人皮肤瘢痕成纤维细胞原代培养及其生长曲线的研究

目的 建立可靠的人皮肤瘢痕成纤维细胞培养方法,探索细胞的生长规律,为皮肤瘢痕体外研究提供平台.方法 采用组织块贴壁法原代培养瘢痕成纤维细胞,波形蛋白免疫细胞化学法鉴定成纤维细胞,CCK-8测定细胞生长曲线.结果 人皮肤瘢痕原代成纤维细胞培养成功,细胞形态为长梭形,波形蛋白表达阳性,16～18天可传第1代,以后每7～8天可传1代,传代后5～6天时为活跃期,第7天进入停滞期.结论 培养出的人皮肤瘢痕成纤维细胞在传代后第5～6天最适于于体外实验研究.     

兔Tenon’s囊组织原代成纤维细胞分离培养与鉴定

目的:改良和补充兔Tenon’s囊组织原代成纤维细胞的分离培养、鉴定方法,为开展抗青光眼术后滤过泡瘢痕化的药物研究提供成熟的原代成纤维细胞。方法:应用组织块培养法,无菌条件下摘取组织,机械剪碎,于含10%胎牛血清的DMEM中培养,显微镜下观察细胞形态,免疫荧光法鉴定,实时荧光定量PCR法检测细胞波形蛋白、角蛋白的mRNA水平。结果:分离培养的细胞具有成纤维细胞形态,7-10d从组织块周围大量爬出,15d铺满培养皿;免疫荧光法鉴定显示,波形蛋白表达阳性,角蛋白阴性表达;实时荧光定量PCR检测出细胞中波形蛋白mRNA水平远远高于角蛋白。结论:改良和补充了兔Tenons囊组织成纤维细胞原代培养与鉴定方法,为后续青光眼术后滤过泡抗瘢痕化的药物研究奠定基础。     

犬皮肤成纤维细胞的分离、培养及鉴定

目的 探索和建立适用于犬皮肤成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的技术方法.方法 采用组织贴块培养法和胰蛋白酶、胶原酶I联合消化法对犬皮肤成纤维细胞进行体外培养、传代.并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养细胞行波形蛋白免疫荧光染色.结果 倒置相差显微镜下可见长梭形细胞生长,苏木素-伊红染色可见细胞呈漩涡状、平行排列,第5代细胞免疫荧光检测波形蛋白(vimentin)表达阳性.结论 建立了高效快速分离和稳定培养成纤维细胞的方法,为诱导犬心房纤维化提供了充足的种子细胞.     

人肝癌组织伴生成纤维细胞的体外培养及其生物学性状的初步探讨

目的:体外培养人肝癌组织伴生成纤维细胞,观察其生长状态,为进一步研究其功能奠定基础。方法:应用组织块培养法进行人肝癌伴生成纤维细胞的原代培养,细胞铺满培养瓶底后首次传代,通过胰酶消化法和反复贴壁法进行成纤维细胞的纯化;通过倒置显微镜观察细胞形态、免疫组织化学方法检测细胞膜波形蛋白(v im entin)、角蛋白(keratin)表达情况,对细胞进行鉴定。结果:组织块法原代培养约1周可见纤维样细胞从组织块周围游出,5周左右细胞基本长满培养瓶底。首次传代时应用胰酶消化法进行成纤维细胞的初次纯化,第2次转种时先后应用酶消化法和反复贴壁法再次进行细胞纯化,第3代以后基本可获得呈典型克隆性生长、长梭形纤维样细胞,生长周期短。免疫组化染色结果为v im entin染色阳性,keratin染色阴性。结论:在体外成功培养了人肝癌组织伴生成纤维细胞,并对其生物学性状进行了初步探讨,为进一步研究其与肝癌细胞生长、浸润及转移的关系等机制奠定了基础。     

百草枯对人胚肺成纤维细胞CTGF表达的影响

目的：探讨百草枯中毒对人胚肺成纤维细胞表达结缔组织生长因子（CTGF）的影响,进一步阐明百草枯致中毒性肺纤维化的发病机理。方法：体外培养人胚肺成纤维细胞（MRC-5）,通过ELISA法检测经过百草枯处理后的细胞CTGF的表达情况。结果：正常MRC-5细胞分泌少量CTGF ,经过不同浓度百草枯处理后的人胚肺成纤维细胞48～72h细胞CTGF浓度随时间变化而明显增加（P＜0．05）,在72h CTGF浓度有大幅度的提高。结论：百草枯中毒后人胚肺成纤维细胞表达CTGF明显上调,明显高于正常细胞,提示在百草枯中毒后肺成纤维细胞CTGF表达增加,进而导致肺纤维化。     

肝X受体激动剂T0901317抑制TGF-β1诱导的人正常肺成纤维细胞纤维连接蛋白的表达

[摘要] 目的 探讨肝X受体激动剂T0901317对TGFβ1诱导的人正常肺成纤维细胞纤维连接蛋白（fibronectin, FN）表达的影响。方法 组织块贴壁法培养人正常肺成纤维细胞,波形蛋白和角蛋白免疫组织化学鉴定。T0901317及 TGF-β1刺激人正常肺成纤维细胞后,分别应用Westernblot 和激光共聚焦显微镜观察FN的表达。结果 成纤维细胞表达波形蛋白不表达角蛋白。Westernblot ,免疫荧光结果均显示正常肺成纤维细胞基态下表达较多的FN,TGF-β1可以诱导FN表达的进一步上调,而T0901317 5μg/mL时即可以抑制这种表达的上调。结论 肝X受体激动剂T0901317可以抑制TGF-β1诱导的体外人正常肺成纤维细胞FN表达的上调,可能具有潜在抗纤维化治疗作用。     

酶消化组织块法原代培养兔牙周膜细胞

目的建立用酶消化组织块培养兔牙周膜细胞的方法,为下一步的研究做好基础。方法取成年新西兰大白兔牙周膜组织,通过酶消化组织块法原代培养兔牙周膜细胞。取第4代免牙周膜细胞,免疫细胞化学法鉴定细胞组织来源。结果酶消化组织块法成功培养出兔牙周膜细胞,细胞形态呈梭形。免疫细胞化学鉴定波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,说明细胞为中胚层来源的牙周膜成纤维细胞。结论酶组织消化块法可以很好地进行兔牙周膜细胞体外培养,且此方法简单易行。     

阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导肾成纤维细胞表型活化的影响

目的 观察阿魏酸哌嗪对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导肾成纤维细胞表型活化的影响,探讨其抗肾间质纤维化的可能机制.方法 体外培养正常大鼠肾脏成纤维细胞(NRK-49F),利用MTT观察阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导细胞活力的影响;免疫细胞化学法观察阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达的影响;实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(real time RT-PCR)检测阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导细胞α-SMA及CTGF mRNA表达的作用,双抗体夹心ABC-ELISA法检测阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导细胞上清Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、纤维连接蛋白(FN)表达的影响.结果 TGF-β1可以显著增加大鼠肾脏成纤维细胞活力,上调细胞α-SMA、CTGF蛋白和mRNA的表达以及Col Ⅰ、FN的表达.与TGF-β1刺激组相比,阿魏酸哌嗪能部分抑制TGF-β1诱导的细胞活力增加、α-SMA、CTGF的表达和细胞外基质(ECM)的合成.结论 阿魏酸哌嗪可以在一定程度上拮抗TGF-β1诱导的肾纤维化效应.     

槟榔提取物体外诱导人口腔黏膜成纤维细胞增殖模型的建立

目的为研究口腔黏膜下纤维化的修复机制,建立体外人口腔黏膜成纤维细胞增殖模型。方法体外培养口腔黏膜成纤维细胞,并用波形蛋白、角蛋白免疫细胞化学方法鉴定;分别用0、5、50、100、150、200μg/mL浓度的槟榔提取液对培养的成纤维细胞诱导,MTT法检测细胞增殖。结果波形蛋白表达阳性,而角蛋白表达阴性;50、100μg/mL槟榔提取物促进口腔黏膜成纤维细胞增殖。结论培养的细胞为纯化的成纤维细胞,槟榔提取物诱导口腔黏膜成纤维细胞增殖的最佳浓度为50～100μg/mL。该模型可为进一步的研究提供实验基础。     

甲床细胞体外培养的实验研究

目的探讨甲床上皮细胞及成纤维细胞体外培养的可行性。方法取20周以上引产胎儿的甲床,采用组织块培养法进行原代培养获得甲床上皮细胞和成纤维细胞,观察细胞形态,进行HE染色,免疫组织化学染色对细胞进行鉴定,甲床上皮细胞检测皮肤型角蛋白17,成纤维细胞检测波形蛋白。结果甲床上皮细胞培养2～3 d从组织块中游出,并在组织块周围形成生长晕,13 d左右细胞生长密度可达瓶底的70%～80%,扁圆形细胞,呈铺路石样排列。70%以上特异性角蛋白17抗体染色阳性,证明培养的细胞为甲床上皮细胞;甲床成纤维细胞培养3 d观察可见组织块周围有许多生长的细胞,细胞呈现圆或长梭形、等成纤维细胞的特征,胞体丰富,胞质均匀,细胞核清晰可见,11 d左右细胞生长密度可达瓶底的70%～80%。培养甲床成纤维细胞抗波形蛋白抗体染色阳性,说明培养的细胞为成纤维细胞。结论通过组织块法成功培养出甲床上皮细胞及成纤维细胞,为组织工程甲床的深入研究奠定了基础。     

人牙龈成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的：分离培养人牙龈成纤维细胞,为进一步研究细胞因子对牙龈成纤维细胞的调控作用提供实验条件。方法：用组织块法培养人牙龈成纤维细胞,并进行形态学和免疫学鉴定。结果：牙龈成纤维细胞原代培养成功并稳定传代,细胞呈长梭形或星形,免疫学鉴定抗波形丝蛋白抗体阳性,抗角蛋白抗体阴性,为中胚层来源的成纤维细胞。结论：组织块法培养的细胞符合牙龈成纤维细胞的形态学和免疫学特征,可作为体外细胞模型,为研究细胞因子对其功能的调控作用奠定基础。     

新生大鼠成纤维细胞原代培养

目的探讨新生sD大鼠成纤维细胞的培养方法。方法采用胰酶消化法和组织块贴壁法原代培养成纤堆细胞。采用HE染色及波形蛋白（Vimentin）免疫细胞化学染色对培养细胞进行鉴定。结果两种方法均能培养出成纤维细胞,其中酶消化法一次性可获得较多细胞,但细胞状态较差,贴壁慢,生长慢;组织块贴壁法短时间内可长出大量成纤维细胞,一周即可传代。HE染色后倒置相差显微镜下观察细胞形态典型,免疫细胞化学染色结果显示Vimentin呈阳性反应。结论组织块贴壁培养法是获取成纤维细胞简单,可行,快速的方法。     

改良人牙龈上皮细胞原代培养方法

目的：建立稳定的人牙龈上皮细胞的原代培养方法,为牙周组织的细胞学研究提供可靠的细胞来源,对原有的原代培养方法进行了改良,期望达到培养成功率高、原代培养时间短且操作简便的效果。方法： 选择行“冠延长术”的牙周相对健康者9人,取冠延长术切除的领圈牙龈组织进行牙龈上皮细胞的原代培养,培养方法包括改良酶消化法和组织块法。改良酶消化法使用2.5 g/L DispaseⅡ酶（Ⅱ型分离酶）浸泡组织块过夜,将上皮与结缔组织分离,再用0.025%（质量分数）不含EDTA（乙二胺四乙酸）的胰蛋白酶静置消化上皮碎片10 min,不弃去上皮碎片直接离心并重悬细胞,不仅降低了酶的消化浓度,减少了消化时间,还简化了重悬细胞的过程;组织块法相对以往方法并无改良。观察两种方法所培养原代细胞的生长过程,在培养成功后对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定,并比较两种方法的成功率和培养时间。结果： 改良后的酶消化法能够比较快地培养出细胞特征明确的人牙龈上皮细胞,成功率达88.9%,且细胞成片状生长,10~14 d后可传代,传至3代后细胞形态逐渐不规则直至凋亡,而组织块法原代培养成功率虽然相同,但时间更长,17~22 d后才可传代。经免疫细胞化学染色,角蛋白染色阳性。结论： 改良酶消化法能够快速培养出原代人牙龈上皮细胞并传代,可作为细胞学研究的稳定细胞来源。     

Connective Tissue Growth Factor Expression in Rabbit Corneal Fibroblast and Its Effect on Fibroblast Proliferation In Vitro

Connective tissue growth factor (CTGF) takespart in chemotactic,mitogenic,cell matrix inducingevents and scar formation.CTGF can activate andregulate the process that concerns with wound repairand regeneration.Itcan promote fibroblastprolifera-tion and extracellular matrix synthesis and secretion,stimulate vascular endothelial cell regeneration andneovascularization.CTGF is involved in many patho-genesis,such as dermatosclerosis,breasttumor infil-tration and metastasis,proliferating nephri…     

人子宫内膜异位症源性成纤维细胞的培养与鉴定

目的 建立人子宫内膜异位症源性成纤维细胞(HEFC)的体外培养细胞模型.方法 采用Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅳ型胶原酶联合消化法从人卵巢子宫内膜异位症囊肿中分离成纤维细胞,经密度离心和差速贴壁法纯化细胞.光镜和免疫细胞化学染色法对所获得的HEFC进行鉴定.结果 所获得的HEFC在免疫细胞化学染色分析中有成纤维细胞的标志物波形蛋白的强烈表达,肌纤维母细胞的标志物α-SMA偶尔表达,上皮细胞的标志物角蛋白无表达;培养中的成纤维细胞生长状态良好,呈现中等长度的较宽的梭形、三角形、星形和多角形;可良好的传代培养.结论 本研究建立了较理想的人HEFC体外培养体系,对了解人子宫内膜异位症源性成纤维细胞的异质性有重要价值,为从分子水平上研究人子宫内膜异位症中纤维化及纤维粘连的病理发生机制提供了充足、可靠的靶细胞.

Abstract：

Objective To establish the model of cultivating and identifying fibroblast from human endometriosis(HEFC)in vitro.Methods The tissues of human endometriotic cysts of ovary were digested by collagenases Ⅰ, Ⅱ and Ⅳ The resulting cells were purified by centrifugation and differential adhesion.HEFC was identified by observing the morphologic changes under an inverted microscope and the expressions of vimentin,α-SMA(α-smooth muscle actin)and keratin were detected by immunocytochemistry.Results Immunohistochemical staining of vimentin Was positive.α-SMA rarely positive and keratin completely negative in cultured fibroblasts.HEFC grew as a confluent monolayer of short fat fusiform,triangular,starshaped and polygonal fiber-like cells.Furthermore HEFC could be well sub-cultured.Conclusion Acquired fibroblast can be cultured in vitro stably.It iS quite important to Study the specificities of HEFC.Sufficient and reliable target cells may be obtained for studying the mechanisms of fibrosis and adhesion in endometriosis at the molecular level.     

新生豚鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记

目的 从新生豚鼠海马中分离培养神经干细胞，为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。方法 分离新生豚鼠海马组织，用含碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）无血清培养技术培养神经干细胞，免疫组化技术检测其巢蛋白（Nestin）的表达。采用荧光染料DAPI标记神经干细胞。结果 从新生豚鼠海马组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团，并能表达Nestin；荧光染料的标记效率可达93．4％，细胞传代8次后荧光亮度仍无明显衰减。结论 从新生豚鼠海马分离的细胞具有明显的增殖能力，荧光染料的标记可获得较高的标记效率，可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。     

人和大鼠胸主动脉成纤维细胞的原代培养

目的培养成纤维细胞,建立不同种属来源的胸主动脉成纤维细胞的培养方法并比较其形态差异。方法用消化法和贴壁法分离不同来源的成纤维细胞,利用差速培养法纯化成纤维细胞,并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养细胞行波形蛋白免疫染色鉴定。结果接种24h后细胞全部贴壁,48h后人胸主动脉成纤维细胞体积增大并伸出伪足,形状以梭形或不规则形为主;而大鼠胸主动脉的成纤维细胞生长的相对较慢。结论用Ⅰ型胶原消化动脉的成纤维细胞效果较好,用差速生长纯化的成纤维细胞可用于实验研究。     

骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞的初步研究

目的观察兔骨髓间充质干细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法抽取兔骨髓组织,梯度离心后,保留贴壁细胞传代,稳定传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的诱导培养液,通过倒置显微镜观察,碱性磷酸酶染色,骨连接素、骨桥素免疫细胞化学染色等方法进行观测。结果原代兔骨髓间充质干细胞7～8d左右即可长满,并可稳定传代,传代细胞5～6d即可传代。诱导培养细胞碱性磷酸酶染色,骨连接素、骨桥素免疫细胞化学染色阳性。结论兔骨髓间充质干细胞经合理的体外诱导培养后,符合成骨细胞的形态特征和生物学特性,可为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞。