树鼩粪便中沙门氏菌LAMP检测方法建立及应用

目的建立树鼩粪便沙门氏菌的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对此方法进行初步应用。方法根据沙门氏菌种属特异性基因inv A(侵袭蛋白基因A)的保守序列,设计合成特异性LAMP引物。分别设定十个反应温度即57℃~66℃和十个反应时间即24~42 min进行优化,并测定本方法的特异性和灵敏度;同时进行普通PCR实验,作为本方法的验证和比较。用建立的LAMP法对91份野生来源的树鼩稀便样品进行检测。结果优化反应条件选出反应温度为62℃,反应时间34 min;该方法对沙门氏菌的灵敏度可达3.36×101CFU/m L,比普通PCR方法高10~100倍;对10种树鼩来源的肠道细菌进行LAMP检测,只有沙门氏菌属的肠炎沙门氏菌和乙型副伤寒沙门氏菌检测为阳性,其余为阴性;对91份野生树鼩粪便样品进行LAMP检测,阳性检出率为20.88%;LAMP法的所有反应可在40 min内完成。结果可通过肉眼观察颜色变化直接判定。结论所建立的LAMP方法具有便捷、快速、灵敏、特异等特点,可用于树鼩粪便中沙门氏菌的大规模快速检测。     

新生树鼩心肌细胞与心肌成纤维细胞的分离培养、纯化及鉴定

摘要:目的 为了分离得到可以应用于树鼩建立人类心血管病理、毒理细胞模型的纯度较高、活力较强的心肌细胞和心肌成纤维细胞。方法 使用差速贴壁1.5 h纯化心肌细胞进行培养,并比较5-溴-2-脱氧尿苷、阿糖胞苷及TGF-β抑制剂的纯化效率以获取最适纯化方案,培养过程在37℃、5%CO2条件下进行。使用MTT法测定细胞活力以确定方法可行性。利用α-横纹肌肌钙蛋白（α-SA）及心肌肌钙蛋白I（Tn I）对树鼩心肌细胞进行免疫组化及免疫荧光鉴定,利用波性蛋白（Vimentin）对树鼩心肌成纤维细胞进行免疫荧光染色以达到鉴定目的。结果 原代培养新生树鼩心肌细胞生长良好。在倒置显微镜下观察,培养10d左右的心肌细胞可以基本完成局部融合并有伴细胞搏动。MTT法检测结果显示心肌细胞活力可以在最少15d内保持良好水平。细胞鉴定结果显示树鼩心肌细胞α-SA免疫组化呈阳性,Tn I免疫荧光鉴定呈阳性,心肌成纤维细胞呈阴性,符合一般心肌细胞特征;心肌成纤维Vimentin免疫荧光结果呈阳性。结论 分离纯化得到的树鼩心肌细胞和心肌成纤维细胞,细胞纯度较高、结构完整并具有相对较高的细胞活力,是一种较为理想的、可以应用于树鼩建立人类心血管病理、毒理细胞模型的心肌细胞和心肌成纤维细胞。     

腹泻树鼩肠道阿米巴原虫携带情况调查

目的 调查腹泻树鼩肠道中阿米巴原虫携带情况,查找可能导致树鼩腹泻的寄生虫类病原,为实验树鼩的寄生虫质量控制提供依据.方法 采集78只腹泻树鼩新鲜粪便和全血,分离血清,其中野生来源样本45份,人工繁育样本33份.分别采用生理盐水涂片法、碘液染色法进行阿米巴原虫形态学检测,采用ELISA方法进行粪便中阿米巴抗原和血清中IgG抗体检测.结果 形态学镜检结果显示,野生来源和人工繁育腹泻树鼩肠道中阿米巴原虫携带率分别为42.22％(19/45)、33.33％(11/33);经ELISA检测粪便中阿米巴抗原,阿米巴原虫携带率分别为64.44％(29/45)、42.42％(14/33).采用ELISA粪便抗原检出率高于形态学镜检法.经ELISA检测血清IgG抗体阳性率分别为66.67％(30/45)、63.63％(21/33).结论 腹泻树鼩对阿米巴原虫的携带率较高,该原虫可能是导致树鼩腹泻的病原之一.日常饲养过程中应加强阿米巴病的监测和防治,防止肠道寄生虫病的传播.     

树鼩腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的通过建立树鼩腺病毒(tree shrew adenovirus,TAV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测树鼩腺病毒。方法根据TAV全基因组3’端保守序列设计合成特异性引物;用含目的基因片段的重组质粒作为标准品进行标准曲线绘制,建立TAV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的TAV实时荧光定量PCR检测方法特异性好,与树鼩源及其他物种常见病毒无交叉反应;方法的最低检测限度为每微升3.7拷贝,灵敏性强;相关检测系数R2为0.998,扩增效率为95.7%;扩增结果具有良好的线性关系,且重复性检测效果好。结论成功建立了TAV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,灵敏度高,重复性好,可用于TAV感染的早期快速检测。     

树鼩HGF全长编码序列的克隆及分子特征分析

目的获取树鼩肝细胞生长因子的全长编码序列并进行分子特征分析。方法以树鼩肝组织总RNA为材料,通过RT-PCR扩增和序列拼接获得树鼩肝细胞生长因子全长编码序列,进而通过DNAMAN,Pymol等生物信息学软件对其序列和分子特征进行分析。结果树鼩HGF分子结构在进化中相对保守,树鼩HGF整体结构与人相似。但树鼩HGFαNK1区域相比人HGF多出一个α螺旋,并且有两个更长的β折叠片,另外,树鼩在该区域存在一个很强的表面正电荷区域。这些差异可能会对树鼩HGF与其受体的作用方式产生影响。结论本实验为明确树鼩HGF与其受体的作用方式和树鼩HGF的合成与制备奠定了基础。     

树鼩角膜原代上皮细胞的分离培养、纯化与鉴定

目的 建立树鼩角膜上皮细胞(CECs)稳定的体外培养技术,为人类角膜疾病研究提供新的实验材料.方法 使用改进的双酶消化法取得树鼩CECs,用转化生长因子-β(TGF-β)抑制剂配合梯度消化对树鼩CECs进行纯化,角蛋白3/12抗体对CECs进行免疫荧光检测及鉴定.结果 优化的酶消化法可以快速、有效得到高纯度的树鼩CECs. TGF-β抑制剂及梯度消化法可以达到良好的纯化目的,纯化的CECs在传代过程中仍保持良好形态.树鼩CECs免疫荧光染色显示角蛋白3/12单克隆抗体阳性.结论 成功建立了一种有效、简单、经济适用的树鼩角膜上皮原代细胞的体外培养技术,所获得的原代细胞具有较好的上皮细胞形态特征并可以连续传代,为眼科疾病的研究提供一种新材料.     

帕金森疾病动物模型的研究进展

帕金森疾病(Parkinson’s disease,PD)是一种神经退行性疾病,现多认为是遗传和环境因素相互作用的结果。典型特征是黑质纹状体中多巴胺神经元丧失以及多巴胺缺乏相关的典型帕金森运动特征。动物模型在阐明PD的发病机制、测试新的治疗方案及药物的研究中,具有十分重要的作用。啮齿类动物、树鼩和灵长类动物等采用不同造模方法所建立的PD动物模型都拥有自己的优势和局限性,所表现出的临床特征和病理机制与人类有所不同。因此,在科学研究中选择所需使用的模型时必须仔细考虑。本文就主要神经毒素及转基因PD动物模型的相关研究进展进行综述。