牙周膜干细胞BMP-2-PSH复合膜修复新西兰兔牙槽骨缺损

  目的  拟构建新西兰兔牙周缺损模型，确定hPDLSCs-BMP-2-PSH膜的生物安全性和其体内成骨修复作用。  方法  在确定BMP-2-PSH膜没有细胞毒性后将培养好的hPDLSCs细胞膜片复合至BMP-2-PSH膜上。分别在每只新西兰兔下颌左中切牙牙槽骨缺损内植入hPDLSCs/PSH复合膜作为实验组，右中切牙牙槽骨缺损内植入对照性多孔纤维膜材料作为对照组（或不植入任何材料作为对照），然后全瓣复位，缝合。术后即刻和每3周（连续观察12周）进行影像学（CT）检查，观察骨缺损愈合情况；同时，分别在术后第4、8、12周观察PDLSCs/BMP-2双膜材料的吸收度和各组样本新骨形成量和新骨形态。  结果  不同浓度PSH膜和BMP-2-PSH膜浸提液对hPDLSCs细胞不具有细胞毒性，hPDLSCs细胞能够成功复合到BMP-2-PSH膜上；CBCT及组织形态学分析显示，hPDLSCs/PSH复合膜能够有效促进牙槽骨缺损修复再生。  结论  hPDLSCs/PSH复合膜具有良好生物安全性，有利于修复新西兰兔牙周缺损。     

PRP复合纳米羟基磷灰石对兔牙槽骨缺损的修复作用

目的 研究富血小板血浆(PRP)复合纳米羟基磷灰石(nano-HA)对兔牙槽骨缺损的修复作用.方法 健康新西兰大白兔20只,采用自身对照方法,在每只动物两组下颌骨体部分别作牙槽骨缺损区,左组为实验组,填充PRP与nano-HA复合物;右组为对照组,填充nano-HA.分别于术后2、4、8、12周处死,通过X线片、组织学染色观察兔两组牙槽骨愈合情况,并进行计算机图像分析,测量其新生骨面积.结果 术后2、4、8周,实验组新生骨面积高于对照组(P<0.05),在第12周时,实验组与对照组新生骨面积无统计学意义(P>0.05).结论 nano-HA与PRP的复合材料能促进兔牙槽骨缺损的修复,是一种很有前途的牙槽骨移植替代材料.     

PRP/纳米羟基磷灰石对兔牙槽骨缺损的修复作用

目的 研究富血小板血浆（PRP）复合纳米羟基磷灰石（nano-HA）对兔牙槽骨缺损的修复作用。方法 健康新西兰大白兔20只,采用自身对照方法,在每只动物两组下颌骨体部分别作牙槽骨缺损区,左组为实验组,填充PRP与nano-HA复合物;右组为对照组,填充nano-HA。分别于术后2、4、8、12周处死,通过X线片、组织学染色观察兔两组牙槽骨愈合情况,并进行计算机图像分析,测量其新生骨面积。结果 术后2、4、8周,实验组新生骨面积高于对照组（Ρ<0.05）,在第12周时,实验组与对照组新生骨面积无统计学意义（Ρ>0.05）。结论nano-HA与PRP的复合材料能促进兔牙槽骨缺损的修复,是一种很有前途的牙槽骨移植替代材料。     

颌骨骨髓基质细胞对牙周膜细胞生物学特性的影响

目的观察间接共培养犬颌骨骨髓基质细胞(canine maxillary bone marrow stromal cells, cM-BMSCs)对犬牙周膜细胞(canine periodontal ligament cells, cPDLCs)生物学特性的影响。方法 原代培养犬颌骨骨髓基质细胞和犬牙周膜细胞。MTT法检测犬牙周膜细胞增殖速率;利用Transwell结构建立犬颌骨骨髓基质细胞与犬牙周膜细胞共培养体系;qPCR法检测犬牙周膜细胞矿化相关基因核心结合因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)的变化;Western印迹法检测Runx2和OCN蛋白的表达变化。构建牙片/细胞膜片复合体植入裸鼠皮下。结果 两种细胞体外均贴壁生长,呈纺锤状外形;颌骨骨髓基质细胞间接共培养下对牙周膜细胞增殖有抑制作用;共培养组牙周膜细胞ALP活性高于对照组;qPCR和Western印迹法均能检测到牙周膜细胞Runx2、OCN的表达,共培养组牙周膜细胞的Runx2和OCN的表达均高于对照组。经过颌骨骨髓基质细胞条件培养液诱导后的牙周膜细胞与牙本质片复合形成了排列更加有序的牙周膜/牙骨质样结构,单纯的牙周膜细胞膜片不能新生类似的牙周组织复合结构。结论犬颌骨骨髓基质细胞间接共培养情况下可能会限制牙周膜细胞的增殖,促进牙周膜细胞向成骨样细胞分化。     

基因芯片筛选人牙周膜干细胞成骨分化生物学标记物的研究

目的：发现牙周膜干细胞（PDLSCs）骨向分化后显著高表达的环状RNA（circRNA）,探索circRNA在PDLSCs骨向分化中生物学标记物的作用。方法用酶消化法体外培养牙周膜细胞,通过免疫磁珠法分选出PDLSCs。用普通培养基和成骨诱导培养基分别培养PDLSCs 21 d,茜素红染色检测矿化结节的形成,RT－qPCR检测碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）和Runt相关转录因子2（Runx2）的表达。采用Arraystar公司的circRNA芯片检测PDLSCs骨向分化前后整体circRNAs的差异表达,将芯片中上调变化最显著的前10位circRNAs进行PCR引物设计,RT－qPCR检测circRNA的表达情况。结果 PDLSCs骨向诱导21 d后,茜素红染色阳性,有大量矿化结节形成,ALP、OCN和Runx2表达量明显升高。 Hsa＿circ＿0008433在PDLSCs骨向诱导21 d后显著高表达。结论Hsa＿circ＿0008433将来可能是PDLSCs骨向分化新的生物学标记物。     

犬脂肪干细胞膜片的构建及其复合富血小板纤维蛋白后的成骨能力

目的 初步研究犬脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSCs)膜片的构建及其生物学特性对膜片复合富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)后成骨能力的影响.方法 取犬腹股沟处的脂肪进行消化,分离培养成脂肪干细胞进行相关检测.将P3代细胞加入含抗坏血酸的成膜培养液培养2周以上,构建脂肪干细胞膜片,采用HE染色及扫描电镜对膜片进行形态学检测.提取静脉血PRF,分为细胞膜片复合PRF的实验组和膜片对照组,2组分别成骨诱导后进行ALP染色和茜素红染色,并于诱导后第3、5天,采用RT-PCR检测成骨相关基因ALP、Runx2的表达.结果 体外分离培养脂肪干细胞,成功构建干细胞膜片.光镜下可见细胞极性排列紧密,细胞外基质分泌.扫描电镜可见膜片表面光滑,细胞紧密排列.HE染色可见蓝染细胞紧密相连,细胞外大量基质.成骨诱导后,ADSCs膜片复合PRF的实验组ALP表达及茜素红染色钙结节形成量明显优于ADSCs膜片对照组,实验组ALP、Runx2基因mRNA表达高于对照组.结论 成功构建犬脂肪干细胞膜片,膜片复合PRF后具有更强的成骨能力.     

氧化铝羟基磷灰石复合陶瓷修复兔桡骨节段性缺损的影像学观察

目的 评价放电等离子烧结技术制备的氧化铝羟基磷灰石复合陶瓷修复兔桡骨节段性缺损的效果.方法 选新西兰白兔15只,制作10mm长的桡骨节段性缺损模型,分为实验组:15个肢体,骨缺损区植入氧化铝羟基磷灰石复合陶瓷人工骨材料;空白对照组:6个肢体,骨缺损区旷置;自体骨对照组:6个肢体,骨缺损区植入自体骨.术后1d,8、16、24周分别进行X线摄片观察,运用ImageTool图像处理软件,进行点像素测定,24周进行扫描电镜观察.结果 实验组:氧化铝羟基磷灰石复合陶瓷人工骨植入兔桡骨缺损区8周即有新生骨形成,24周材料与骨组织连接在一起,缺损区得以修复.空白组:8周时缺损区有少量骨痂,24周时修复缺损区约1/2;自体骨植人组:8周时骨断端完全被骨痂包绕,24周时缺损区骨完全修复.像素测量结果显示三组间骨修复速度差异无统计学意义(P>0.05);重复测量资料的方差分析P=0.007,说明随着时间的延长骨组织密度增加.实验组材料两端修复界面新生骨与皮质骨的X射线摄片像素值进行比较:术后1d,8、16周P<0.05,24周P>0.05.说明术后24周前材料两端界面在不断修复,24周时完全修复.扫描电镜摄片示:实验组兔植入材料被新骨组织环形包绕与骨组织镶嵌,皮质骨与界面骨之间形成骨髓腔;在材料表面凹陷中骨细胞环状排列形成骨单位.结论 证实采用放电等离子烧结技术制备的氧化铝羟基磷灰石复合陶瓷材料能够修复新西兰兔桡骨节段性缺损,具有良好的生物活性和骨传导性.     

异种骨复合自体骨髓基质干细胞修复节段性骨缺损

目的探讨异种骨复合骨髓基质干细胞(MSCs)修复节段性骨缺损的可行性。方法将MSCs与异种松质骨在体外联合培养,兔桡骨中上段制成1.5 cm的骨-骨膜缺损模型,实验组植入复合异种骨,对照组植入单纯异种骨,空白对照组不植入任何材料,分别于术后4、8、12周各时间点行标本的组织学观察、X线片观察、透射电镜观察及骨密度测试,比较其骨缺损区骨修复情况。结果术后第12周,实验组骨缺损区完全修复,骨密度接近正常;对照组骨缺损区修复缓慢,新骨形成量少;空白对照组骨缺损区未修复。结论异种骨复合MSCs修复节段性骨缺损能力强,在成骨速度和量上明显优于单纯异种骨。     

Purmorphamine promotes osteogenic differentiation in human periodontal ligament stem cells under dynamic tensile

目的 研究purmorphamine在动态张应力促人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,PDLSCs)向成骨细胞分化过程中的作用.方法 分离培养鉴定PDLSCs,在矿化诱导环境中加入purmorphamine,采用Flexcell FX4000T应力加载系统对细胞加力24 h,以Red-time PCR检测成骨相关指标Runx2、alkaline phosphatase(ALP)以及Hedgehog(Hh)通路的标志物GLI1、Pathed1( PTCH1)、Smoothend(SMO).结果 动态张应力作用24 h后,成骨相关指标Runx2、ALP,Hh通路的标志物GHI1、PTCH1、SMO的表达水平明显升高(P＜0.05);加入purmorphamine后,成骨相关指标Runx2、ALP,Hh通路的标志物GLI1、PTCH1、SMO的表达水平较加力组均有增强,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 purmorphamine可能通过激活Hh通路,进而增强人PDLSCs应力条件下向成骨细胞分化.     

Sirt1促进炎症牙周膜干细胞成骨分化的机制

目的 探讨去乙酰化酶1(Sirt1)对炎症牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨分化的作用，并研究其可能的分子机制。方法 分离、培养正常及炎症PDLSCs,观察Sirt1在两种细胞中的表达；将炎症PDLSCs进行成骨诱导，同时使用Sirt1激动剂白芦藜醇上调炎症PDLSCs中的Sirt1,观察炎症PDLSCs的成骨分化情况，Western blot检测Runx2、乙酰化NF-κB、乙酰化FoxO1和FoxO1的表达。结果 炎症PDLSCs中Sirt1的表达较正常PDLSCs减少(P<0.01);白芦藜醇可上调炎症PDLSCs中Sirt1的表达；与成骨诱导组比较，成骨诱导+白芦藜醇组炎症PDLSCs中BSP(t=14.045,P<0.01)、Runx2(t=3.349,P<0.01)、OCN(t=7.218,P<0.01)和Osx (t=4.544,P<0.01)mRNA的表达增加，ALP染色增强(P<0.01);炎症PDLSCs成骨诱导后FoxO1(t=8.737,P<0.01)和Runx2(t=6.152,P<0.01)的表达增强；使用白芦藜...     

purmorphamine促进人牙周膜干细胞应力成骨

目的研究purmorphamine在动态张应力促人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,PDLSCs)向成骨细胞分化过程中的作用。方法分离培养鉴定PDLSCs,在矿化诱导环境中加入purmorphamine,采用Flexcell FX-4000T应力加载系统对细胞加力24 h,以Real-time PCR检测成骨相关指标Runx2、alkaline phosphatase(ALP)以及Hedgehog(Hh)通路的标志物GLI1、Pathed1(PTCH1)、Smoothend(SMO)。结果动态张应力作用24 h后,成骨相关指标Runx2、ALP,Hh通路的标志物GLI1、PTCH1、SMO的表达水平明显升高(P<0.05);加入purmorphamine后,成骨相关指标Runx2、ALP,Hh通路的标志物GLI1、PTCH1、SMO的表达水平较加力组均有增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 purmor-phamine可能通过激活Hh通路,进而增强人PDLSCs应力条件下向成骨细胞分化。     

双相磷酸钙作用下牙周组织缺损再生的Beagle犬正畸牙移动的骨改建功能

目的：观察应用双相磷酸钙（BCP）对Beagle犬牙周组织缺损进行再生后正畸牙移动的过程,阐明BCP作为牙周再生支架材料的改建机制。方法：选择6只成年雄性Beagle犬作为研究对象,以每只犬口内右上象限（B区）、左下象限（C区）为对照组,左上象限（A区）和右下象限（D区）建立犬上下颌双侧侧切牙牙周组织缺损模型,于缺损处植入BCP进行缺损组织再生12周后,建立正畸牙移动模型（实验组）,分别对实验组和对照组施加应力刺激,并于加力后1、2和4周随机处死2只Beagle犬,标本处理染色后观察应力作用下再生牙周组织的组织学变化及调控成骨活动核心结合因子α1（Cbfα1）的表达情况,观察受应力作用的正常牙周组织内的情况。结果： Masson染色检测,施加正畸压应力刺激后1周,实验组和对照组犬牙周膜均明显变窄,纤维致密,实验组犬牙槽骨以蓝染为主,对照组犬牙槽骨除牙周膜的受压区域外大体呈红色。在施加正畸压应力刺激后4周,实验组犬牙槽骨红-蓝相间,对照组犬牙槽骨红染;2组犬牙周膜内血管管腔变圆。施加正畸压应力刺激后1周,实验组和对照组犬牙槽骨表面布满骨吸收陷窝,内含多核的破骨细胞,其胞浆Cbfα1染色呈阳性;受压变形的牙周膜内细胞排列无序。施加正畸压应力刺激后4周,实验组犬牙槽骨破骨细胞消失,吸收陷窝被成骨细胞充填,骨小梁另一侧的成骨细胞也处于活跃状态,牙槽骨的骨髓腔内间充质细胞和边缘的成骨细胞仍可见Cbfα1阳性表达;对照组犬牙槽骨中的成骨细胞为Cbfα1弱阳性表达。结论：应用BCP再生的牙周组织已接近正常牙周组织,其在正畸力作用下具备正常的成骨功能,可以完成正畸牙移动的骨改建过程。     

血小板胶-胶原复合膜修复大鼠牙周组织缺损的疗效观察

目的探讨血小板胶（APG）．胶原（co）复合膜对大鼠牙周组织缺损的修复作用。方法将co分别裁成5mm×2mm及7mmx4mm大小,抽取大鼠全血10rnl制作富血小板血浆（PRP）,再将5mm×2mmCo浸润于PRP中制备APG-Co复合膜。将16只成年雄性Wistar大鼠随机平均分为实验组和对照组,分别制作大鼠下颌牙周骨缺损模型（缺损大小为5mm×2mm,磨除牙根面牙骨质）。实验组置APG-Co复合膜于缺损内,并于缺损表面覆盖7mm×4mm的Co。对照组仅用7mm×4mmCo覆盖缺损表面。术后4、6周每组分别处死4只,HE染色观察牙周组织缺损修复效果,Image-ProPlus对术后6周HE染色结果进行分析,计算出新生牙周骨面积,应用SPSS13．0软件对新生牙周骨面积进行统计学分析。结果实验组新生牙槽骨和牙骨质样组织的生成量和成熟度均优于对照组,术后6周实验组新生牙周骨面积显著高于对照组[（56533．04±2673．61）傩（23006．05±2198．10）μm^2,P〈0．05]。结论APG-Co复合膜有显著的促进牙周骨组织缺损修复的作用。     

共表达骨保护素和碱性成纤维细胞生长因子的重组腺病毒对牙槽骨缺损修复的实验研究

目的以含有骨保护素(OPG)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的共表达重组腺病毒感染牙龈及牙周膜成纤维细胞,观察OPG与bFGF表达的情况;以重组腺病毒结合胶原膜置入犬牙槽骨缺损处,观察其对牙槽骨缺损修复的影响。方法培养牙龈及牙周膜成纤维细胞,感染重组腺病毒,运用Western blot、RT-PCR分别检测2种细胞中OPG及bFGF的表达,并以正常培养的牙龈及牙周膜成纤维细胞作为对照组。制造犬下颌前磨牙根分叉处牙槽骨缺损模型,右侧作为空白对照组(n=2)和材料对照组(n=4),左侧作为实验组(n=6),光镜观察骨缺损处牙槽骨新生情况,免疫组织化学方法检测OPG和bFGF在犬牙周组织中的表达。结果细胞培养结果显示,感染重组腺病毒的牙龈和牙周膜成纤维细胞,OPG及bFGF的表达在蛋白和基因水平上均明显高于正常对照组;动物实验结果显示,实验组骨缺损处有多量新生牙槽骨生长,其OPG和bFGF较材料对照组和空白对照组均有较强的表达。结论 OPG和bFGF共表达的重组腺病毒可提高牙龈及牙周膜成纤维细胞OPG和bFGF的表达,对牙槽骨缺损修复起促进作用。     

年龄因素对牙周膜干细胞增殖和分化能力的影响

目的 评估年龄因素对牙周膜干细胞(PDLSC)增殖、分化能力的影响.方法 选取来源于12位不同的患者因阻生需要拔除的第三磨牙12颗,根据患者年龄分为A组(年龄18～20岁)、B组(年龄45～50岁).分离培养获得PDLSC.MTT检测A、B组PDLSC增殖能力;进行成骨、成脂诱导,并用茜素红染色及油红O染色评价其分化能力;SA-βG染色分析A、B组细胞衰老情况;将A、B组PDLSC成骨诱导7d后进行ALP染色并同时采用Western blotting检测OCN、ALP的表达.结果 不同年龄阶段的供体中都能分离出PDLSC,然而其增殖和成骨分化能力随年龄增加而降低,成脂分化能力和SA-βG表达随年龄增加而增加.ALP和OCN成骨诱导7d后表达水平均升高,且A组高于B组.结论 随年龄增长能在牙周膜中获取PDLSC,随年龄增加其增殖与成骨分化能力下降,但成脂分化能力和SA-β表达则增加.     

p38 丝裂原活化蛋白激酶在炎症微环境作用下对牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的 探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在慢性牙周炎组织来源的牙周膜干细胞中的表达及其对炎症微环境作用下牙周膜干细胞成骨分化能力的影响。方法 2012年10月至2013年5月收集中国人民解放军总医院口腔科因治疗需要拔除的无龋前磨牙及慢性牙周炎牙齿,培养正常及炎症微环境下的牙周膜干细胞(H-PDLSCs,P-PDLSCs)。采用酶联免疫吸附试验及实时定量PCR检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β的分泌及基因表达量,免疫荧光检测p38在细胞内的表达,Western blot法检测两种细胞成骨诱导7 d后p38及磷酸化p38(p-p38)的表达。使用p38 MAPK特异性抑制剂SB-203580干扰后体外成骨诱导7 d,实时定量PCR检测细胞成骨关键基因Runx2和碱性磷酸酶(ALP)的基因表达水平,成骨诱导21 d后茜素红染色检测PDLSCs的矿化结节形成情况。结果 P-PDLSCs的TNF-α和IL-1β分泌量均显著高于 H-PDLSCs(68.80±6.70比34.10±3.07,P=0.001;57.10±4.23比26.90±2.58,P=0.000)。P-PDLSCs中TNF-α的基因表达水平较H-PDLSCs上升1.4倍(P=0.011),IL-1β的基因表达水平也上升1.7倍(P=0.009)。P-PDLSCs的p38表达量高于H-PDLSCs;成骨诱导后两种PDLSCs 中的p-p38表达均升高,但p38表达水平有所降低。SB-203580干扰后PDLSCs 的Runx2和ALP表达水平显著降低(H-PDLSCs:P=0.044、0.036;P-PDLSCs:P=0.017、0.004),矿化结节形成数量减少。结论 在慢性炎症微环境中,p38 MAPK参与细胞的炎性反应,抑制p38后炎症微环境作用下PDLSCs的成骨分化能力也被显著抑制。     

不同浓度雌激素对人源性牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的：对比研究不同浓度的雌激素对人源性牙周膜干细胞成骨分化的影响。方法：采用DMEM完全培养基将人牙周膜干细胞制成单细胞悬液,分别加入浓度为0、10×10^-10、10×10^-9、10×10^-8、10×10^-7、10×10^-6、10×10^-5mol/L的雌激素,以未加入雌激素的成骨诱导液组（普通DMEM培养基中加入10mMβ-甘油磷酸钠、50μM维生素C及10nM地塞米松）作为阴性对照。培养后实时定量PCR方法分别检测成骨早中晚期关键指标Runx2、ALP和OCN mRNA表达。结果：浓度为10×10^-10、10×10^-9、10×10^-8、10×10^-7、10×10^-6、10×10^-5mol/L的雌激素对人源性的牙周膜干细胞培养均无毒性;不同浓度组间差异无统计学意义（P＞0.05）;在成骨诱导7、14、21天时,Runx2、ALP及OCN mRNA表达在10×10^-7组最高（P＜0.05~0.01）。在不同浓度雌激素组中成骨相关基因的表达均高于阴性对照组（P＜0.05）。结论：当雌激素浓度＜10×10^-7mol/L时,雌激素能够以剂量依赖的方式促进人牙周膜干细胞成骨分化过程中成骨相关基因的表达。当雌激素浓度＞10×10^-7mol/L时,雌激素浓度的增加并未促进成骨相关基因的表达。     

Repair of sheep metatarsus defects by using tissue-engineering technique

Tissue-engineering bone with porous β-tricalcium phosphate (β-TCP) ceramic and autologous bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) was constructed and the effect of this composite on healing of segmental bone defects was investigated. 10-15 ml bone marrow aspirates were harvested from the iliac crest of sheep, and enriched for MSC by density gradient centrifugation over a Percoll cushion (1.073g/ml). After cultured and proliferated, tissue-engineering bones were constructed with these cells seeded onto porous β-TCP, and then the constructs were implanted in 8 sheep left metatarsus defect (25 mm in length) as experimental group. Porous β-TCP only were implanted to bridge same size and position defects in 8 sheep as control group, and 25 mm segmental bone defects of left metatarsus were left empty in 4 sheep as blank group. Sheep were sacrificed on the 6th, 12th, and 24th week postoperatively and the implants samples were examined by radiograph, histology, and biomechanical test. The 4 sheep in blank group were sacrificed on the 24th week postoperatively. The results showed that new bone tissues were observed either radiographic or histologically at the defects of experimental group as early as 6th week postoperatively, but not in control group, and osteoid tissue, woven bone and lamellar bone occurred earlier than in control group in which the bone defects were repaired in “creep substitution” way, because of the new bone formed in direct manner without progression through a cartilaginous intermediate. At the 24th week, radiographs and biomechanical test revealed an almost complete repair of the defect of experimental group, only partly in control group. The bone defects in blank group were non-healing at the 24th week. It was concluded that engineering bones constructed with porous β-TCP and autologous MSC were capable of repairing segmental bone defects in sheep metatarsus beyond “creep substitution” way and making it healed earlier. Porous β-TCP being constituted with autologous MSC may be a good option in healing critical segmental bone defects in clinical practice and provide insight for future clinical repair of segmental defect.