补阳还五汤含药血清对星形胶质细胞谷氨酸转运体1和谷氨酰胺合成酶的影响

【目的】观察补阳还五汤含药血清对体外缺氧缺糖后星形胶质细胞谷氨酸转运体1(GLT-1)及谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白表达的影响。【方法】体外培养新生SD乳鼠大脑星形胶质细胞,采用抗神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单克隆抗体确认星形胶质细胞。缺氧缺糖2 h后,应用Western blot法检测各组星形胶质细胞复氧复糖后各个时间点(12、24、48 h)GLT-1、GS蛋白表达的变化情况,采用谷氨酸试剂盒测定细胞外液谷氨酸浓度。【结果】与正常组比较,缺氧缺糖对照组各时间点星形胶质细胞GLT-1、GS蛋白表达均显著下降(P<0.05);补阳还五汤含药血清组于复氧复糖24 h后GLT-1、GS蛋白表达均显著上调达到最高水平,与缺氧缺糖对照血清组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);与此一致的是补阳还五汤含药血清组显著降低了24 h后细胞培养液中谷氨酸的浓度(P<0.05)。【结论】补阳还五汤可通过上调星形胶质细胞GLT-1、GS表达促进缺氧缺糖后谷氨酸的转运,进而降低谷氨酸的毒性作用。     

高迁移率族蛋白B1通过调节Bcl-2和Bax蛋白表达促进氧糖剥夺/复氧星形胶质细胞的凋亡

目的：研究高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1,HMGB1）在氧糖剥夺/复氧后对星形胶质细胞凋亡的影响,同时通过检测凋亡相关蛋白Bcl 2和Bax表达变化探讨其可能的作用机制。方法：将体外培养新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞分为正常组、模型组、干扰组、对照组,用携带大鼠HMGB1的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）慢病毒载体干扰星形胶质细胞抑制HMGB1表达后进行氧糖剥夺/复氧处理,氧糖剥夺6 h、复氧24 h后检测。通过Western blotting法检测RNA干扰效果,通过MTT细胞存活实验检测细胞损伤,通过TUNEL法检测细胞凋亡,最后通过Western blotting法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达。结果：与正常组比较,模型组经过氧糖剥夺/复氧处理后星形胶质细胞内HMGB1表达明显升高（P<0.001）, MTT实验检测细胞存活率下降（P<0.001）,TUNEL法检测凋亡细胞数增多（P<0.001）, 凋亡相关蛋白Bcl 2/Bax蛋白比值下降（P<0.001）;与模型组比较,RNA干扰有效抑制HMGB1蛋白表达（P<0.001）, MTT实验检测细胞存活率升高（P<0.001）,TUNEL法标记凋亡细胞数减少（P<0.001）, 凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax蛋白比值升高（P<0.001）。结论：氧糖剥夺/复氧后HMGB1的释放可以导致星形胶质细胞损伤及细胞凋亡,其作用机制可能与调控凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax表达有关。     

丁基苯酞对氧糖剥夺/复氧糖诱导的星形胶质细胞中caspase-3表达的影响

目的探讨丁基苯酞对氧糖剥夺/复氧糖诱导的星形胶质细胞中caspase-3表达的影响。方法将原代培养、鉴定的Sprague-Dawley大鼠星形胶质细胞随机分为对照组、模型组和实验组,各组细胞经高糖达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)培养48 h,细胞贴壁并伸出突触后实验组及模型组更换DMEM无糖培养基进行氧糖剥夺,对照组仍使用DMEM高糖培养基培养,3组细胞放入培养箱中孵育6 h后,实验组更换为含100μmol·L~(-1)丁基苯酞的DMEM高糖培养基,模型组更换为DMEM高糖培养基进行氧糖剥夺/复氧糖,对照组更换新的DMEM高糖培养基,继续培养24 h。四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞活力,免疫荧光及免疫印迹法检测星形胶质细胞中caspase-3表达,酶联免疫吸附试验检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)表达。结果 MTT法结果显示,对照组星形胶质细胞活力高于实验组和模型组(P<0.05),实验组星形胶质细胞活力显著高于模型组(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示,对照组星形胶质细胞内荧光信号最弱;模型组星形胶质细胞内荧光信号最强;实验组星形胶质细胞内荧光信号强度较模型组降低,但高于对照组(P<0.05)。免疫印迹检测结果显示,模型组星形胶质细胞在氧糖剥夺/复氧糖后caspase-3表达相对最高,实验组次之,对照组最低,各组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。氧糖剥夺/复氧糖24 h后,实验组细胞培养液中LDH水平高于对照组(P<0.05),模型组细胞培养液中LDH水平显著高于实验组(P<0.05)。结论丁基苯酞可以改善氧糖剥夺/复氧糖引起的星形胶质细胞损伤。     

腺苷预处理对氧糖剥夺星形胶质细胞的胶质源性神经营养因子的影响

目的探讨腺苷预处理对氧糖剥夺星形胶质细胞的胶质源性神经营养因子(GDNF)的影响。方法体外培养SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞,将培养至第3代或第4代的星形胶质细胞传代至96孔板内,细胞贴壁并长出突起后,随机分为正常对照组、氧糖剥夺组和腺苷预处理组。观察氧糖剥夺8 h复氧糖24 h后星形胶质细胞形态,检测细胞培养液中GDNF水平。结果氧糖剥夺组GDNF水平显著高于对照组(P<0.05);腺苷预处理组GDNF水平显著高于氧糖剥夺组(P<0.05)。结论腺苷预处理能进一步增强缺氧缺糖后GDNF的表达,GDNF的表达上调可能是腺苷预处理诱导缺血耐受,产生神经保护作用的分子机制之一。     

P38信号通路在星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧后水通道蛋白4表达及细胞水肿形成中的作用

目的探讨P38信号通路在星形胶质细胞氧糖剥夺,复氧后水通道蛋白4表达及细胞水肿形成中发挥的作用。方法原代培养的星形胶质细胞分为正常组,模型组和P38抑制剂组。模型组:细胞接受5 h氧糖剥夺/复氧处理;P38抑制剂组:细胞在5 h氧糖剥夺后的复氧过程中加入P38抑制剂(SB203580,10μmol/L)处理。在5 h氧糖剥夺/复氧后的不同时间点,用RT-PCR及Westem blotting法测定P38、磷酸化P38及水通道蛋白4(AQP4)的表达变化,光镜观察细胞形态变化,乳酸脱氢酶测定反应细胞损伤程度。结果与正常组相比,星形胶质细胞在5 h氧糖剥夺/复氧后,其磷酸化P38的水平明显上升,并在复氧lh时达到峰值(P<0.01),AQP4 mRNA和蛋白的表达也明显升高(P<0.01),同时细胞水肿在氧糖剥夺/复氧后2 h时达到高峰,LDH漏出率也明显升高(P<0.01)。与模型组相比,加入P38抑制剂可明显降低5 h氧糖剥夺/复氧后P38磷酸化的水平(P<0.01),以及复氧后各时间点AQP4增高的水平(P<0.01),并可明显缓解氧糖剥夺/复氧后细胞水肿及LDH上升的程度(P<0.01)。结论 P38信号通路的激活参与了星形胶质细胞5 h氧糖剥夺/复氧后AQP4上调及细胞水肿形成,抑制p38的激活可降低AQP4表达的上调,减轻细胞水肿。     

腺苷预处理对氧糖剥夺复氧糖后星形胶质细胞中血管内皮生长因子和血管生成素-1水平的影响

目的探讨腺苷预处理对氧糖剥夺复氧糖后星形胶质细胞中血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素-1(Ang-1)水平的影响。方法体外培养Sprague Dawley大鼠大脑皮层星形胶质细胞,将培养至第3代的星形胶质细胞传代至96孔板内,待细胞贴壁并长出突触后,随机分为正常对照组、氧糖剥夺组和腺苷预处理组。正常对照组细胞不进行氧糖剥夺;氧糖剥夺组细胞接受氧糖剥夺8 h和复氧糖24 h处理;腺苷预处理组细胞在氧糖剥夺前24 h加入100μmol·L~(-1)腺苷后接受氧糖剥夺8 h和复氧糖24 h处理。复氧糖24 h后观察各组大鼠星形胶质细胞形态变化;采用四甲基偶氮唑盐法检测各组细胞活力;酶联免疫吸附试验检测各组细胞培养基上清液中VEGF和Ang-1水平。结果正常对照组大鼠星形胶质细胞生长状态良好;氧糖剥夺组大鼠星形胶质细胞胞体变圆,水肿明显,细胞形态由不规则形变成梭形,突触明显变短甚至消失;腺苷预处理组大鼠星形胶质细胞水肿较氧糖剥夺组轻,细胞排列相对整齐。正常对照组、氧糖剥夺组、腺苷预处理组大鼠星形胶质细胞活力分别为0.698±0.059、0.196±0.062、0.412±0.009;氧糖剥夺组大鼠星形胶质细胞活力明显低于正常对照组(q=3.561,P<0.05),腺苷预处理组大鼠星形胶质细胞活力明显高于氧糖剥夺组(q=2.102,P<0.05)。正常对照组、氧糖剥夺组、腺苷预处理组大鼠星形胶质细胞培养基上清液中VEGF水平分别为(0.038±0.005)、(0.053±0.007)、(0.084±0.006)μg·L~(-1),Ang-1水平分别为(0.030±0.007)、(0.049±0.008)、(0.080±0.004)μg·L~(-1);氧糖剥夺组大鼠星形胶质细胞培养基上清液中VEGF、Ang-1水平高于正常对照组(q=1.394、1.633,P<0.05),腺苷预处理组大鼠星形胶质细胞培养基上清液中VEGF、Ang-1水平高于氧糖剥夺组(q=1.584、1.632,P<0.05)。结论腺苷预处理能够增加星形胶质细胞缺氧缺糖后VEGF和Ang-1的表达,增强大脑对缺血再灌注损伤的耐受,产生神经保护作用。     

P38信号通路在星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧后水通道蛋白4表达及细胞水肿形成中的作用

摘要：目的探讨P38信号通路在星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧后水通道蛋白4表达及细胞水肿形成中发挥的作用。方法原代
培养的星形胶质细胞分为正常组,模型组和P38抑制剂组。模型组：细胞接受5 h氧糖剥夺/复氧处理;P38抑制剂组：细胞在5 h
氧糖剥夺后的复氧过程中加入P38 抑制剂（SB203580,10 μmol/L）处理。在5 h 氧糖剥夺/复氧后的不同时间点,用RT-PCR及
Western blotting法测定P38、磷酸化P38及水通道蛋白4（AQP4）的表达变化,光镜观察细胞形态变化,乳酸脱氢酶测定反应细胞
损伤程度。结果与正常组相比,星形胶质细胞在5 h氧糖剥夺/复氧后,其磷酸化P38的水平明显上升,并在复氧1h时达到峰值
（P<0.01）,AQP4 mRNA和蛋白的表达也明显升高（P<0.01）,同时细胞水肿在氧糖剥夺/复氧后2 h时达到高峰,LDH漏出率也
明显升高（P<0.01）。与模型组相比,加入P38抑制剂可明显降低5 h氧糖剥夺/复氧后P38磷酸化的水平（P<0.01）,以及复氧后
各时间点AQP4增高的水平（P<0.01）,并可明显缓解氧糖剥夺/复氧后细胞水肿及LDH上升的程度（P<0.01）。结论P38信号通
路的激活参与了星形胶质细胞5 h氧糖剥夺/复氧后AQP4上调及细胞水肿形成,抑制p38的激活可降低AQP4表达的上调,减轻
细胞水肿。
     

氧糖剥夺、复氧后损伤星形胶质细胞中MMP-9的表达变化与意义

目的通过观察金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)在氧糖剥夺、复氧培养后损伤星形胶质细胞中基质的表达变化并抑制其活性,探讨其在氧糖剥夺、复氧后细胞损伤中的意义。方法将星形胶质细胞分为正常组、模型组和GM6001组。模型组细胞在无糖DMEM培养基,1%O2的培养条件下行3、5、7 h时长的氧糖剥夺后复氧至24 h。GM6001组细胞在5 h氧糖剥夺、复氧的过程中加入外源性基质金属蛋白酶抑制剂(GM6001,10μmol/ml),复氧至24 h。用RT-PCR测定不同时长氧糖剥夺后星形胶质细胞MMP-9 mRNA表达变化,ELISA法测定细胞培养上清液中MMP-9蛋白的浓度变化;用光学显微镜观察各组的细胞形态变化,LDH漏出率、CCK-8法检测细胞的损伤情况及存活率。结果①RT-PCR及ELISA法检测示:与正常组相比,氧糖剥夺、复氧后,模型组细胞MMP-9 mRNA表达量和细胞培养上清液中MMP-9蛋白的浓度均有所增加(P<0.05),随着氧糖剥夺时间的延长,均呈现不断上升趋势;②与正常组相比,氧糖剥夺、复氧后,模型组细胞明显损伤,随着氧糖剥夺时间的延长,细胞损伤加重,光镜下细胞出现明显肿胀,并有部分细胞呈凝固性坏死,LDH漏出率不断增高(P<0.01)、存活率则逐渐下降(P<0.05,P<0.01),且培养上清MMP-9蛋白浓度与细胞LDH漏出率的增高程度呈正相关(r=0.693,P<0.05);与模型组相比,5 h氧糖剥夺、复氧后,GM6001组细胞形态学损伤表现明显减轻,LDH漏出率水平也有明显下降(P<0.01),细胞存活率则显著上升(P<0.05)。结论 MMP-9过表达可能是氧糖剥夺、复氧后引起细胞损伤的重要因素之一。     

低(无)糖、缺氧和缺氧/复氧对培养鼠脑胶质细胞活力及致损的影响

目的 :研究氧、糖剥夺和缺氧 /复氧单一或联合因素对培养鼠脑星形胶质细胞活力和引起损伤的影响及其时效反应。方法 :培养的鼠脑星形胶质细胞分为 3组 :无糖组 (D Hanks液 )、低糖组 (DMEM中含 2 .75mmol葡萄糖 )和正常糖组 (DMEM中含 5 .4 9mmol葡萄糖 ) ,各组分别进行不同时间的缺氧和 /或缺氧 /复氧。通以 5 %CO2 +95 %N2 混合气造成缺氧 ,以乳酸脱氢酶 (LDH)漏出率作为细胞受损指标 ,噻唑蓝 (MTT)降解率评测细胞活力。结果 :①在正常氧培养 2 4h ,低糖和无糖培养的细胞LDH漏出率和MTT降解率并不出现明显变化 ;② 3组二项指标在缺氧培养的各时间点依次出现明显变化 ,无糖组为 8h(P <0 .0 5 ) ,低糖组和正常糖组为 12h(P <0 .0 5 ) ,2 4h(P <0 .0 1) ;③缺氧 /复氧引起 3组二项指标出现明显变化 ,其时间点分别为无糖组缺氧 4h +复氧 12h(P <0 .0 5 ) ;低糖组缺氧 8h +复氧 12h (P <0 .0 5 ) ;正常糖组缺氧 8h +复氧 2 4h (P <0 .0 5 ) ;④在同一缺氧和缺氧 /复氧时间点 ,指标值变化程度为无糖组 >低糖组 >正常糖组 ;且两项指标的变化具有时间依赖性 ,呈反变关系。结论 :①氧、糖剥夺和缺氧复氧能引起培养的鼠脑星形胶质细胞的损伤 ;②氧、糖剥夺和缺氧 /复氧联合作用时能增加对培养的鼠脑星形胶质细胞     

载脂蛋白E对星形胶质细胞缺氧性损伤的保护作用

目的探讨载脂蛋白E(apolipoprotein E,APOE)在星形胶质细胞缺氧性损伤中的作用及相关机制。方法①原代培养APOE基因敲除鼠、APOE基因野生鼠的星形胶质细胞,并分别予以缺氧6 h,流式细胞仪分别检测两组细胞早期凋亡率情况;②将培养成熟的APOE基因野生鼠的星形胶质细胞分为常氧组、缺氧组和干预组(缺氧+ERK抑制剂),分别予以缺氧组和干预组缺氧6 h,干预组在缺氧之前向培养基中加入ERK信号通路抑制剂U0126,Western blot法分别检测检测3组细胞APOE蛋白表达变化情况。结果①缺氧6 h后,APOE基因敲除鼠组星形胶质细胞早期凋亡率[(5.67±0.35)%]明显高于APOE基因野生鼠组[(2.77±0.24)%](P<0.05);②与常氧组、干预组相比较,缺氧组星形胶质细胞表达的APOE蛋白明显增加(P<0.05)。结论 APOE对星形胶质细胞缺氧性损伤具有保护作用,缺氧后星形胶质细胞APOE蛋白水平上调与ERK信号通路有关。     

糖氧剥夺/再灌注损伤对人正常肝L02细胞自噬水平的影响

目的 探讨糖氧剥夺/再灌注损伤(OGD/R)对人正常肝L02细胞自噬水平的影响.方法 体外培养人正常肝L02细胞,制备OGD/R模型,模拟临床的肝脏缺血再灌注损伤.分为5组:正常对照组、OGD 6 h/R 1、3、6、12 h组.随后在倒置显微镜下观察L02细胞形态;采用MTT比色法检测L02细胞的相对增殖情况;Western blot法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1和p62的表达变化.结果 与正常对照组相比,随着再灌注时间的延长,OGD/R组处理L02细胞的形态损伤逐渐加剧,增殖活性逐渐降低,呈时间依赖性.自噬相关蛋白LC3和Beclin-1在OGD 6 h/R 1 h即有所增高,随着再灌注时间的延长,LC3的表达量逐渐增高并于再灌注6 h时大量增加,于再灌注12 h时达到最大值(P<0.01);Beclin-1蛋白的表达量随再灌注时间的延长逐渐增加于6 h和12 h急剧增加(P<0.01);p62蛋白于OGD 6 h/R 1 h时和3 h无明显变化,而在再灌注6 h时开始急剧增加,于12 h达到最大值(P<0.01).结论 OGD/R可诱导人正常肝L02细胞自噬水平上调,并且导致细胞的自噬性死亡.     

Cu-ATSM保护内皮细胞糖氧剥夺再灌注损伤的机制

目的：探讨铜-二乙酰-2（N4-甲基氨基硫脲）（Cu -ATSM）对糖氧剥夺再灌注（OGD/R）后人脐静脉内皮细胞（HUVECs）凋亡的作用及其潜在机制。方法：将体外培养的HUVECs分为Control组、OGD/R组、OGD/R+Cu-ATSM组;采用流式细胞术检测HUVECs的凋亡情况;采用Mito-tracker染色检测线粒体形态;JC-1染色分析各组线粒体膜电位的变化;采用蛋白质印迹法（Western blot）检测各组自噬相关蛋白如ATG5、Beclin1、LC3I/II的激活情况;采用免疫荧光检测各组细胞LC3II的表达情况。结果：流式细胞术结果显示,与Control组比,OGD/R损伤后HUVECs凋亡数目显著上升,而当Cu-ATSM治疗后,凋亡的HUVECs显著减少（均P ＜0.05）。Mito-tracker及JC-1染色结果显示,与Control组比,OGD/R组损伤后线粒体的形态明显受到损伤,线粒体功能受损,膜电位下降,而OGD/R+Cu-ATSM组治疗后能够改善损伤的线粒体功能,维持线粒体形态和线粒体膜电位（均P ＜0.05）。Western blot结果显示,与Control组比,OGD/R组损伤后自噬相关信号通路如ATG5、Beclin1、LC3II蛋白的表达量增多,而OGD/R+Cu-ATSM组治疗后的自噬相关蛋白表达量较OGD/R组下降（均P ＜0.05）。免疫荧光结果显示,与Control组比,OGD/R组损伤后LC3II的表达显著增多,而OGD/R+Cu-ATSM治疗后的LC3II显著减少。结论：Cu-ATSM能够改善HUVECs OGD/R损伤后的线粒体功能,减少HUVECs凋亡,其机制可能是通过抑制自噬实现的。     

体外诱导SH-SY5Y细胞凋亡的氧糖剥离再灌注模型的建立及评价

目的：通过体外模拟缺血-再灌注损伤（I/R）诱导细胞凋亡的氧糖剥离再灌注(OGD/R)模型的建立与评价,探讨成功诱导神经元凋亡发生的可靠时间窗,为进一步阐明神经元凋亡机制奠定基础。方法：选用人神经母细胞瘤系SH-SY5Y细胞分为对照组和实验组,实验组给予不同的OGD/R时间,通过MTT法计算细胞存活率,选定再灌注24 h存活率接近50％的OGD10h/R组和对照组细胞,通过光镜、荧光显微镜及电镜观察细胞形态学改变,采用试剂盒检测培养液中乳酸脱氢酶（LDH）水平、胞浆内丙二醛（MDA）含量及细胞中超氧化物歧化酶（SOD）活力,流式细胞术检测细胞周期和凋亡率。结果：MTT法结果显示,细胞存活率随OGD时间延长显著降低,OGD10h/R24h组为对照组的（44.91±1.21）%,不同OGD/R时间组间细胞存活率比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。倒置显微镜及HE染色显示,OGD10h/R组细胞密度减低,形态多样性,核固缩;AO/EB荧光染色可见凋亡小体形成,电镜显示核内异染色质凝集、趋边等凋亡的改变。实验组培养液内LDH水平及胞浆内MDA含量随再灌注时间延长而增加,LDH水平于再灌注24 h达峰值,MDA含量于再灌注24 h接近平台期,胞浆内SOD活性随再灌注时间延长呈现先降低后回升的趋势,与相同时间对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。流式细胞术检测细胞周期显示,随再灌注时间延长,OGD10h/R组G0/G1期细胞比例逐渐增加,24 h达峰值（74.09±2.62）%,其后有所降低,G2/M期细胞比例再灌注0 h时最高达（26.85±1.35）%,此后逐渐降低,24 h前均显著高于同时间对照组细胞,S期细胞比例逐渐降低,24 h最低达（19.2±1.58）%,此后逐渐升高,与同时间对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论：体外模拟I/R模型的OGD10h/R组能够成功诱导SH-SY5
Y细胞凋亡的发生,可进一步应用于凋亡机制的研究。     

体外模拟脑缺血再灌注OGD/R模型的差异凝胶电泳分析

目的：通过体外模拟缺血-再灌注损伤（I/R）诱导细胞凋亡的氧糖剥离再灌注（OGD/R）模型的建立,应用蛋白质组学技术观察凋亡细胞蛋白质组的差异表达,进一步揭示神经元凋亡的发生机制。方法：选用人神经母细胞瘤系SH-SY5Y细胞分为对照组和实验组,实验组给予OGD10h/R24h处理建立OGD/R诱导SH-SY5Y细胞凋亡模型,提取对照组和实验组细胞总蛋白,利用荧光染色双向差异凝胶电泳技术(2D-DIGE) 检测细胞蛋白质组的差异表达变化。结果：DeCyder软件分析2D-DIGE凝胶图像显示平均分离了（1 800±156）个蛋白质点;与对照组比较,实验组共有30个蛋白点的表达水平有显著变化（蛋白表达量上调或下调30％以上）,其中22个升高,8个降低,与同时间对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01) 。结论：应用双向差异凝胶电泳的蛋白质组学技术在OGD/R模型中发现有差异蛋白的表达。     

体外培养大鼠皮层神经元和星形胶质细胞氧糖剥夺后DDR1的表达情况

目的:探讨DDR1蛋白在氧糖剥夺后的神经元细胞及星形胶质细胞中的表达情况,推测可能机制。方法:采用SD孕鼠的胚鼠皮层培养神经元,采用新生SD大鼠皮层培养星形胶质细胞。建立氧糖剥夺(OGD)损伤模型并随机分为神经元正常对照组、神经元OGD组、星形胶质细胞正常对照组和星形胶质细胞OGD组。噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞活性;免疫荧光染色及Western blot方法检测各组DDR1的表达情况。结果:与正常对照组相比,OGD组细胞形态发生明显改变,MTT法测得细胞活性值降低;与神经元正常对照组相比,神经元OGD组的DDR1蛋白表达水平增加(P<0.05);与星形胶质细胞正常对照组相比,星形胶质细胞OGD组的DDR1蛋白表达水平无明显增加(P>0.05)。结论:OGD处理可诱导DDR1蛋白在大鼠皮层神经元中的表达,提示DDR1蛋白可能参与OGD后细胞凋亡等病理生理过程。     

PKA-PINK1/Parkin信号通路在氧糖剥夺/复氧复糖后大鼠皮质星形胶质细胞凋亡和焦亡中的作用

目的评价蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）-PTEN诱导性激酶蛋白1（PTEN induced putative kinase 1,PINK1） /E3泛素连接酶（E3 ubiquitin ligases, Parkin）信号通路在氧糖剥夺/复氧复糖后大鼠皮质星形胶质细胞凋亡和焦亡中的作用。 方法体外培养SD新生大鼠原代皮质星形胶质细胞,将细胞接种于6孔板或96孔板,根据随机数字表法将星形胶质细胞分为4组（n=42）：对照组（C组）、氧糖剥夺组（oxygen-glucose deprivation,OGD/R组）,H89+氧糖剥夺（H89+OGD/R, HO组）,H89对照组（H组）,H89为PKA特异性抑制剂。采用无糖培养基在无氧条件下（95% N2和5% CO2的混合气体内）孵育6 h,再放置在含有5% CO2的正常环境下培养24 h的方法制备氧糖剥夺/复氧复糖损伤模型,HO组和H组在氧糖剥夺前1 h向培养基内加入H89 10 μmol/L, C组和H组PBS洗涤后置于含有5% CO2的正常培养箱中培养。根据上述各组处理后,采用膜联蛋白（Annexin V）-FITC/碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）免疫荧光双染流式细胞学法测定细胞凋亡率,采用半胱天冬酶-1裂解片段（cleaved caspase-1）/PI免疫荧光双染流式细胞学法测定细胞焦亡率,采用四甲基偶氮唑法测定细胞存活率,采用Fluo-3/AM免疫荧光法测定细胞内钙离子浓度,二氯荧光黄双乙酸盐（2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA）法测定活性氧（reactive oxygen species, ROS）含量,酶联免疫吸附法检测PKA活性,蛋白免疫印迹法法检测PINK1和Parkin的表达。 结果与C组比较,OGD/R组和HO组皮质星形胶质细胞的凋亡率和焦亡率、细胞内游离钙离子浓度、ROS含量、PKA活性、PINK1和Parkin表达升高,细胞存活率下降（P＜0.05）;与OGD/R组比较,HO组皮质星形胶质细胞的凋亡率和焦亡率、细胞内游离钙离子浓度、ROS含量、PKA活性PINK1和Parkin表达下降,细胞存活率升高（P＜0.05）;C组与H组以上各项指标差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论抑制PKA-PINK/Parkin信号通路过度活化能够减轻氧糖剥夺/复氧复糖后大鼠星形胶质细胞凋亡和焦亡。     

神经干细胞在缺氧后的分化情况及相关信号通路初探

目的观察缺氧缺糖后神经干细胞在不同时间点的分化趋势,以及与信号通路促红细胞生成素受体(EPOR和βCR)和PDZ连接激酶(PBK)的相关性。方法分离小鼠原代神经干细胞,制备氧糖剥夺(OGD)模型,缺氧3 h,复氧1 h、2 h、4 h、6 h、8 h,观察神经干细胞OGD的分化趋势,采用RT-PCR技术检测少突胶质细胞标志物CNP和MBP、星型胶质细胞标志物GFAP和S100B、神经元标志物RBFOX3、MAP2和TUBB3以及信号分子EPOR、CSF2RB、PBK的基因表达,并进行了Pearson相关性分析。结果 (1) OGD处理促进神经干细胞向少突胶质细胞方向分化,Cnp和Mbp表达呈升高趋势,复氧4 h Cnp显著升高。(2) OGD处理促进神经干细胞向星形胶质细胞方向分化,复氧2-8 h S100b显著升高,复氧2 h和6 h Gfap表达显著降低,复氧8 h表达显著增加。(3) OGD处理减少神经干细胞向神经元方向分化,Rbfox3以及Tubb3表达显著降低,复氧2 h和6 h最为显著。(4) Pbk在复氧1 h和8 h显著降低,Epor、Pbk与Cnp的表达呈正相关,Pbk与Mbp的表达呈正相关。结论缺氧缺糖损伤显著促进神经干细胞向少突胶质细胞和星形胶质细胞新生,同时抑制向神经元方向的分化。EPOR以及PBK可能参与到脑缺血后神经干细胞向少突胶质细胞分化的调控过程,为进一步研究相关信号通路在缺血后神经再生中的调控机制提供了基础。     

缺氧对星形胶质细胞 DNA甲基化及组蛋白乙酰化相关酶的表达影响

目的研究缺氧对原代培养星形胶质细胞DNA甲基化相关酶及组蛋白乙酰化相关酶水平的影响。方法原代培养的星形胶质细胞经氧糖剥夺处理后,Westernblot方法检测细胞DNA甲基转移酶,DNA去甲基转移酶,组蛋白乙酰化酶及组蛋白去乙酰化酶的表达。结果原代培养的星形胶质细胞缺氧处理48h后,DNA甲基转移酶的表达升高,DNMT3A和DNMTl与对照组相比分别升高了49％和83％,DNA去甲基转移酶的表达降低了36％;组蛋白去乙酰化酶的表达升高到对照组的2．1倍,而组蛋白乙酰化酶的表达则升高得更为明显,为对照组的20倍。结论缺氧可以改变星形胶质细胞DNA甲基化和组蛋白乙酰化相关酶的表达,从而影响基因的表达。