼠疫噬菌体属溶原性噬菌体,它的发现对我国鼠疫疫源地宿主动物肠道微生态学和流行病学研究具有重要意义。     

云南省普洱市家鼠鼠疫疫源地鼠疫噬菌体的分离及鉴定

目的 调查云南省普洱市家鼠鼠疫疫源地宿主动物中携带鼠疫噬菌体的情况,并进行鉴定。 方法 2015年11月—2016年6月在普洱市的澜沧县、墨江县及思茅区选取9个疫点,采用鼠铗法捕获老鼠,取其肠道标本;以鼠疫疫苗株EV76为饲养菌,采用双层平板法分离鼠疫噬菌体,并对噬菌体进行电镜扫描等鉴定。同时对肠道标本进行鼠疫菌特异基因caf1检测。 结果 共采集286份样本,从中分离到4株鼠疫噬菌体,总分离率1.40%;4株鼠疫噬菌体分离自3个疫点,其中澜沧县勐朗镇勐宾村自226份标本中分离到2株,墨江县龙潭乡大沙坝村自4份标本中分离到1株,思茅区云仙乡大石头村自7份标本中分离到1株;4株鼠疫噬菌体中,有3株分离自黄胸鼠,1株分离自斯氏家鼠;4株鼠疫噬菌体初次分离时其噬斑表现出多态性,选择其中2株噬菌体进行电镜扫描,皆为肌尾病毒科噬菌体;所有肠道标本caf1检测阴性。 结论 首次在普洱市家鼠鼠疫疫源地中分离到鼠疫噬菌体,所分鼠疫噬菌体为肌尾病毒科噬菌体且具有多态性,值得进一步研究。     

剑川野鼠鼠疫疫源地鼠疫噬菌体的分离及其流行病学意义

目的 调查剑川野鼠鼠疫疫源地宿主动物中是否携带鼠疫噬菌体,并探讨其流行病学意义。方法 2017年1-6月采集剑川野鼠鼠疫疫源地4个曾流行过鼠疫乡镇6个自然村的鼠类标本,以鼠疫疫苗株EV76为饲养菌,采用双层平板法分离鼠疫噬菌体,并对分离结果进行流行病学分析,同时挑取部分噬菌体进行电镜扫描。结果 共获得641份标本（齐氏姬鼠334只,大绒鼠236只,其余71只）,分离到9株鼠疫噬菌体,总分离率1.40%;有4个疫点（白山母村、石龙村、新松村、大庆村）分离到了鼠疫噬菌体,另外2个点（长乐村、西门社区）未分到鼠疫噬菌体;9株鼠疫噬菌体中,8株分离自齐氏姬鼠,1株自大绒鼠;初次分离这些鼠疫噬菌体时,其噬斑在双层平板上表现为大（直径~2.0 mm）、中（~1.0 mm）及小（<0.5 mm）3种噬斑;4株有代表性噬菌体皆为肌尾病毒科噬菌体。结论 剑川野鼠鼠疫疫源地中普遍存在鼠疫噬菌体,齐氏姬鼠是主要的携带宿主,所分鼠疫噬菌体为肌尾病毒科噬菌体且具有多态性,值得进一步研究。     

实验环境中野生型鼠疫噬菌体的生长表型特征

目的 观察野生型鼠疫噬菌体在不同实验培养环境中的生长表型特征，为后续噬菌体的生物学特性鉴定及其与宿主菌相互作用研究提供科学依据。方法 利用液体培养法、固体培养法和基于OmniLogTM微生物鉴定系统的微量液体培养法检测3株野生型鼠疫噬菌体的生长情况。结果 基于LB液体培养基的生长结果显示，鼠疫噬菌体476号经28℃和37℃作用20～24 h后生长状况优于37℃培养的鼠疫噬菌体087号和072204号，37℃培养的鼠疫噬菌体087号优于072204号。以鼠疫疫苗株EV76为宿主菌，鼠疫噬菌体476号在双层琼脂培养基上经28℃和37℃培养20～24 h后产生较为清晰的噬菌斑；鼠疫噬菌体087号和072204号经37℃培养20～24 h后在双层琼脂培养基上产生不透明的噬菌斑。基于OmniLog TM系统微量液体培养法的生长结果显示，3株鼠疫噬菌体经33℃裂解鼠疫疫苗株EV76时，通过96孔微量板曲线图显示第1列出现横线，且峰值不超过100，随着噬菌体数量的降低，稀释试验孔依次均出现与鼠疫疫苗株EV76相似的生长曲线，实验孔中四唑类染料颜色随着噬菌体数量的减少和宿主菌数量的增多而逐渐加深。由此...     

青海省乌兰县与同德县鼠疫噬菌体分离及流行病学比较分析

目的 对青海省乌兰县和同德县喜马拉雅旱獭采集到的鼠疫噬菌体进行分离及流行病学分析，掌握喜马拉雅旱獭鼠疫疫情的发展趋势和鼠疫防控预警。方法 利用Luria-Bertani(LB)液体培养基和双层琼脂平板进行纯化，分析噬菌体裂解谱，噬菌体分离率比较采用t检验。结果 乌兰县与同德县100份喜马拉雅旱獭肠道样品分别分离到噬菌体14株和1株，分离率为14.00%和1.00%,两地噬菌体的分离率差异有统计学意义(t=3.583,P=0.001);喜马拉雅旱獭的爪子、肝脏和脾脏样品均未分离到噬菌体。鼠疫噬菌体裂解谱结果显示，乌兰县1株噬菌体分离株仅能裂解18株鼠疫耶尔森菌，裂解率为32.73%,其他13株与同德县的1株噬菌体基本可全部裂解所选的55株鼠疫耶尔森菌，裂解率为89.09%～100.00%。结论 乌兰县喜马拉雅旱獭所采集样品的鼠疫噬菌体分离率较高，符合当地动物间鼠疫疫情高发现状；同德县虽长期处于鼠疫疫情静息状态，但喜马拉雅旱獭所采集的样品分离到鼠疫噬菌体，或可间接指示该地区动物间鼠疫疫情的存在。     

基于微量液体培养基间接评估鼠疫噬菌体生长方法的建立

目的 利用微量液体培养基建立评估鼠疫噬菌体生长的方法，为今后鼠疫噬菌体的分离、宿主谱鉴定、生物学特性研究等提供技术依据。方法 利用OmniLog TM微生物鉴定系统，检测微生物细胞对不同碳源呼吸代谢导致的显色反应和微生物生长造成浊度差异的原理，采用微量液体培养法检测诊断用鼠疫噬菌体在2株鼠疫耶尔森菌(鼠疫弱毒菌EV₇₆、614F)和4株非鼠疫耶尔森菌(假结核耶尔森菌PTB3、PTB5、大肠杆菌V₅₁₇、小肠结肠炎耶尔森菌52302-2)的生长情况。结果 实验菌株及诊断用鼠疫噬菌体混合物经OmniLog TM微生物鉴定系统33℃作用48h,以鼠疫疫苗株EV₇₆、鼠疫弱毒菌614F为试验菌，试验行孔的生长曲线呈一条横线，且细菌浓度对数值不超过100;四唑类染料的颜色随着噬菌体数量的减少和宿主菌数量的增多逐渐加深，表明诊断用鼠疫噬菌体能感染鼠疫弱毒菌EV₇₆和614F。以假结核耶尔森菌PTB3、PTB5、大肠杆菌V₅₁₇、小肠结肠炎耶尔森菌52302-2 4株非鼠疫耶尔森菌为试验菌，...     

云南鼠疫近史疫区弥渡县鼠疫噬菌体的分离及其流行病学意义

目的调查云南鼠疫近史疫区弥渡县鼠疫宿主动物中是否携带鼠疫噬菌体,并探讨其流行病学意义。方法选取弥渡县曾流行过鼠疫的6个乡镇进行鼠类标本(盲肠)的采集,以鼠疫疫苗株EV 76为饲养菌,采用双层平板法分离鼠疫噬菌体,分离结果利用SPSS 20.0进行描述流行病学分析,同时挑取部分噬菌体进行电镜扫描。结果 (1)共获得287份标本(其中中华姬鼠123只,黄胸鼠104只,其余鼠种60只),分离到21株鼠疫噬菌体,分离率为7.32%;(2)弥渡县的2个乡镇(寅街镇、苴力镇)分离到鼠疫噬菌体,另外4个乡镇(弥城镇、新街镇、红岩镇及弥祉乡)未分离到鼠疫噬菌体;(3)21株鼠疫噬菌体中,14株分离自中华姬鼠,4株分离自黄胸鼠,2株分离自齐氏姬鼠,1株分离自臭鼩鼱;(4)初次分离到鼠疫噬菌体时,其噬斑在双层平板上呈现出多态性,大噬斑(直径3～4 mm)、中等噬斑(直径1～2 mm)及小噬斑(直径1 mm)均存在;(5)4株代表性噬菌体皆为肌尾病毒科噬菌体。结论云南鼠疫近史疫区弥渡县普遍存在鼠疫噬菌体,可推定该地鼠疫自然疫源性长期存在,且所分鼠疫噬菌体具有一定多态性,提示应从基因组学及生态学方面,对其在鼠疫及其噬菌体微生态中的作用进行研究。     

青藏高原野生型鼠疫噬菌体对鼠疫诊断噬菌体耐受株的特异性裂解

目的研究青藏高原野生型鼠疫噬菌体对鼠疫诊断噬菌体耐受株的特异性。方法 18株野生型鼠疫噬菌体通过富集、分纯后,利用双层琼脂平板法检测其对实验室诱导的3株鼠疫诊断噬菌体耐受株的特异性裂解能力。结果分离自青藏高原鼠疫疫源地的18株野生型鼠疫噬菌体对典型鼠疫弱毒菌EV 76和0614F均能完全裂解,对R-0614F-10代菌株不完全裂解,对R-0614F-38代、R-0614F-43代不裂解,这与鼠疫诊断噬菌体Yep-phi对R-0614F-10代、R-0614F-38代、R-0614F-43代的裂解能力一致。选取3株野生型鼠疫噬菌体作用于鼠疫诊断噬菌体耐受株R-0614F-12代,形成的噬菌斑大小不一致,直径为2~10 mm,边缘不整齐,中心有再生菌生长。结论 18株野生型鼠疫噬菌体对3株鼠疫诊断噬菌体耐受株裂解作用的特异性可能与鼠疫菌细胞壁受体结构和菌株基因组序列发生改变有关。     

长期低温保藏野生型鼠疫耶尔森菌噬菌体的活性观察及分析

目的观察长期低温保藏野生型鼠疫耶尔森菌噬菌体的活性。方法采用液体法、点滴法和双层琼脂平皿法检测不同保藏时间野生型鼠疫耶尔森菌噬菌体的效价。结果分离自四川省石渠县的3株野生型鼠疫耶尔森菌噬菌体,于1998年采用液体法检测其效价分别为10~(-4)、10~(-4)、10~(-9),4℃保藏10年后采用点滴法测定3株鼠疫噬菌体,发现川4和川157不完全裂解,川212完全裂解,经过20年采用双层琼脂平板法测定其效价分别为10、10、10~4PFU/ml。分离自青海、西藏的9株鼠疫耶尔森菌噬菌体4℃保藏了10年,尽管效价降低了1～3个梯度,但仍以10~4～10~6PFU/ml的低效价状态存活。结论野生型鼠疫耶尔森菌噬菌体以赫氏肉汤作为保护介质,密封于普通安瓿内,4℃保藏10～20年仍然具有较低的活性。该悬液保藏方法操作简便、有效且成本低廉,适合于实验室和野外鼠疫检测工作时培养和保藏鼠疫耶尔森菌噬菌体。     

Comparative Genomic Analysis of Gene Variations of Two Chinese Yersinia pestis Isolates from Vaccine Strain EV76

Objective To investigate genomic variations of two Chinese Yersinia pestis isolates that were isolated from different plague foci obtained from vaccine strain EV76 from the Yunnan province of China.Methods A microarray containing 12 000 probes covering the entire genome of seven Yersinia pestis and two Yersinia pseudotuberculosis strains,was used.PCR assays were performed to confirm microarray results.Results The gene variations detected included the absence of five genes related to the synthesis of betaine in both EV76 and another sequenced attenuated strain,KIM D27.Several genes related to phage-related membrane proteins were found to be absent in the Antiqua biovar Yunnan strain,485,which was isolated from a rodent plague foci.Conclusion These findings provide initial insight into the distinct strains isolated from natural foci,within their genomic context,including Yunnan Y.pestis strains.This information will be used therefore to establish subsequent comparisons of these sequences with published complete genomes of other strains.     

云南省墨江县鼠疫菌某些生物学特性的研究

目的：探明云南省墨江县鼠疫菌的生物学特性。方法：应用琼脂糖凝胶电泳、毒力决定子检查及生化试验方法，检查了１９９６年３月分离自墨江县鼠疫菌的质粒ＤＮＡ、毒力决定子和生化特性。结果：该县鼠疫菌可观测到分子量为４、６、４５和６５Ｍｄａｌ四种质粒，部分菌株缺失４５Ｍｄａｌ质粒。具有四种质粒的菌株都能表达Ｆｒａ、Ｖｗａ、Ｐｓｔ和Ｃｏｇ，但缺失４５Ｍｄａｌ质粒者为Ｖｗａ。菌株具有滇闽居民区生态型特征，未发现该县菌株生态型与质粒种类相关。结论：该县存在家鼠鼠疫疫源地，流行的主要因素为疫源地的复燃     

青海高原喜马拉雅旱獭血清中特异性鼠疫噬菌体抗体的检测

目的 利用微量法间接检测青海高原喜马拉雅旱獭血清中特异性鼠疫噬菌体抗体,为后续噬菌体和哺乳动物免疫学之间的相互作用、噬菌体治疗、噬菌体与生态学研究提供理论依据。方法 以青藏高原鼠疫疫源地分离的3株野生型鼠疫噬菌体和实验室诊断用鼠疫噬菌体为抗原,利用微量板法和双层琼脂平板法定性检测青海高原同德县、贵南县、共和县、兴海县、天峻县5个疫源县采集于2020年、2021年7—9月份喜马拉雅旱獭血清中的特异性鼠疫噬菌体免疫抗体。结果 4株鼠疫噬菌体分别与847份喜马拉雅旱獭血清进行中和试验,通过点滴法均未检测到与鼠疫噬菌体抗原反应的特异性噬菌体免疫抗体。结论 青海高原喜马拉雅旱獭血清中未发现特异性鼠疫噬菌体抗体,这与2020—2021年青海省天峻县、同德县、共和县、兴海县、贵南县5个鼠疫疫源县采样地点的鼠疫流行病学显示为静息期无鼠疫病原体存在的流行特点一致,即无鼠疫病原体的存在,间接说明这些鼠疫疫源地鼠疫噬菌体不存在或者比较微弱的存在,故检测不到特异性鼠疫噬菌体免疫抗体。可能反映了宿主动物与鼠疫噬菌体自然接触频率少,抗噬菌体抗体可能与鼠疫感染的形式和疾病的强度有关。     

青海省格尔木市鼠疫耶尔森菌生化特征及基因分型研究

目的 了解青海省格尔木市鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）的生化特征,进行规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）基因分型和差异区段（DFR）研究,为青海省格尔木市鼠疫菌鉴定溯源、鼠疫科学防控提供理论依据。方法 选取1967年以来青海省格尔木市境内从人尸、宿主动物及媒介昆虫体内分离出28株鼠疫菌,通过糖醇酵解实验,研究其生化特征。采用十二烷基磺酸钠裂解和苯酚-氯仿法提取鼠疫菌DNA。分别对CRISPR的YPa、YPb和 YPc 3个位点进行PCR扩增并测序,然后将所测得CRISPR序列与文献最新报道的CRISPR Dictionary和NCBI数据库检索比对,以鉴定CRISPR spacer阵列。最后根据CRISPR spacer阵列的多态性对青海省格尔木市鼠疫菌进行基因分型。采用23对DFR（DFR01-DFR23）分型引物和质粒验证引物（PMT1）对试验菌株DNA进行分型验证。结果 鼠疫菌糖醇类酵解表型特征研究结果显示,28株鼠疫菌对甘油、阿胶糖、麦芽糖的酵解均为阳性,对鼠李糖、蜜二糖、脱氮的酵解均为阴性。CRISPR分型发现10种spacer,包括YPa 5种、YPb 4种、YPc 1种,a105和b51是新发现spacer。28株鼠疫菌归类为8个基因型,分为5个CRISPR类群：Cb4、Cb4'、Ca7、Ca7'和Ca35'。DFR分型可分为4个基因组型,分别为32型、5型、8型和49型。该地区主要基因组型为32型和5型。结论 青海省格尔木市鼠疫菌均为青藏高原型,当地鼠疫菌基因型较少,遗传较为稳定,具有明显的地区分布特征。同一地区不同菌株基因型有差异,存在鼠疫菌菌株微进化。     

云南省鼠疫静息期家鼠鼠疫疫源地犬中致病耶尔森菌调查

目的 对云南省家鼠鼠疫疫源地鼠疫指示动物-犬中致病性耶尔森菌分布情况调查分析,以探求鼠疫菌微生态状况,为研究鼠疫的流行与静息提供更多线索。方法 2016年7月—2017年8月采用多重分层抽样法在云南省抽取不同时间进入流行静息期、不一样流行强度和不同地理位置的家鼠鼠疫疫源县共10个（历史疫区、近史流行区、复燃疫区、现疫区）作为调查点,采集犬肛门拭子置于改良PBS中,经4 ℃冷增菌15 d后,吸取混匀的培养液1 mL 提取DNA,采用PCR方法检测foxA、inv及caf1基因,并对基因阳性材料采用耶尔森选择培养基分离菌株,提取菌株的DNA并检测其ail毒力基因。结果 云南省10个疫源县共采集犬肛门拭子标本915份,foxA 基因检测阳性率为1.64%（15/915）,未检出inv基因与caf1基因阳性。小肠结肠炎耶尔森菌分离阳性率为1.3%（12/915）,其中2株具有ail 毒力基因;未分离到鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌。结论 云南省家鼠鼠疫疫源地犬中存在小肠结肠炎耶尔森菌的分布;未发现鼠疫菌线索,其原因值得进一步探讨。     

胶体金免疫层析法在鼠疫监测应用

目的了解胶体金免疫层析法（GICA）快速诊断鼠疫试剂的应用效果。方法在鼠疫监测中用间接血凝（IHA）微量法和胶体金免疫层析法检测鼠型动物血清中鼠疫F1抗体;选IHA微量法初筛时发生凝集的鼠型动物血清,用GICA检测鼠疫F1抗体,设立IHA微量法抑制试验对照;在溶血血清中加入鼠疫阳性参考血清,用GICA检测鼠疫F1抗体,设立IHA对照;用鼠疫菌EV76株免疫鼠类建立动物模型,用GICA检测鼠疫F1抗体和F1抗原,分别设立IHA和反向间接血凝（RIHA）对照。结果 IHA微量法和GICA检测鼠型动物血清237份,两种方法检测结果一致,全部阴性;GICA及IHA微量法抑制试验检测IHA微量法初筛时发生凝集的鼠型动物血清57份,两种方法结果一致,均为阴性,证实初筛结果为非特异性凝聚;GICA检测含鼠疫鼠疫阳性参考血清的鼠型动物溶血血清45份,结果全部阳性,而IHA对照结果无法判断;用GICA检测动物模型中鼠类血清25份和鼠类脏器18份,结果分别与IHA和RIHA对照一致。结论鼠疫胶体金试剂使用简便、快速、特异、敏感、便于鼠疫监测现场和鼠疫应急应用。     

云南省鼠疫菌株脉冲场电泳分析

目的:对云南不同片区及不同类型的鼠疫菌株进行基因分型。方法:采用脉冲场电泳(PFGE)对菌株进行分析。结果:1.云南省鼠疫菌株被分为5个型,所有鼠疫菌株在680kb和330kb有两条共同的带;2.大部分家鼠鼠疫具有一致图谱;3.云南家、野两型鼠疫菌的脉冲场电泳图谱存在差异。结论:脉冲场电泳分析可用于云南鼠疫分子流行病学研究。