缺血缺氧对星形胶质细胞合成和分泌BDNF的影响

目的:观察缺血缺氧对星形胶质细胞合成和分泌脑源性神经营养因子(BDNF)的影响.方法:培养的星形胶质细胞分别在低氧去血清中培养1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、3 d,采用逆转录PCR检测星形胶质细胞BDNF mRNA的表达,ELISA检测培养上清液中BDNF的浓度.结果:低氧去血清培养1 h时星形胶质细胞BDNF mRNA表达达峰值,之后逐渐降低,培养12 h后BDNF mRNA持续低于正常培养水平.在低氧去血清刺激下培养上清液中BDNF的浓度迅速增加,培养12 h时达峰值,之后逐渐降低,保持低水平.结论:缺血缺氧促进星形胶质细胞活化,反应性增加BDNF的合成和分泌,这种变化与缺血后神经营养补给有关.     

银杏内酯B对局灶性脑缺血时星形胶质细胞GFAP表达的影响

目的 观察血小板活化因子(PAF)受体拮抗剂银杏内酯B(GB)对局灶性脑缺血时星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响,并探讨其作用机制.方法 建立光化学诱导树局灶性脑缺血模型,用HE染色和电镜技术观察缺血后不同时间脑组织星形胶质细胞的形态学改变;用免疫组织化学法观察脑缺血后4 h、24 h、72 h及给予GB后24 h半暗区及对侧皮层星形胶质细胞GFAP的表达,并测定其平均灰度值.结果 光镜下可见,HE染色显示树局灶性脑缺血后,随缺血时间延长,星形胶质细胞形态有不同程度改变;电镜观察显示缺血24 h时星形胶质细胞明显肿胀.免疫组织化学染色可见,半暗区星形胶质细胞GFAP表达在4 h时没有明显改变, 24 h时增加 (P＜0.01),72 h时仍维持在较高水平(P＜0.01);对侧皮层星形胶质细胞GFAP表达于72 h时开始增加(P＜0.05).缺血后6 h舌下静脉注射GB至缺血24 h时,星形胶质细胞GFAP表达少于缺血组(P＜0.05),但仍较假手术组高.结论 脑缺血后星形胶质细胞GFAP表达增强,GB可通过减少星形胶质细胞GFAP的表达而起脑保护作用.     

瘦素对缺血缺氧损伤脑星形胶质细胞凋亡的影响

目的 研究瘦素对缺血缺氧/复氧损伤星形胶质细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 制作缺血缺氧大鼠脑皮质星形胶质细胞损伤模型,MTT法检测星形胶质细胞活力;采用Annexin V-FITC试剂盒检测星形胶质细胞凋亡;RT-PCR和Western blot方法检测凋亡相关基因bcl-2、bax、caspase-3的表达.结果 与缺血缺氧损伤组比较,瘦素干预组星形胶质细胞存活率升高(P<0.01)、凋亡率下降(P<0.01);抑凋亡基因bcl-2 mRNA和蛋白表达水平上调(P<0.01),促凋亡基因bax、caspase-3 mRNA和蛋白表达水平下调(P<0.01),呈剂量依赖性.结论 瘦素能够使凋亡相关基因bcl-2表达上调、bax和caspase-3表达下调,从而抑制缺血缺氧损伤星形胶质细胞发生凋亡.     

载脂蛋白E对星形胶质细胞缺氧性损伤的保护作用

目的探讨载脂蛋白E(apolipoprotein E,APOE)在星形胶质细胞缺氧性损伤中的作用及相关机制。方法①原代培养APOE基因敲除鼠、APOE基因野生鼠的星形胶质细胞,并分别予以缺氧6 h,流式细胞仪分别检测两组细胞早期凋亡率情况;②将培养成熟的APOE基因野生鼠的星形胶质细胞分为常氧组、缺氧组和干预组(缺氧+ERK抑制剂),分别予以缺氧组和干预组缺氧6 h,干预组在缺氧之前向培养基中加入ERK信号通路抑制剂U0126,Western blot法分别检测检测3组细胞APOE蛋白表达变化情况。结果①缺氧6 h后,APOE基因敲除鼠组星形胶质细胞早期凋亡率[(5.67±0.35)%]明显高于APOE基因野生鼠组[(2.77±0.24)%](P<0.05);②与常氧组、干预组相比较,缺氧组星形胶质细胞表达的APOE蛋白明显增加(P<0.05)。结论 APOE对星形胶质细胞缺氧性损伤具有保护作用,缺氧后星形胶质细胞APOE蛋白水平上调与ERK信号通路有关。     

钾通道在新生大鼠星形胶质细胞缺氧缺血性水肿中的作用机制

目的 探讨钾通道在体外培养的新生大鼠星形胶质细胞缺氧缺血性水肿中的作用机制.方法 体外培养出生3 d新生大鼠的星形胶质细胞;采用RNA干扰技术制作水通道蛋白4(AQP4)敲低型(AQP4-/-)细胞模型;用放射性[3H]标记的甲基D-葡萄糖摄取,测定缺氧缺血性AQP4-/-和野生型(AQP4+/+)星形胶质细胞体积;利用全细胞膜片钳技术记录培养的星形胶质细胞电压依赖性钾通道(Kv)的电流特性,并记录缺氧缺血性星形胶质细胞Kv通道的电流变化.结果 AQP4+/+和AQP4-/-星形胶质细胞在缺氧缺血时均较其对照组细胞体积明显增加(AQP4+/+和AQP4+/+组细胞在缺氧缺血0.5、1、2、4 h组占所对应的对照组D-葡萄糖摄取值的百分数分别为104±7、109±6、126±12、152±9和97±7、105±9、109±7、132±6,均P<0.05),但相同缺氧缺血时间点AQP4-/-介导细胞水肿程度明显减轻(均P<0.05),而且细胞电流密度随着缺氧缺血时间延长,进行性下降(对照组和缺氧缺血0.5、1、2、4 h组细胞电流密度值分别为116±8,107±9,91±10,76±6,37±11,均P<0.05).结论 在细胞缺氧缺血时,细胞外向性钾通道下调,可能阻止细胞内堆积的钾离子流出细胞外,引起渗透性改变而导致水通过AQP4流入细胞内,从而出现细胞水肿.     

脑组织TNFα过度表达对神经胶质细胞及脑缺血梗死灶体积的影响

目的：探讨脑组织肿瘤坏死因子α(TNFα)过度表达对小胶质细胞、星形胶质细胞激活及脑缺血梗死灶体积的影响。方法：用TNFα、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、髓磷脂、整合素αM(OX42)免疫组化染色观察SD大鼠与转小鼠TNFα基因大鼠未缺血脑组织的TNFα表达及3种神经胶质细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞与少突神经胶质细胞)的激活状态。采用线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞模型，SD大鼠与转小鼠TNFα基因大鼠缺血1h再灌注72h后，先行神经功能缺损程度评分，再断头取脑四氯氮唑(TIC)染色计算脑梗死体积。结果：转小鼠TNFα基因大鼠与SD大鼠相比，未缺血脑组织见TNFα表达，且星形胶质细胞、小胶质细胞与少突神经胶质细胞呈肥大和增生性变化；缺血1h再灌注72h后神经功能缺损程度评分显著增高，脑梗死灶体积显著增大。结论：未缺血时脑组织TNFα的表达可明显激活3种神经胶质细胞，TNFα的过度表达可使脑缺血时神经功能明显恶化及脑梗死体积明显增加，提示TNFα的过度表达可明显加剧缺血性脑损伤。     

缺氧条件下谷氨酸对鼠脑星形胶质细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的观察谷氨酸在缺氧条件下对星形胶质细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法原代培养SD大鼠星形胶质细胞,传代后分为4组:①对照组;②谷氨酸组(1μmol/L);③缺氧组;④缺氧+谷氨酸组。缺氧条件为:(94%N2,5%CO2和1%O2),每组包括6个时相点:0、2、4、6、8、12h(以缺氧后开始计时),②和④组加入1μmol/L的谷氨酸。在不同时间点提取细胞总RNA,用Real time FQ-PCR法检测VEGF mRNA表达变化;ELISA法检测培养上清液VEGF蛋白表达变化。结果对照组和谷氨酸组(1μmol/L)各实验时相点星形胶质细胞VEGF mRNA和蛋白表达无明显变化。而缺氧组和缺氧+谷氨酸组VEGF mRNA和蛋白表达却随实验时相逐步增高,分别在6和8h达最高,之后渐下降。缺氧+谷氨酸组VEGF mRNA和蛋白表达上调较单纯缺氧组更为显著。结论谷氨酸(1μmol/L)可在缺氧条件下增强星形胶质细胞VEGF mRNA和蛋白表达上调,这可能与缺氧状态下星形胶质细胞表面谷氨酸受体的表达变化有关。     

水通道蛋白4在缺氧缺糖后水肿星形胶质细胞中的作用

目的 探讨水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)在缺氧缺糖培养后水肿星形胶质细胞中的表达变化与作用.方法 星形胶质细胞分为正常组和缺氧缺糖组,缺氧缺糖组细胞经过5 h缺氧缺糖后恢复正常条件培养至0.5、2、8、24 h和48 h 5个时间点时,用光镜观察细胞形态变化,RT-PCR及免疫荧光法测定AQP4的mRNA及蛋白的表达变化.结果 ①在缺氧缺糖后0.5 h,细胞肿胀逐渐形成并继续加重,2 h肿胀达到高峰,至8 h和24 h时肿胀逐渐消退,48 h细胞基本恢复正常形态.②RT-PCR和免疫荧光检测:在缺氧缺糖后0.5 h,AQP4 mRNA和蛋白的表达均较正常组明显下降(P<0.05),2 h回升,8 h明显超过正常水平,达最高值(P<0.05),24 h有所下降,但仍明显高于正常水平(P<0.05),至48 h时mRNA和蛋白的表达均基本恢复正常水平.结论 缺氧缺糖后星形胶质细胞水肿形成及消退期AQP4的不同表达变化可能都是细胞的一种自身保护机制,从而尽量维持细胞的正常形态和功能.     

病变侧亚低温对局灶脑缺血再灌注后胶质纤维酸性蛋白表达的影响

目的 观察病变侧亚低温(32—33℃)对局灶脑缺血再灌注后星形胶质细胞活性和组织病理变化的影响。方法 采用改良线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，将雄性Wisutr大鼠随机分为缺血常温组、亚低温组和假手术组。根据缺血时间不同，每组又分为缺血3h和12h。缺血30min后应用反馈控温半导体制冷块对大鼠病变侧给予亚低温治疗，并持续至再灌期。采用免疫组织化学方法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达及HE染色观察组织病理变化。结果 缺血常温组GFAP阳性细胞数量增多，突体粗大，胞体肿胀；亚低温组GFAP表达数量明显减少。结论 病变侧亚低温能明显抑制脑缺血后星形胶质细胞反应性增生和肥大，并能减轻组织损伤程度。     

脑组织TNFɑ过度表达对神经胶质细胞及脑缺血梗死灶体积的影响

目的:探讨脑组织肿瘤坏死因子ɑ(TNFɑ)过度表达对小胶质细胞、星形胶质细胞激活及脑缺血梗死灶体积的影响。方法:用TNFɑ、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、髓磷脂、整合素ɑM(OX42)免疫组化染色观察SD大鼠与转小鼠TNFɑ基因大鼠未缺血脑组织的TNFɑ表达及3种神经胶质细胞穴星形胶质细胞、小胶质细胞与少突神经胶质细胞雪的激活状态。采用线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞模型,SD大鼠与转小鼠TNFɑ基因大鼠缺血1h再灌注72h后,先行神经功能缺损程度评分,再断头取脑四氯氮唑(TTC)染色计算脑梗死体积。结果:转小鼠TNFɑ基因大鼠与SD大鼠相比,未缺血脑组织见TNFɑ表达,且星形胶质细胞、小胶质细胞与少突神经胶质细胞呈肥大和增生性变化;缺血1h再灌注72h后神经功能缺损程度评分显著增高,脑梗死灶体积显著增大。结论:未缺血时脑组织TNFɑ的表达可明显激活3种神经胶质细胞,TNFɑ的过度表达可使脑缺血时神经功能明显恶化及脑梗死体积明显增加,提示TNFɑ的过度表达可明显加剧缺血性脑损伤。     

新生大鼠缺氧／缺血性脑损伤时皮层神经元HIF-1仪的表达与凋亡相关基因P53、Bcl-2的关系

目的：探讨新生大鼠缺氧／缺血性脑损伤时皮层神经元缺氧诱导因子-lot（HIF-1d）的表达及其与凋亡相关基因P53、Bcl-2的关系。方法：新生7日龄SD大鼠随机分为假手术组、单纯缺氧组和缺氧／缺血组,在缺氧或缺氧／缺血后3、6、12、24、72h断头取脑,HE染色观察脑组织病理学改变,免疫组织化学方法检测皮层神经元HIF-10t、P53及Bcl-2表达情况。结果：单纯缺氧组和缺氧／缺血组大鼠脑组织HE染色显示：脑皮层神经元均有不同程度的损伤,于24h时损伤最重,细胞溶解缺失明显;皮层HIF-lot于缺氧／缺血后3h表达升高,12h达高峰,之后呈下降趋势;皮层P53表达高峰较HIF-lot推后,24h达高峰,之后呈下降趋势;Bcl-2表达规律与HIF-la一致。假手术组P53／Bcl-2值约等于1;单纯缺氧组和缺氧／缺血组3、6、12h3个时间点上P53／Bcl-2值小于1,24、72h2个时间点上P53／Bcl-2值大于1。结论：在新生大鼠缺氧／缺血性脑损伤时,HIF-lOL参与了对P53及Bcl-2的调控,在缺氧损伤早期可能具有抗凋亡作用。     

P2X_7受体在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后表达下调

目的 了解P2X_7受体在新生大鼠缺氧缺血型脑损伤后的表达变化.方法 选择出生7 d的SD大鼠建立新生鼠缺氧缺血性脑损伤模型,通过Western blot和免疫组化检测缺氧缺血前后脑皮层、白质、海马P2X_7受体表达.结果 缺氧缺血后2 h,患侧皮层、白质和海马P2X_7受体蛋白较假手术对照组明显下调(P<0.05,P<0.01);免疫组化也显示患侧皮层、白质和海马P2X_7,受体表达下降.结论 P2X_7受体可能参与了新生鼠缺氧缺血性脑损伤过程.     

AQP4在新生大鼠实验性星形胶质细胞缺氧损伤模型中的表达变化及意义

目的 探讨水通道蛋白4（AQP4）在原代培养新生大鼠星形胶质细胞（AC）缺氧和缺氧后再复氧损伤模型中的表达改变及其意义。方法 原代培养成熟的AC随机分成常氧培养组（对照组）、缺氧组和复氧组。缺氧组AC在缺氧条件下分别培养3h、6h、12h和24h,复氧组AC缺氧培养12h后更换为常氧培养,分别培养3h、6h、12h和24h。各组样品采用Real Time PCR和免疫荧光染色分别测定AQP4 mRNA和蛋白表达水平。结果 随着缺氧时间延长,AQP4 mRNA和蛋白表达水平进行性降低,复氧时则先降低,后回升。结论 AQP4表达下降可能与脑水肿的发生有关,AQP4可能对脑内渗透平衡重建起重要作用。     

CO2气腹对缺氧缺血性脑损伤大鼠脑组织S-100、NSE蛋白水平的影响

目的研究在不同CO2气腹压及不同时段下缺氧缺血性脑损伤大鼠血和脑脊液S-100蛋白（S-100）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）水平的变化对中枢神经系统的影响．方法Wistar大鼠建立缺氧缺血性脑损伤模型和气腹模型，光镜和电镜观察大鼠脑组织胶质细胞和神经元细胞组织学变化；抗体夹心法检测血液和脑脊液中S-100、NSE水平变化，免疫组织化学的方法观察脑组织中S-100、NSE表达的变化．结果（1）CO2气腹后，B与对照组比较，海马区胶质细胞和神经元细胞均呈水样变，无核坏死，电镜下线粒体、内质网中度水肿；B10-2组胶质细胞和神经元细胞在光镜下呈弥漫性水样变，部分胶质细胞核浓缩和细胞皱缩。神经元细胞胞浆酸性细胞增多，电镜下胶质细胞水样变，线粒体肿胀、脊断裂，胶质细胞内髓鞘样结构形成，神经元细胞线粒体、内质网肿胀变性，核膜破裂；（2）B与对照组比较，血液和脑脊液中S-100、NSE水平均明显增高，差异有显著性（P〈0．05）；B5-1组与B组比较水平均有增加，差异无显著性，在B10-2组差异有显著性意义（P〈0．05）；（3）CO2气腹后脑组织S-100、NSE表达阳性面积随时间及压力增加而逐渐增加，B组与对照组或B10-2组与B组比较均有显著性差异（P〈0．05）．结论在10mmHg、2h范围，CO2气腹对缺氧缺血性脑损伤大鼠中枢神经系统有损害，应尽可能缩短气腹时间及采取相府的调粹措施．     

HIBD新生大鼠微管相关蛋白Tau表达变化的研究

目的:本研究采用经典的新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemicbraindamage,HIBD)动物模型,观察HIBD前后脑室周围白质Tau蛋白水平的改变,探讨新生大鼠HIBD早期Tau蛋白表达变化与脑损伤的关系。方法:清洁级7日龄Wistar大鼠82只,随机分成假手术组(对照组,n=40)和缺氧缺血性脑损伤模型组(HIBD组,n=42)。参照Rice法单侧结扎新生大鼠左颈总动脉复制HIBD动物模型;假手术组(对照组)只切开颈部正中皮肤,分离但不结扎左侧颈总动脉;HIBD～大鼠置入低氧环境缺氧2小时,而后按时间随机分为3小时、6小时、12小时、24小时、48小时组(n=8)。HE及嗜银染色后,光镜下观察HIBD前后及不同时间组新生大鼠脑神经细胞的病理变化;免疫组织化学法测各组大鼠脑室周围白质与皮层微管相关蛋白Tau水平的动态变化情况,400倍视野下利用计算机图象分析系统进行Tau蛋白平均光密度值(aver-age opticaldens卸,OD)测定,并统计学分析。结果:HIBD新生大鼠嗜银染色示脑室周围白质神经细胞中存在神经原纤维的增粗、缠绕。各实验组Tau蛋白随着缺氧缺血时间的延长参疫反应牲增强,其中H工后3小时与对照组比较差异无显著性,HIBD后6小时组、12小时组、24小时组以及48小时组的0D值较对照组明显增加(p<0.05),差异有显著性。结论:HIBD可造成新生鼠脑脑室周围白质中神经纤维变性,总Tau蛋白表达增加。     

大鼠脑出血后MMP-2和MMP-9的动态表达及七叶皂苷钠对其表达的影响

目的观察大鼠脑出血（ICH）后基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9蛋白动态表达及其与血肿周围脑组织含水量的关系,以及观察七叶皂苷钠对MMP-2、MMP-9表达的影响。方法Wistar大鼠250只随机分为4组：正常对照组10只、假手术组80只、ICH组80只和七叶皂苷钠治疗组80只,于制模后6、12、24、48、72、120h、7d和15d 8个时间点,测定各组血肿周围脑组织含水量、MMP-2和MMP-9的蛋白表达。结果治疗组神经功能缺失较ICH组明显改善（P〈0.05）;6-120h治疗组血肿周围脑组织含水量较ICH组明显减少（P〈0.05）;ICH后MMP-2蛋白表达在6h达到高峰,12h时下降,与正常对照组相比,MMP-2蛋白表达具有统计学意义（P〈0.01）;治疗组MMP-2蛋白表达在各时间点较ICH组明显减少（P〈0.01）;ICH后MMP-9蛋白表达在6h开始上升,24-48达高峰,72h时下降,与正常对照相比,具有统计学意义（P〈0.01）,其表达水平与血肿周围脑组织含水量呈正相关（r=0.949,P〈0.05）;治疗组MMP-9蛋白表达在各时间点ICH组明显减少（P〈0.01）。结论大鼠ICH后MMP-2、MMP-9蛋白的表达是ICH后早、中期脑水肿形成主要因素,七叶皂苷钠能降低MMP-2、MMP-9蛋白表达和脑组织含水量,对ICH具有保护作用。     

低渗液对星形胶质细胞水通道蛋白-4表达的影响

目的　探讨体外培养星形胶质细胞在低渗状态下水通道蛋白 4 (AQP4 )表达的变化特点及其所起的作用。方法　取生后 2d的Wistar大鼠大脑皮质进行星形胶质细胞纯培养 ,随机分为对照组和低渗组 ,每组分为 3、6、12、2 4h共 4个时间点 ,每个时间点细胞孔数为 6。对照组予以正常培养液常规培养 ,低渗组分别予以不同程度的低渗液作用于细胞 ,以建立星形胶质细胞对低渗液反应的实验模型。利用倒置显微镜和透射电镜观察低渗液对星形胶质细胞的形态学影响 ,并通过免疫细胞化学、逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、乳酸脱氢酶活性的测定及图像分析等方法研究星形胶质细胞对低渗液的反应及AQP4的表达变化。结果　对照组在正常渗透压培养液培养 3、6、12、2 4h后 ,AQP4表达无明显差异 (均P >0 .0 5 )。在相同的作用时间条件下 ,各低渗组AQP4mRNA和蛋白表达水平均明显高于对照组 (均P <0 .0 5 )。而在同一低渗状态下的不同培养时间点和不同低渗状态下的同一培养时间点 ,AQP4表达随作用时间的延长和低渗程度的增加而增强 ,AQP4mRNA和蛋白的表达呈明显正相关 (r >0 .836 9,P <0 .0 5 ) ;同时星形胶质细胞表现出特征性的细胞水肿形态学变化 ,细胞存活能力明显下降 ,其严重程度与低渗液的作用时间和渗透压有关。结论　低渗液     

氧糖剥夺对体外培养大鼠星形胶质细胞内Cdh1蛋白表达的影响及机制

目的探讨氧糖剥夺对星形胶质细胞内Cdh1蛋白表达的影响及其机制。方法①体外纯化培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞,随机分为对照组、氧糖剥夺1h复氧组、氧糖剥夺6h复氧组,Western blot检测Cdh1及Skp2蛋白的表达变化;②将体外纯化培养的星形胶质细胞随机分为对照组、氧糖剥夺6h组、单纯缺氧6h组,Western blot检测Cdh1蛋白的表达变化,血糖仪检测培养液中葡萄糖含量的变化。结果①与对照组相比,氧糖剥夺1h复氧组、氧糖剥夺6h复氧组Cdh1蛋白表达均下降,Skp2蛋白表达均增加(P<0.05),氧糖剥夺1h复氧组与氧糖剥夺6h复氧组组间Cdh1、Skp2蛋白表达差异无统计学意义;②与对照组相比,氧糖剥夺6h组Cdh1蛋白表达明显下降,单纯缺氧6h组没有明显变化,氧糖剥夺6h组与单纯缺氧6h组组间差异有统计学意义(P<0.05);③单纯缺氧6h组细胞外液葡萄糖摄取率低于对照组(即常氧组)[(21.43±6.74)%vs.(26.98±9.21)%,P<0.05]。结论氧糖剥夺后星形胶质细胞内Cdh1蛋白表达减少,其变化与细胞外液中缺少葡萄糖有关。     

Effects of Graded Hypothermia on Hypoxic-ischemic Brain Damage in the Neonatal Rat

Objective To investigate the effect of graded hypothermia on neuropathologic alterations of neonatal rat brain after exposed to hypoxic-ischemic insult at 37°C,33°C,31°C,and 28°C,respectively,and to observe the effect of hypothermia on 72-kDa heat shock protein (HSP72) expression after hypoxic-ischemic insult.Methods Seven days old Wistar rats were subjected to unilateral common carotid artery ligation followed by exposure to hypoxia in 8% oxygen for 2 hours at 37°C,33°C,31°C,and 28°C,respectively.The brain...