人正常卵巢组织中成纤维细胞的培养

目的:通过分离?纯化?培养及鉴定,获得典型人卵巢成纤维细胞?方法:采用酶消化+反复贴壁法,获得纯化成纤维细胞,通过形态学观察和免疫细胞化学染色,对所得细胞进行特征性标志及生物学特性的检测,进一步阐述细胞特征,并绘制细胞生长曲线?结果:形态学上,正常卵巢成纤维细胞形态多样,大部分为梭形?条索形,还有三角形?多角形和不规则形等,并具有伪足样外形;其生长潜伏期较长,12~14 d可传代;免疫细胞化学上,波形蛋白(vimentin)表达强阳性,结蛋白(desmin)?成纤维细胞特异性蛋白1(FSP-1)表达弱阳性;在较早期传代的细胞中,CK-7及CK-P呈少量阳性,随着细胞的纯化,其阳性表达渐行减少直至完全消失;肌动蛋白α(α-SMA)部分细胞表达阳性?而卵巢黏液性细胞标志CK-20?血管内皮细胞标志CD31?间充质细胞标志CD90?雌?孕激素受体(ER?PR)以及基质金属蛋白酶(MMP-2? MMP-3?MMP-9)?肿瘤标志物CA125?CA19-9?癌胚抗原(CEA)?成纤维细胞激活蛋白α(FAP-α)?血小板衍生生长因子受体α(PDGFR-α)均阴性?结论:成功获得人卵巢成纤维细胞,为研究卵巢癌及其相关成纤维细胞提供了必要的细胞学工具?     

新生大鼠成纤维细胞原代培养

目的探讨新生sD大鼠成纤维细胞的培养方法。方法采用胰酶消化法和组织块贴壁法原代培养成纤堆细胞。采用HE染色及波形蛋白（Vimentin）免疫细胞化学染色对培养细胞进行鉴定。结果两种方法均能培养出成纤维细胞,其中酶消化法一次性可获得较多细胞,但细胞状态较差,贴壁慢,生长慢;组织块贴壁法短时间内可长出大量成纤维细胞,一周即可传代。HE染色后倒置相差显微镜下观察细胞形态典型,免疫细胞化学染色结果显示Vimentin呈阳性反应。结论组织块贴壁培养法是获取成纤维细胞简单,可行,快速的方法。     

人肝癌组织伴生成纤维细胞的体外培养及其生物学性状的初步探讨

目的:体外培养人肝癌组织伴生成纤维细胞,观察其生长状态,为进一步研究其功能奠定基础。方法:应用组织块培养法进行人肝癌伴生成纤维细胞的原代培养,细胞铺满培养瓶底后首次传代,通过胰酶消化法和反复贴壁法进行成纤维细胞的纯化;通过倒置显微镜观察细胞形态、免疫组织化学方法检测细胞膜波形蛋白(v im entin)、角蛋白(keratin)表达情况,对细胞进行鉴定。结果:组织块法原代培养约1周可见纤维样细胞从组织块周围游出,5周左右细胞基本长满培养瓶底。首次传代时应用胰酶消化法进行成纤维细胞的初次纯化,第2次转种时先后应用酶消化法和反复贴壁法再次进行细胞纯化,第3代以后基本可获得呈典型克隆性生长、长梭形纤维样细胞,生长周期短。免疫组化染色结果为v im entin染色阳性,keratin染色阴性。结论:在体外成功培养了人肝癌组织伴生成纤维细胞,并对其生物学性状进行了初步探讨,为进一步研究其与肝癌细胞生长、浸润及转移的关系等机制奠定了基础。     

酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究

目的 提高人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPIF)原代培养的成功率,快速建立体外细胞研究模型。方法 采取组织块与酶消化相结合的方法处理牙周膜组织块,获取细胞;用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源,通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性。结果 原代培养成功率为77．8％。获得的细胞呈梭形,抗波形丝蛋白染色呈阳性,抗角蛋白染色呈阴性,符合人牙周膜成纤维细胞的形态学特征和生物学特性,生长良好。结论 酶消化组织块法可显著提高人牙周膜成纤维细胞原代培养成功率,方法可行。     

不同口腔组织来源成纤维细胞的生物学特性比较

目的:初步探讨口腔不同组织来源的成纤维细胞生物学特性的差异,为深入研究口腔癌相关成纤维细胞(CAFs)的生物学行为奠定基础。方法:用组织块培养法获得原代CAFs和正常粘膜成纤维细胞(NMFs),0.25%胰蛋白酶消化传代和纯化细胞;通过形态学观察和免疫细胞化学染色对口腔CAFs和NMFs进行鉴定;采用半定量RT-PCR检测口腔CAFs和NMFs 4种基因的表达。结果:获得第三代纯化口腔CAFs和NMFs,CAFs表达Vimentin和α-SMA,NMFs只表达Vimentin,二者均不表达Cytokeratin;二者的形态、生长方式、生长速度明显有差异,与NMFs相比,口腔CAFs体积大,细胞呈长梭形,胞浆丰满,核圆形或椭圆形一侧有切迹,杂乱排列,生长速度快;半定量RT-PCR结果显示,口腔CAFs表达不同水平的VEGF、TGF-β1、MMP-9、Tenascin-C,而NMFs均不表达。结论:口腔CAFs的形态和生长速度改变以及口腔CAFs过表达上述4种基因可能是口腔CAFs与口腔癌细胞相互作用所致,为口腔癌细胞的生存和发展提供了有利的微环境。     

人胚胎肾间质成纤维细胞培养及其鉴定

目的：探讨人胚胎肾脏成纤维细胞培养方法。方法：利用人胚胎肾脏肾髓质进行培养，然后通过细胞形态学，超微结构，免疫细胞化学等方法进行分析鉴定。结果：培养的细胞为长梭形，单核，超微结构为典型的成纤维细胞，并表达成纤维细胞表面抗原，波形蛋白，结蛋白，不表达角蛋白。结论：成功地培养出人胚胎肾间质成纤维细胞。     

组织块法培养人胃成纤维细胞及其结缔组织生长因子的表达

[目的]探索人胃成纤维细胞体外培养的技术方法及其结缔组织生长因子表达情况。[方法]采用组织块贴壁培养法进行人胃成纤维细胞体外培养并传代,倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态,并用免疫细胞化学法检测培养细胞的波形蛋白与角蛋白表达。用RT-PCR法检测人胃成纤维细胞结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达,免疫细胞荧光染色法检测人胃成纤维细胞CTGF蛋白表达情况。[结果]人胃成纤维细胞培养成功传代,表现为长梭形或星形细胞,免疫细胞化学鉴定细胞波形蛋白阳性,角蛋白阴性。RT-PCR法与免疫细胞荧光染色法证实体外培养的人胃纤维细胞表达CTGF。[结论]组织块法培养的人胃成纤维细胞可在体外稳定培养、传代,人胃成纤维细胞能合成CTGF。     

SD大鼠肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

目的:建立一种良好的SD大鼠肾小管上皮细胞原代培养、传代及鉴定方法。方法:选用4周龄SD幼鼠的肾皮质进行细胞培养,采用机械研磨、胰酶消化、过滤,Percoll密度梯度离心法分离纯化肾小管后,选择含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行原代培养及传代。制作细胞爬片,用免疫细胞化学(Cytokeratin 18表达阳性)进行鉴定。结果:肾小管上皮细胞围绕肾小管节段呈岛屿状向四周生长,4~5 d后基本达到融合,细胞呈多边鹅卵石样,透明度及折光性强。结合形态学及免疫细胞化学鉴定,原代培养及传代的细胞98%以上为肾小管上皮细胞。结论:采用此方法分离培养的肾小管上皮细胞数量多,均一性生长佳,可重复性操作良好。     

优化贴壁法人皮肤成纤维细胞的原代培养

目的:优化贴壁法原代培养人皮肤成纤维细胞的条件,建立稳定?经济?高效可行的人皮肤成纤维细胞培养方法?方法:采用包皮环切术后皮肤组织,剪成均匀组织块后贴壁,皮肤边缘长出薄层致密细胞团后胰酶消化?传代,并对所培养的细胞进行形态学观察及细胞免疫荧光鉴定?此方法与酶消化法相对照?结果:优化贴壁法成功率100%,取得组织后2 d沿皮肤边缘均开始生长高密度类圆形细胞层,在1周内可获得高质量?高数量的细胞,传代贴壁后经镜下形态观察及细胞免疫荧光染色确定为皮肤成纤维细胞?结论:较之酶消化法,优化贴壁法细胞存活率高,活性及纯度好?该方法可稳定?经济地获得足够数量的细胞?     

酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究

目的：提高人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts，HPLF)原代培养的成功率，快速建立体外细胞研究模型．方法：采取组织块与酶消化相结合的方法处理牙周膜组织块，获取细胞；用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源，通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性．结果：原代培养成功率为77．8％．获得的细胞呈梭形，抗波形丝蛋白染色呈阳性，抗角蛋白染色呈阴性，     

基质金属蛋白酶-2、血管内皮生长因子与卵巢上皮性肿瘤血管生成的关系

目的:探讨基质金属蛋白酶2(MMP2)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达与卵巢上皮性肿瘤血管生成的关系及其临床意义。方法:应用免疫组化SABC法检测20例卵巢良性上皮性肿瘤组织、20例卵巢交界性上皮性肿瘤组织、50例卵巢上皮性癌组织中MMP2、VEGF的表达及微血管密度(MVD)。结果:MMP2表达与卵巢癌的临床分期有关(P<0.05);MMP2表达阳性组的MVD值明显高于阴性组的MVD值(P<0.05),卵巢癌组织中MMP2与VEGF的表达呈显著性正相关(rs=0.600,P<0.05)。结论:MMP2与卵巢肿瘤的血管生成有关,检测MMP2的表达可作为反映卵巢癌侵袭和转移潜能的生物学指标。     

人卵巢上皮癌细胞原代培养及细胞系BUPH:OVSC-1的建立

目的:为人卵巢上皮癌的研究提供更多体外研究模型,确立卵巢上皮癌原代培养的条件,建立细胞系.方法: 将25例卵巢上皮癌手术切除的肿瘤组织或腹水标本进行体外培养,比较不同组织培养方法的效果.对所建卵巢癌细胞系的形态学、染色体核型、生长增殖及裸鼠种植情况进行观察.结果: 建立一套人卵巢上皮癌原代培养方法,使其体外培养传代数扩展至10～15代.经原代培养得到一株人卵巢癌细胞系BUPH:OVSC-1,其形态学、染色体核型分析、接种致瘤性的观察结果表明,该细胞系符合人体恶性细胞特征.裸鼠种植瘤病理切片该细胞呈肉瘤样细胞形态,电镜及角蛋白免疫组化证实其为上皮起源.结论:应用改良的卵巢上皮癌原代培养方法能改善细胞的体外生存期.BUPH:OVSC-1是一株特殊的人卵巢癌细胞系,符合人卵巢肉瘤样癌细胞系的特征,可作为卵巢肉瘤样癌研究的实验模型.     

Ezrin、E-cadherin和β-catenin在卵巢癌组织中的表达及临床意义

目的探讨Ezrin、E-cadherin和伊catenin在卵巢癌组织中的表达及临床意义。方法应用免疫组织化学SP法检测Ezrin、E-cadherin和β-catenin在卵巢癌、良性卵巢上皮肿瘤和正常卵巢组织中的表达。结果Ezrin、E-cadherin和β—catenin阳性细胞呈深棕色,在正常卵巢组织、良性卵巢上皮肿瘤组织及卵巢癌组织中的表达阳性率呈递减趋势,与临床分期、组织学分级及腹腔转移有关。Ezrin、E-cadherin和β-catenin在卵巢癌组织中的表达呈正相关（r=0．428,P〈0．05）。结论卵巢癌组织Ezrin减弱与癌细胞的分化有关,并协同调节E-cadherin和β-catenin而影响卵巢癌细胞的黏附和转移性。     

口腔癌相关成纤维细胞侵袭特性研究

目的采用体外重建基底膜细胞侵袭实验,研究口腔癌相关成纤维细胞（Carcinoma-associated fibroblasts,CAFs）侵袭力,用免疫组织化学法,观察CAFs对相关蛋白的表达。探讨CAFs在口腔鳞癌中的病理意义。方法采用组织块贴壁法培养颊部正常成纤维细胞（Normal Fibroblasts,NFs）和癌相关成纤维细胞CAFs,利用包被matrigel的transwell小室模拟天然基底膜的结构,利用培养基浓度梯度差诱导细胞穿膜并计数穿膜细胞数量,比较CAFs和NFs的侵袭力差异。采用免疫组化法,比较CAFs和NFs对基质金属蛋白酶-2（matrix metalloprotease-2,MMP-2）和成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activation protein,FAP）表达差异。结果 CAFs穿膜的细胞数量显著高于NFS（P〈0.05）,差异具有统计学意义。CAFs对MMP-2和FAP的蛋白表达阳性,NFs表达为阴性。结论口腔CAFs的体外侵袭能力明显高于NFs,且能特异性地分泌MMP-2和FAP蛋白。这提示肿瘤间质的侵袭特性可随着上皮癌变而同步激活,CAFs参与肿瘤细胞外基质的重建,与肿瘤侵袭转移有关。     

黏着斑激酶和肾上腺髓质素在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义

目的:探讨上皮性卵巢癌中黏着斑激酶(FAK)和肾上腺髓质素(ADM)蛋白表达的临床意义及两者之间的相互关系。方法:采用免疫组化染色检测FAK、ADM在10例正常卵巢组织、10例良性卵巢肿瘤及50例上皮性卵巢癌组织中的蛋白表达。结果:FAK和ADM在卵巢癌组织中的表达明显高于正常及良性卵巢组织(P<0.01),正常和良性卵巢肿瘤组织中两者表达无显著性差异(P>0.05)。FAK表达与病理学分级、临床分期、淋巴结转移及不良预后明显相关(P<0.05),而与年龄、组织学类型无关(P>0.05);ADM表达与病理分级、淋巴结转移及预后明显相关(P<0.05),而与年龄、临床分期、组织学类型无关(P>0.05);FAK和ADM的表达呈Spearman等级相关(r=0.314)。结论:FAK和ADM在卵巢癌组织中的表达明显高于正常及良性卵巢肿瘤组织,FAK可能促进ADM的表达,共同促进卵巢癌的浸润和转移,它们可作为判断卵巢癌恶性程度及评估不良预后的重要指标。     

肿瘤相关成纤维细胞对胆囊癌细胞生长和侵袭的影响

目的研究人胆囊癌相关成纤维细胞（CAFs）的培养方法及其对胆囊癌细胞生物学行为的影响,探讨CAFs在胆囊癌发生
发展中的作用。方法采用酶消化法及组织块法进行人胆囊癌CAFs的原代培养,采用差速贴壁法进行纯化,免疫细胞化学及细
胞免疫荧光进行鉴定;噻唑蓝（MTT）法检测CAFs对胆囊癌细胞增殖能力的影响,Transwell小室法检测CAFs对癌细胞侵袭能
力的影响。结果酶消化法及组织块法均可获得人胆囊癌CAFs,以酶消化法更为简便、高效;MTT及Transwell侵袭实验证实
CAFs可促进胆囊癌细胞的增殖、侵袭能力（P<0.05）,差距具有统计学意义。结论通过酶消化法可较为简便地获得人胆囊癌
CAFs,CAFs可显著增强胆囊癌细胞增殖、侵袭能力,表明其在胆囊癌发生、发展中起重要作用。
     

基质金属蛋白酶-2及其组织抑制因子表达失衡与卵巢上皮性肿瘤血管生成的关系

目的探讨基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶组织抑制物-2(TIMP-2)在卵巢上皮性肿瘤血管生成中的作用及临床意义。方法应用免疫组化SABC法检测20例卵巢良性上皮性肿瘤组织、20例卵巢交界性上皮性肿瘤组织、50例卵巢上皮性癌组织中MMP-2及TIMP-2的表达及微血管密度(MVD)。结果MMP-2阳性表达组的MVD值明显高于阴性表达组的MVD值(P=0.000),卵巢肿瘤组织中MMP-2的表达水平与TIMP-2的表达呈负相关。结论MMP-2和TIMP-2表达失衡可能在卵巢上皮性肿瘤血管生成中起重要作用,检测MMP-2和TIMP-2的表达可作为反映卵巢癌侵袭和转移潜能的生物学指标。     

活化白细胞黏附分子在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其临床意义

目的 探讨活化白细胞黏附分子(ALCAM)在卵巢良性、交界性和恶性上皮性肿瘤中的表达及其与卵巢癌的临床病理特征的关系,与癌抗原125(CA125)在卵巢肿瘤中的表达水平的相关性.方法 采用免疫组织化学EnVision两步法观察68例卵巢上皮性肿瘤组织中ALCAM、CA125在细胞膜或细胞质中出现染色颗粒的强度,判断其在...     

上皮性卵巢癌组织中COX-2表达及塞来昔布对卵巢癌细胞株生长抑制作用的研究

目的：探讨环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）在上皮性卵巢癌中的表达及其选择性抑制剂塞来昔布对卵巢癌细胞株生长的影响.方法：应用免疫组化的方法检测正常卵巢、卵巢良性肿瘤、上皮性卵巢癌组织及卵巢癌细胞株0VCAR3、SKOV3中COX-2的表达,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）快速比色法、吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色结合荧光显微镜等技术,研究塞来昔布对0VCAR3细胞增殖和凋亡的影响.结果：COX-2在上皮性卵巢癌组织中高表达,阳性率为71.1%,而在正常卵巢和良性卵巢肿瘤中未见表达.COX-2在上皮性卵巢癌组织中的表达与临床分期、组织学类型、组织学分级无关（P＞0.05）,而与淋巴结转移有关（P＜0.05）.塞来昔布可抑制OVCAR3、SKOV3细胞生长,呈浓度和时间依赖性,S-N-K分析及最小显著差（LSD）检验组间两两比较,P均＜0.05.荧光显微镜下见典型的凋亡形态学改变,凋亡比例呈剂量和时间依赖,S-N-K分析组间两两比较,P均＜0.05.结论：上皮性卵巢癌组织及细胞株0VCAR3、SKOV3中存在COX-2表达,塞来昔布可抑制卵巢癌细胞增殖,并诱导细胞凋亡,塞来昔布可能成为卵巢癌化疗的有效药物.     

人卵巢癌微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的建立人卵巢癌微血管内皮细胞（ovarian carcinoma-derived microvascular endothelial cells,ODMECs）体外培养体系。方法采用胶原酶、胰酶联合消化法分离微血管内皮,经pereoll梯度密度离心纯化。光镜、电镜、流式细胞术、免疫细胞化学对所获得的ODMECs进行鉴定。结果所获0DMECs流式分析有内皮标志物CD34／VEGF—R2表达;免疫荧光FⅧ一RAg阳性;电镜下见细胞多核、有丰富的微丝、weibel—Palade小体等;培养中的内皮细胞生长状态良好、呈现典型的铺路石征,可传代培养。结论本研究建立了人0DMECs体外培养体系,对了解卵巢癌血管内皮的异质性有重要价值,为抗卵巢癌血管生成的研究奠定了基础。