树鼩腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的通过建立树鼩腺病毒(tree shrew adenovirus,TAV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测树鼩腺病毒。方法根据TAV全基因组3’端保守序列设计合成特异性引物;用含目的基因片段的重组质粒作为标准品进行标准曲线绘制,建立TAV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的TAV实时荧光定量PCR检测方法特异性好,与树鼩源及其他物种常见病毒无交叉反应;方法的最低检测限度为每微升3.7拷贝,灵敏性强;相关检测系数R2为0.998,扩增效率为95.7%;扩增结果具有良好的线性关系,且重复性检测效果好。结论成功建立了TAV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,灵敏度高,重复性好,可用于TAV感染的早期快速检测。     

实验树鼩空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR方法的建立

目的为实验树鼩微生物检测提供一种快速、简便、灵敏,并且特异性强的空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR检测方法。方法根据空肠弯曲菌的Hip O区域、沙门菌的in V区域和志贺菌的ipa H区域设计特异性引物和探针,并进行单病原定量PCR检测验证;后分析多重PCR的灵敏度和特异性,并使用该多重PCR方法检测实验树鼩样品。结果本研究的PCR要素可用于空肠弯曲菌、沙门氏菌及志贺菌等单种菌的实时荧光定量PCR扩增。多重定量PCR扩增出了空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺氏菌标准扩增曲线;该方法的灵敏度为1×103ng/μL;特异性检测未从其他参考菌株中检出阳性。结论该多重定量PCR方法在实验树鼩微生物检测中具有很好的应用和推广前景。     

树鼩腺病毒（TAV）PCR方法的建立及初步应用

目的建立树鼩腺病毒(TAV)PCR检测方法,并进行初步应用。方法根据NCBI公布的TAV基因组序列,选择19418-19917区域人工合成一段DNA序列并转入质粒中,作为阳性标准质粒。设计1对特异性引物建立TAV PCR检测方法,考察其特异性和灵敏度。应用该PCR方法对60份树鼩血DNA及56份树鼩粪便DNA进行检测。结果所建立的PCR检测方法经特异性和灵敏度测定,最低可检测13.5 x10-7μg/m L,与其他腺病毒无交叉,特异性好,灵敏度较高。60份树鼩血DNA检测均为阴性,56份树鼩粪便DNA检测有24份阳性,通过测序证实树鼩粪便中TAV感染率为42.9%,与扩增结果一致。结论建立的树鼩腺病毒PCR检测方法特异性强,灵敏度高,可用于树鼩腺病毒的常规检测中。     

树鼩副粘病毒(TPMV)PCR方法的建立及初步应用

目的建立树鼩副粘病毒(Tupaia paramyxovirus,TPMV)PCR检测方法,并进行初步应用。方法根据NCBI公布的TPMV基因组序列,选择8231 bp~8720 bp区域人工合成一段DNA序列并转入质粒中,作为阳性标准质粒。根据TPMV保守区域设计一对特异性引物,考察方法的特异性和灵敏度,并应用于60份树鼩呼吸道咽拭子c DNA及12份树鼩肺组织c DNA的检测中。结果所建立的PCR检测方法特异性好,灵敏度高,可达11.5×10-5μg/m L。60份树鼩呼吸道咽拭子c DNA及12份树鼩肺组织c DNA检测均为阴性。结论建立的树鼩副粘病毒PCR检测方法特异性强,灵敏度高,可用于树鼩副粘病毒的常规检测中。     

一步法实时荧光定量PCR检测白血病WT1基因mRNA

目的 构建RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因mRNA表达的方法,准确定量检测白血病患者微小残留病,指导临床判断预后和早期预测复发.方法 从K562细胞提取的RNA用特异性引物扩增WT1基因,pMD18-T载体克隆法构建荧光定量PCR标准模板,建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测wTl基因方法,并对该方法的灵敏度、重复性和稳定性进行检测.结果 构建的RT-PCR一步法实时荧光定量PCR方法的灵敏度达10-4水平:以拷贝数为1.0x106～1.0×102 cps/ml的标准品,分别进行RT-PCR一步法实时荧光定量PCR扩增后,标准品的Ct值与该标准品模板起始浓度的对数存在线性关系,r值达0.998:管间和批间的变异系数均小于8%.结论 所建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因方法的灵敏度、重复性和特异性好;RT和PCR反应过程一步完成,更简便快捷,减少加样和污染机会,更适合临床检测.     

人类mdr1基因新型Taq Man-MGB探针实时定量PCR检测方法的建立

目的建立一种比现有方法敏感、特异性高、重复性好的实时荧光定量PCR检测的新方法检测人类mdr1基因。方法以含有目的基因mdr1cDNA的质粒pHaMDR1/A为阳性模板,用Primerexpress2.0引物设计软件设计引物和TaqMan-MGB探针,建立荧光定量PCR检测方法。结果当待扩增DNA浓度在3.601×103cps/ml～3.601×109cps/ml范围时,模板浓度与循环阈值(Ct)之间的相关性良好,相关系数r2大于0.98。结论应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测人类mdr1基因,具有灵敏度高、特异性高和精确度高等优点,可作为进一步研究人类mdr1基因的方法。     

实时荧光定量PCR检测沙眼衣原体的研究

目的 采用TaqMan探针建立检测沙眼衣原体的实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法.方法 根据沙眼衣原体外膜蛋白A的基因(ompA)序列设计引物和探针,以克隆的ompA部分基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量检测方法.结果 建立的荧光定量PCR检测方法的最低检出限为5 copies/反应,检测线性范围100107线性关系良好(r2=0.997),比巢式PCR敏感100倍;且与鹦鹉热衣原体、淋球菌、解脲脲原体、大肠杆菌等病原菌DNA以及人基因组DNA均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性.以巢式PCR作参比,建立的荧光定量PCR法检测沙眼衣原体的阳性符合率为100.00％,阴性符合率为95.09％,总符合率为96.81％.结论 建立的检测沙眼衣原体实时荧光定量PCR具有特异性强和敏感性高的特点,可快速检测样本中微量沙眼衣原体DNA,适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选.     

Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应标准品的制备及应用研究

目的:制备用于Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准品。方法:提取胚胎上颌突组织总RNA,行逆转录反应获得第一链的cDNA,再通过PCR回收获得预期Satb2基因片段;通过T-A克隆将该片段插入pGMT质粒载体;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。结果:重组质粒经PCR扩增及序列测定表明,pGMT/Satb2基因已成功克隆。结论:所构建的pGMT/Satb2基因实时荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此法可作为实时荧光定量PCR检测Satb2基因的标准方法。     

新型Taq Man-MGB探针实时荧光定量PCR检测人类mdr1基因

目的建立一种比现有方法敏感、准确性高、重复性好的人类mdr1基因的新型实时荧光定量PCR检测新方法。方法用Primer Express 2．0引物设计软件设计引物和MGB探针,以Taq Man-MGB探针技术为基础,运用Taq Man-MGB探针,以含有目的基因mdr1cDNA的质粒pHaMDR1／A为阳性模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果所建立方法的最低检测限度为15个基因拷贝／反应,在待扩增DNA浓度为3．061×103 cps／ml-3．061×109cps／ml范围时,模板浓度与循环阈值(Ct)之间的相关性良好,决定系数r2为0．988243。结论应用Taq Man-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测人类mdr1基因,具有灵敏度高、特异性高和精确性高等优点。     

耐甲氧西林葡萄球菌荧光定量PCR检测方法的实验研究

目的建立一种简便、特异的mecA基因荧光定量PCR检测方法,用于耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)的快速鉴定。方法以煮沸法快速制备DNA模板,采用SYBR GreenI随机参入法,建立mecA基因的实时荧光定量PCR检测体系。并对检测体系的敏感性、特异性和灵敏度进行评价。结果本法对纯菌落的检测敏感性和特异性分别为98.5%和96.9%,检测灵敏度可达101CFU/ml,最小检菌量约为3个菌/反应体系。结论本实验所设计的荧光定量PCR方法用于MRS的检测具有快捷、高敏感性、高特异性和高灵敏度的特点。适用于MRS的快速检测。     

CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

目的建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法。方法针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。对2008～2012年期间采集的1 344份临床标本中的CAR菌进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照。结果 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌间无交叉反应,检测灵敏度达2.7拷贝。标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.22,TaqMan MGB探针荧光定量PCR效率为104.432%。对1 344份标本进行检测,结果 TaqMan MGB探针荧光定量PCR检出510份CAR菌阳性样本。TaqMan MGB探针荧光定量PCR能够直接从标本中检出CAR菌DNA,检测时间仅为40 min。结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于CAR菌的快速检测。     

初治APL患者PMURARα融合基因表达

目的检测初治急性早幼粒细胞白血病（APL）患者PML／RARα融合基因异构体类型及表达水平,建立检测微小残留病的标准拷贝数基线。方法应用实时定量RT-PCR方法,采用Taqman探针技术测定32例APL初治患者骨髓标本的PML／RARα融合基因mRNA3种异构体表达水平,并比较异构体之间临床特征有无差异。结果32例PML/RARα融合基因阳性的APL初治患者中21例为PMI／RARa融合基因长型异构体,11例为融合基因短型异构体,初治患者融合基因表达量中住数为1．44％（1．29％±1．46％）。长型及短型异构体标准拷贝数（normalized copy number,NCN）中位数分别为1．40％（1．46％±1．18％）和1．28％（1．39％＋1．51％）,无明显统计学差异,P〈0．05,融合基因长型异构体患者在发病时外周血白细胞总数为6．08±13．21（×10^9／1）明显低短型患者15．11±20．26（×10^9／l）,P〈0．01。结论建立了检测APL微小残留病的高敏感性、高特异性的实时定量RT—PCR方法,对分析治疗过程的病情变化和指导治疗方案具有重要意见。     

实时荧光定量RT-PCR快速检测四种呼吸道病毒的研究

目的利用实时荧光定量RT-PCR建立快速检测人腺病毒(HADV)、人博卡病毒(HBoV)、人偏肺病毒(HMPV)、人呼吸道合胞病毒(HRSV)等四种呼吸道病毒的方法。方法寻找四种呼吸道病毒的相对保守序列,针对该序列分别设计4对引物对及其相应的Taqman探针,将此保守序列作为目的基因片段,使用一步法RT-PCR试剂盒建立、优化反应体系;采用10倍稀释体外转录RNA,检测建立的体系的灵敏度和重复性并建立反应体系标准曲线;通过临床样本检验体系的特异性。结果 HADV、HBoV、HMPV、HRSV四种病毒的检测灵敏度均为10 copies/μl,标准曲线的决定系数分别为:HADV R2=0.9998,HBoV R2=0.9981,HMPV R2=0.9981,HRSV R2=0.9947和0.9965,扩增效率分别为:HADV 105.08%,HBoV 107.81%,HMPV 102.08%,HRSV FAM荧光106.38%及CY5荧光107.95%。荧光RT-PCR反应体系检测体外转录的RNA的各个拷贝数浓度的变异系数均较低,对临床样本检验的特异性为100%。结论本研究建立的实时荧光定量RT-PCR体系可快速、准确地检测人HADV、HBoV、HMPV、HRSV等四种呼吸道病毒,且重复性较好,特异性高。     

淋巴瘤Bcl-2/IgH融合基因实时定量PCR检测方法的研究

目的建立Bcl-2/IgH融合基因实时定量PCR检测方法。方法以淋巴瘤患者Bcl-2/IgH融合基因的纯化DNA作为标准品,淋巴瘤患者骨髓和外周血为样本,建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR（Real-time Quantitative PCR,RQ-PCR）,并对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行测定。结果构建的RQ-PCR方法检测Bcl-2/IgH融合基因的敏感性达10^-7水平;标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.13,0.99;管间变异和批间变异分别为6.54%,6.73%,1.90%和3.59%,6.30%,5.49%。结论建立的SYBR GreenⅠ荧光染料RQ-PCR方法灵敏,标准曲线的相关性好,方法的稳定性和重复性较好。     

建立SYBR Green实时RT-PCR定量检测大鼠I型胶原mRNA水平方法

目的：基于双链嵌合荧光染料SYBR Green Ⅰ，建立一种快速、灵敏的检测大鼠Ⅰ型胶原mRNA表达水平的实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法．方法：提取大鼠肝脏总RNA，RT-PCR扩增Ⅰ型胶原基因部分片段，将其克隆入pMD18-T载体用作参比品．基于SYBR GreenⅠ双链嵌合染料建立检测大鼠Ⅰ型胶原mRNA表达水平方法．其中对一系列连续稀释的参比品进行实时PCR分析，评价所建立方法的检测灵敏度；对PCR产物的熔解曲线进行分析评价其特异性．结果：重组质粒构建成功，经测序鉴定，目的片段已插入pMD18-T载体内．所建立的实时RT-PCR方法的最低检测限度为1个拷贝／反应，在每反应10^0～10^7拷贝范围内，CT值（C代表cycle，T代表threshold；CT值指荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数）与起始模板浓度具有良好的线性关系，相关系数为0．991．结论：所建立的基于SYBR GreenⅠ双链嵌合染料的大鼠Ⅰ型胶原PCR检测方法具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广等特点，适用于进一步的各种组织的大量样本检测．     

实时定量PCR检测白色念珠菌方法学的建立

目的 采用Taq Man MGB探针技术, 建立白色念珠菌实时荧光定量PCR (RQ-PCR) 检测方法, 为临床白色念珠菌的检测提供快捷的方法.方法 以真菌D1/D2区基因的一段高度保守序列为扩增靶序列, 合成白色念珠菌特异性引物和探针, 提取白色念珠菌标准菌株的DNA, 构建含有靶基因片段的重建质粒, 扩增后DNA作为标准品, 建立白色念珠菌RQ-PCR的标准曲线, 并对其重复性、敏感性及特异性等方面进行方法学评价.结果 对构建好的克隆质粒测序, 插入片段与预期片段序列一致, 相似性达100%.白色念珠菌标准曲线为Y=-3.824x+41.36, R2=0.990, 该扩增曲线形态良好.结论 成功建立了实时荧光定量PCR检测白色念珠菌的方法, 其敏感性和特异性较好.     

猴副流感病毒5型实时荧光定量PCR方法的建立与初步应用

目的建立猴副流感病毒5型（SV5）实时荧光定量PCR方法,并初步应用于猴样本检测。方法根据SV5病毒NP基因保守片段设计特异引物和TaqMan探针,使用分子生物学方法制备质粒标准品,建立SV5实时荧光定量PCR方法;对该方法的线性、敏感性、特异性及稳定性进行测定;并使用该方法对24个猴样品进行检测。结果成功建立SV5实时荧光定量PCR方法;该方法线性范围为（6．8×10^9～6．8×10^5）copy／μL,灵敏度为6．8copy／μL,批内变异系数（CV）为0．63％～8．71％,批间CV为1．52％-12．38％,而且方法特异性好;在24个猴肺样品中未检测出阳性。结论该方法的建立为实验动物和动物源性生物制品中SV5的定量检测奠定了基础。     

人IL-21cDNA的克隆及重组腺病毒表达载体的构建

目的：构建含人IL-21基因的重组腺病毒表达载体,为IL-21基因治疗肿瘤研究奠定基础。方法：从人外周血淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增IL-21基因片段,将其连接到进入载体pENTR1A,然后经LR重组转入到腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST中,构建含IL-21基因的腺病毒载体（Ad-IL-21）,并进行测序鉴定和PCR鉴定。结果：Ad-IL-21表达载体测序结果与GenBank中IL-21基因序列一致,Ad-IL-21经PCR扩增出IL-21基因片段。结论：成功构建携带人IL-21基因的重组腺病毒表达载体。