狼毒(月腺大戟)主要萜类效应成分模拟醋制前后对巨噬细胞致炎毒性及肾脏细胞AQPs表达的差异研究

  目的  探究狼毒效应部位中主要萜类成分模拟醋制前后毒、效作用变化,阐释狼毒醋制解毒存效的机制, 探寻狼毒醋品质量标志物。  方法  将狼毒萜类成分Eupractenoid A(EA)、Jolkinolide B(JNB)、Fischeria A(FA)采用模拟醋制法在160 ℃加6%冰醋酸加热40 min, 以Western blot法分析3种萜类成分醋制前后对巨噬细胞RAW264.7中TNF-α和IL-1β蛋白表达水平影响的差异; 以Western blot法分析3种萜类成分醋制前后对肾小管上皮细胞HK-2中AQP1及肾集合管上皮细胞mIMCD3中AQP2、3、4蛋白表达水平影响的差异。  结果  EA、JNB、FA可诱导巨噬细胞炎症因子TNF-α和IL-1β蛋白表达水平显著增高(P < 0.05)。EA、JNB、FA醋制后致炎毒性均显著下降。EA主要转化产物Euphebracteolatin A(EHTA)无明显促炎毒性。药效评价显示, EA及其模拟醋制产物可显著抑制AQP1、3、4蛋白表达(P < 0.05), EA醋制后对AQP1、2、4蛋白表达的抑制作用显著增强(P < 0.05)。EHTA对肾细胞AQP1、2、3蛋白表达的抑制作用显著强于EA(P < 0.05), 对AQP4蛋白表达的抑制作用与EA相比无显著性差异, 表明EA醋制可增强药效。JNB可显著抑制AQP1、3蛋白表达(P < 0.05)。其模拟醋制产物可显著抑制AQP1、2、3、4蛋白表达, 且JNB醋制后对AQP2、3、4蛋白表达的抑制作用显著增强(P < 0.05), 表明JNB醋制后药效增强。FA醋制后对AQPs调节作用显著降低(P < 0.05), 但高剂量组仍起作用。  结论  狼毒主要萜类效应成分经模拟醋制后致炎毒性减弱, 但醋制后药效总体呈现增强或保留。同时EA转化产物EHTA无明显促炎毒性, 药效作用强于其转化前体EA, 可作为狼毒醋制品质量控制指标。      

电针不同穴组对功能性便秘大鼠结肠黏膜超微结构及AQP3、AQP8表达的影响

目的 探讨电针不同穴组治疗功能性便秘（FC）大鼠的作用机理。方法 FC动物模型采用0 ℃ 0.9%氯化钠溶液对SD大鼠灌胃复制,随机分为模型组、电针1组（EAⅠ组）、电针2组（EAⅡ组）和电针3组（EAⅢ组）,正常组采用SD大鼠。EAⅠ组取天枢、大肠俞（双侧）、EAⅡ组取曲池、上巨虚（双侧）、EAⅢ组取天枢、大肠俞、曲池、上巨虚（单侧）进行电针治疗。观测粪便性状和肠道炭末推进率评定大鼠肠动力,透射电镜检测大鼠结肠黏膜超微结构,Western blot检测大鼠结肠AQP3、AQP8蛋白表达,qPCR检测大鼠结肠AQP3、AQP8 mRNA表达。结果 EAⅡ组大鼠24 h粪便粒数、24 h粪便含水量和肠道炭末推进率均显著增加,首次黑便时间显著减少（P<0.05）,结肠黏膜超微结构经EAⅡ干预后显著改善,模型组大鼠结肠黏膜AQP3、AQP8蛋白和AQP3、AQP8 mRNA表达显著高于正常组（P<0.05）,经EAⅡ干预后表达显著降低,具有统计学意义（P<0.05）。结论 电针刺激曲池、上巨虚可能通过降低FC大鼠结肠黏膜AQP3、AQP8蛋白和AQP3、AQP8 mRNA表达,减少结肠水分重吸收,增加结肠粪便含水量,调节水分转运,改善结肠黏膜超微结构,增强肠动力,起到改善便秘症状的作用。      

甘露醇对重型颅脑损伤后脑组织含水量及AQP4表达的变化

目的探讨重型颅脑损伤（traumatic brain injury,TBI）及应用甘露醇后脑组织含水量及水通道蛋白-4（AQP4）表达变化,及其与脑损伤后脑水肿之间的关系。方法将24只小鼠随机分为3组,应用自由落体打击法,制作重度颅脑损伤模型（TBI组）、假手术组（SO组）及TBI加注甘露醇（实验组）。每组于伤后8h取出小鼠损伤脑组织采用干湿重法、免疫组化方法分别计算脑组织含水量及AQP4的变化。结果损伤后8h实验组脑组织含水量较TBI组降低,但仍高于SO组。实验组AQP4表达较TBI组降低,但也高于SO组。结论AQP4与损伤后脑水肿的形成有密切关系,在探索治疗脑水肿的新型脱水药中发挥着重要作用。     

醋制对商陆促利尿作用的影响及其机制研究

目的 探索毒性中药商陆醋制前后对机体利尿作用及相关指标的影响。方法 灌胃给予盐水负荷模型大鼠商陆醋制前后的水煎液,测定给药5 h内尿量变化、血浆抗利尿激素(ADH)、醛固酮(ALD)、心房钠尿肽(ANP)含量及肾脏水通道蛋白AQP2、AQP3、AQP4表达水平。结果 商陆醋制前后均能导致大鼠尿量显著增加（P<0.01）,醋制品较生品组大鼠尿量有显著增强（P<0.05）;商陆生品仅高剂量可显著降低血浆ADH水平（P<0.01）,同时有降低ALD、增加ANP水平的趋势,但无显著性差异;商陆醋品则可显著降低血浆ADH、ALD水平,升高ANP含量（P<0.05~0.01）;商陆生品可显著抑制肾脏中AQP2、AQP3和AQP4蛋白表达（P<0.05~0.01）,醋制后可显著抑制AQP2、AQP3蛋白表达水平（P<0.01）,对AQP4蛋白表达与模型组相比无显著性影响,且醋制品较生品抑制AQP3蛋白表达更显著（P<0.05）。结论 商陆经醋制后仍具有较强的利尿作用,且分子水平的效应比生品更强。商陆利尿作用的机制除与其改变机体体液代谢相关的激素水平外,还可能与其抑制肾脏远曲小管和集合管AQPs蛋白表达,进而抑制水的重吸收有关。      

从肺脾肾不同组织水通道蛋白变化研究中医“水液代谢理论”的实验基础

目的从肺脾肾不同组织水通道蛋白变化研究中医“水液代谢理论”的实验基础。方法通过2%腺嘌呤混悬液灌胃4周制
备肾阳虚大鼠模型,并予肉苁蓉煎液进行干预6周,检测尿17羟皮质醇值含量、尿肌酐和尿渗透压,检测水通道蛋白1（AQP1）基
因在肺、脾、肾的表达量的变化,及AQP1蛋白在各组织的表达情况。结果腺嘌呤模型大鼠尿17羟皮质醇值含量较正常组降
低,符合肾阳虚,同时尿肌酐和尿渗透压降低。AQP1基因在腺嘌呤模型大鼠脾、肾组织的表达下调,肉苁蓉干预组AQP1基因
在肺、肾组织的表达较模型组显著上调。AQP1蛋白在腺嘌呤模型组肺脾肾各组织中表达均增加,经肉苁蓉干预的大鼠肺肾组
织中AQP1蛋白表达减少。结论肺、脾、肾均参与水液调节,AQP1是其分子基础之一,补益肾阳药物肉苁蓉有上调AQP1基因
的作用,AQP1蛋白的表达还受到其他因子的调控。
     

阳和平喘颗粒对哮喘大鼠肺组织AQP1和AQP5表达的影响

目的 通过研究阳和平喘颗粒对哮喘大鼠肺组织水通道蛋白1（AQP1）和水通道蛋白5（AQP5）表达的影响,旨在从水液代谢及气道黏液分泌的角度探讨阳和平喘颗粒治疗支气管哮喘的作用机制。方法 SD大鼠90只随机分为正常组（N）、模型组（M）、阳和平喘颗粒低、中、高剂量治疗组（YHPC-L、YHPC-M和YHPC-H）和地塞米松治疗组（DXM）,每组15只。其中,M、YHPC-L、YHPC-M、YHPC-H和DXM组采用卵蛋白（OVA）腹腔注射致敏及雾化吸入的方法建立哮喘大鼠模型,同时应用氢化可的松腹腔注射复制肾阳虚模型,N组则均使用生理盐水作为对照。采取HE染色检测各组大鼠肺组织形态学改变,应用Real-time PCR和Western blot检测各组大鼠肺组织AQP1和AQP5 mRNA及蛋白表达水平的变化,采用免疫组化法检测AQP1和AQP5在肺组织的分布及表达水平变化。结果 与N组相比,M组AQP1和AQP5在mRNA及蛋白表达水平均发生显著下降（P<0.01）;与M组相比,YHPC-L、YHPC-M和YHPC-H组AQP1和AQP5的表达水平均显著上升（P<0.05~0.01）,且具有一定的剂量依赖效应;与DXM相比,YHPC-L对AQP1和AQP5的作用效果低于DXM（P<0.05）,而YHPC-M和YHPC-H则与之具有相当的作用效果（P>0.05）。结论 阳和平喘颗粒可通过上调AQP1和AQP5的表达而调控水液代谢平衡及气道黏液分泌,进而发挥其治疗支气管哮喘的作用。      

脾阳虚证大鼠回肠水通道蛋白4表达变化研究

目的：通过对脾阳虚大鼠回肠水通道蛋白4（AQP4）表达的检测,探讨脾阳虚证状态下大鼠水液代谢的影响。方法：对正常组、脾阳虚模型组、中药反证组分别行免疫组织化学、RT-PCR及Western blot的方法检测AQP4在回肠的表达及分布情况。结果：①脾阳虚状态下,大鼠回肠上皮细胞细胞膜的AQP4分布量显著减少,经温补脾阳中药治疗后,其分布量有所回升,但仍低于正常组。②脾阳虚模型组AQP4 mRNA及蛋白表达量均明显低于正常组（P〈0.05）。中药反证组AQP4 mRNA表达量均明显高于模型组（P〈0.05）,蛋白表达虽然有所提高,但却没有统计学意义（P〉0.05）。结论：脾阳虚证状态下大鼠回肠AQP4表达下调,导致回肠对水分的吸收出现障碍,提示可能与脾阳虚证的病理机制有关。     

重型脑损伤后AQP4表达与脑水肿的关系

目的观察重型脑损伤后水通道蛋白-4（AQP4）表达变化，及其与脑损伤后脑水肿之间的关系。方法健康成年Wistar大鼠，随机分成创伤性脑损伤（TBI）组和各假手术（SO）组。自由落体硬膜外撞击方法致重度脑创伤模型。于伤后4h、8h、12h、1d、3d、5d、7d取出大鼠脑组织，免疫组化（IHC）和原位杂交（ISH）检测AQP4的表达变化，干湿重法计算脑组织含水量。结果IHC和ISH显示，脑损伤后AQP4在脑组织中的表达上调，1d达高峰，持续至3d后下降，7d接近SO组水平。与SO组相比，除7d亚组外，TBI其余各亚组中AQP4表达水平均明显增高（P〈0、05）。脑损伤后4h脑组织含水量即比SO组增加（P〈0、05），随时间延长，脑组织含水量亦逐渐增加，伤后1-3d达高峰。AQP4表达和脑组织含水量呈正相关，r=0．978，P〈0，01。结论脑损伤后，随着脑水肿加重，AQP4表达上调。提示脑损伤后AQP4的表达变化与脑水肿的形成密切相关，AQP4在损伤后脑水肿的形成中发挥着重要作用。     

水通道蛋白9表达与大鼠缺血性脑水肿形成的关系

目的:研究水通道蛋白9(Aquaporin9,AQP9)在大鼠缺血性脑组织中的表达及其与脑水肿形成之间的关系.方法:采用线拴法制作大鼠局灶性脑缺血模型,通过光镜、电镜技术观察脑水肿区的病理变化,干湿重法检测脑含水量,采用原位杂交、免疫组化方法观察AQP9及其mRNA在脑组织中的表达.结果:缺血后细胞及血管周围间隙明显扩大,部分细胞坏死,胶质细胞增生;大鼠穹隆下器官、脉络丛、大脑皮质、视上核、海马等部位AQP9及其mRNA的表达上调,48～72h达峰值;脑组织含水量亦在72h达高峰.结论:随缺血性脑水肿的出现,AQP9及其mRNA表达上调,提示AQP9可能在缺血性脑水肿的形成中发挥重要作用.     

红景天苷对大鼠缺血性脑水肿的影响

目的研究红景天苷(salidroside)对水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)在大鼠缺血性脑组织中表达的影响。方法采用线拴法制作大鼠局灶性脑缺血模型,实验分为模型组、假手术组、红景天苷组。通过光镜技术观察各组别脑水肿区的病理变化,干湿质量法检测脑含水量,采用原位杂交、免疫组化方法观察AQP4及其mRNA在脑组织中的表达,硫代巴比妥酸法和定磷法测定缺血脑组织中丙二醛(MDA)、Na ,K -ATPase活性。结果缺血后模型组的细胞及血管周围间隙明显扩大,部分细胞坏死,神经胶质细胞增生;大鼠穹隆下器官、脉络丛、大脑皮质、视上核、海马等部位AQP4及其mRNA的表达上调,48～72 h达峰值;脑组织含水量亦在72 h达高峰。红景天苷组脑组织形态结构无明显改变,脑组织含水量、MDA水平、AQP4及其mRNA的表达明显低于模型组;而Na ,K -ATPase活力明显高于模型组。结论红景天苷可抑制缺血性脑水肿组织中AQP4及其mRNA的过表达,防止脑水肿的发生。     

心康冲剂对慢性心衰大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA表达的影响

目的 观察心康冲剂对慢性心衰大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA表达的影响,探讨其对慢性心衰水潴留的作用机制.方法 70只SD大鼠随机抽取10只为正常对照组,其余大鼠腹腔注射阿霉素（2 mg/kg,1次/周,共10周）造成心衰模型,再随机分为模型对照组,芪苈强心组,心康冲剂低、中、高剂量组.药物干预6周后,各组随机取6只存活大鼠,检测肾脏AQP2mRNA、AVPV2mRNA表达水平的变化.结果 与正常组相比,模型组AQP2mRNA、AVPV2mRNA的表达上升,差异有统计学意义;与模型组相比,芪苈强心组、心康冲剂各组均可显著下调AQP2mRNA、AVPV2mRNA的表达（P＜0.05）;与芪苈强心组相比,心康冲剂各组下调AQP2mRNA、AVPV2mRNA表达更为明显,差异有统计学意义（P＜0.05）.心康冲剂各组间比较无显著性差异（P＞0.05）.结论 心康冲剂可下调慢性心衰大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA的表达,可能是其利尿消肿的作用机制之一.     

血管活性肠肽对便秘大鼠排便及结肠组织中#br# VIP-cAMP-PKA-AQP3信号通路的影响

目的：观察血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)对便秘大鼠肠道水液代谢、环磷酸腺苷-蛋白激酶A信号通路(cyclic AMP protein kinase A signaling pathway,cAMP-PKA)和水通道蛋白3(water channel protein 3,AQP3)的影响,探讨VIP治疗便秘的作用及机制。方法：45只健康成年Sprague-Dawley大鼠随机分为空白对照组、模型组、模型+ VIP组。给药4周后,墨汁灌胃法检测大鼠首粒黑便排出时间;根据大鼠粪便干湿重计算粪便含水率;HE染色观察各组大鼠结肠组织形态学变化;Western 印迹检测各组大鼠结肠组织中 VIP和AQP3蛋白表达水平;定量即时聚合酶链锁反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qPCR)检测各组大鼠结肠组织中cAMP,PKA和AQP3 mRNA的表达水平。结果：与空白对照组比较,模型组大鼠首粒黑便出现时间延长,粪便含水率明显减少(均P<0.01);结肠黏膜上皮部分破坏,杯状细胞体积减小,数量明显减少;结肠组织中VIP和AQP3蛋白含量明显减少,AQP3,cAMP和PKA mRNA相对表达水平均有所降低(均P<0.05)。与模型组比较,模型+VIP组大鼠首粒黑便出现时间缩短,粪便含水率明显增加(均P<0.05);结肠黏膜上皮完整性明显改善,杯状细胞体积增大,数量增多;结肠组织中VIP和 AQP3蛋白含量增多,CAMP,PKA和AQP3 mRNA相对表达水平升高(均P<0.05)。结论：VIP静脉注射能够调节肠道水液代谢,改善大鼠便秘症状,其机制可能与调节VIP-cAMP-PKA-AQP3信号通路有关。     

缩泉润肠方对便秘模型大鼠结肠组织中水通道蛋白的影响

目的:探讨缩泉润肠方对便秘模型大鼠结肠黏膜水通道蛋白的影响。方法:采用复方地芬诺酯混悬液(100 mg·kg^-1)连续灌胃3周建立大鼠便秘模型。将造模成功的大鼠随机分模型组、乳果糖口服液组(0.670 g·kg^-1)、缩泉润肠颗粒剂低剂量组(14.04 g·kg^-1)、缩泉润肠颗粒剂高剂量组(28.08 g·kg^-1),每组10只,另设10只空白对照组大鼠,连续给予相应的药物2周。观察各组大鼠肠道碳墨推进率、粪便含水量;RT-PCR法检测大鼠结肠黏膜AQP3 mRNA、AQP8 mRNA、AQP9 mRNA水平;HE染色观察大鼠结肠病理损伤变化。结果:与模型组比较,缩泉润肠颗粒低、高剂量组大鼠的肠道碳墨推进率及粪便含水量显著增加(P<0.05),乳果糖口服液组碳墨推进率无明显改善(P>0.05),粪便含水量显著增加(P<0.05),缩泉润肠颗粒低、高剂量组及乳果糖口服液组大鼠结肠AQP3 mRNA、AQP8 mRNA水平显著下降,AQP9 mRNA水平显著增加(P<0.05);与乳果糖口服液组比较,缩泉润肠颗粒低、高剂量组碳墨推进率及粪便含水量均显著升高(P<0.05),缩泉润肠颗粒低、高剂量组AQP3 mRNA、AQP8 mRNA水平显著降低,AQP9 mRNA水平显著升高(P<0.05);且各给药组大鼠结肠组织损伤均有所改善。结论:缩泉润肠方可能是通过调控肠道水分的分泌和吸收,增加粪便含水量,加快结肠蠕动,从而发挥通便效应。     

基于斑马鱼幼鱼模型的甘遂毒性评价

[目的]以模式生物斑马鱼幼鱼为模型,评价甘遂不同溶剂连续提取物毒性差异及毒性特征。[方法]采用索氏提取法获得甘遂不同溶剂连续提取物。通过预实验,确定各提取物72 h最大不致死浓度和最小全致死浓度。在此区间设定6~8个药物浓度,建立致死曲线,计算半数致死浓度（LC₅₀）。以毒性最大提取物的10%致死浓度（LC₁₀）、最小致死浓度（LC₁）、1/3 LC₁和1/10 LC₁为给药浓度,同时设立空白组和溶剂对照组,连续给药72 h,观察甘遂毒性特征。停药后将幼鱼置于养殖水中恢复48 h,观察毒性可逆性。[结果]甘遂不同提取部位毒性顺序为石油醚 > 二氯甲烷 > 乙酸乙酯 > 乙醇提取物。甘遂的主要毒性为肝毒性和胃肠道刺激性。肝毒性既可造成肝肿大,又可导致肝变性,肝肿大不可逆,而肝变性具有可逆性。[结论]本实验首次利用单个模型以相同浓度单次给药,同时评价了甘遂对心脏、肝脏、肾脏、神经系统和胃肠道等脏器系统的毒性作用及可逆性。实验结果证实了甘遂的毒性集中于石油醚提取部位,并可对肝脏和胃肠道造成实质性损伤。本实验为斑马鱼模型在中药毒性评价中的应用提供了参考。     

雷公藤内酯对海人酸致痫大鼠脑海马区水通道蛋白 4表达的影响

目的 探讨雷公藤内酯对海人酸致痫大鼠海马区水通道蛋白4（AQP4）表达的影响.方法 30只SD大鼠随机分成三组：对照组、海人酸组、雷公藤内酯干预组,每组10只.海人酸组颈内皮下注射海人酸,剂量为10 mg/kg;雷公藤内酯干预组在海人酸注射前连续7d腹腔内注射雷公藤内酯,剂量为30 μg/kg;对照组注射等量的生理盐水.造模成功后取脑海马组织,应用RT-PCR和Western blot法检测各组动物海马区AQP4蛋白的表达.结果 Western blot结果显示,海人酸组和对照组AQP4条带与GAPDH条带的灰度值比分别为0.872±0.141和0.453±0.078,海人酸组AQP4表达显著增多（P＜0.05）;雷公藤内酯干预组中海马AQP4蛋白相对灰度值比为0.647±0.185,表达较海人酸组减少（P＜0.05）.RT-PCR结果显示,海人酸组与对照组AQP4条带与GAPDH条带的灰度值比分别为1.212±0.115和0.843±0.091,海人酸组AQP4 mRNA表达比对照组显著增加（P＜0.05）;雷公藤内酯干预组AQP4 mRNA相对灰度值比为1.105±0.192,与海人酸组比较明显减少（P＜0.05）.结论 雷公藤内酯对海人酸致痫大鼠脑海马区AQP4蛋白的表达有下调作用,可以作为临床难治性癫痫的候选药物之一.