Wilson病突变热点PCR-RELP分析及血浆铜蓝蛋白检测

目的检测中国Wilson病(WD)患者高频基因突变点,并了解突变患者的血浆铜蓝蛋白水平.方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)对71例WD患者和30例正常对照者进行高频基因突变点检测,采用速率散射比浊法检测患者血浆铜蓝蛋白水平.结果29.6%(21/71)的患者在第8外显子检测到Arg778Leu突变,其中17例杂合突变,4例纯合突变.11.3%(8/71)的患者检测到第12外显子Thr935Met突变,其中6例杂合子突变,2例纯合突变.携带Arg778Leu和Thr935Met突变患者的血浆铜蓝蛋白水平与未发生该点突变患者比较,差异有显著意义.结论WD基因第8外显子778密码子和12外显子935密码子是中国WD患者的高频突变点;PCR-RFLP检测这两个点突变的检出率较高,可作为WD常用的基因诊断方法;突变患者血浆铜蓝蛋白水平有显著变化.     

Wilson病突变热点PCR-RFLP分析及血浆铜蓝蛋白检测

目的 检测中国Wilson病（WD）患者高频基因突变点，并了解突变患者的血浆铜蓝蛋白水平。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）对71例WD患者和30例正常对照者进行高频基因突变点检测，采用速率散射比浊法检测患者血浆铜蓝蛋白水平。结果 29．6％（21／71）的患者在第8外显子检测到Arg778Leu突变，其中17例杂合突变，4例纯合突变。11．3％（8／71）的患者检测到第12外显子Thr935Met突变，其中6例杂合子突变，2例纯合突变。携带Arg778Leu和Thr935Met突变患者的血浆铜蓝蛋白水平与未发生该点突变患者比较，差异有显著意义。结论 WD基因第8外显子778密码子和12外显子935密码子是中国WD患者的高频突变点；PCRRFLP检测这两个点突变的检出率较高，可作为WD常用的基因诊断方法；突变患者血浆铜蓝蛋白水平有最著变化。     

中国人Wilson病患者ATP7B基因外显子突变研究

目的 对Wilson病(WD)患者ATP7B基因外显子进行PCR扩增测序,研究其突变的特点。方法 对41例患者(WD组)、10例健康者(对照组)以及1个WD家系(先证者女儿及其父母3人)提取基因组DNA,PCR扩增外显子相关片段,并对扩增产物进行直接测序。结果 健康对照组未见异常,WD组发现11例患者存在外显子8点突变,其中6例患者呈Arg778Leu的复合杂合突变;4例患者存在外显子12点突变,其中2例存在Arg952Lys突变。在Wilson病家系中,先证者女儿携带2种杂合性突变,分别是父源的外显子8中Arg778Leu杂合性突变和母源的外显子13中Pro992Leu杂合性突变,其父母均为表型正常的杂合子携带者。结论 中国人WD患者中ATP7B基因外显子8、12为突变的热点区,但也存在其他外显子的突变,如外显子13。     

肝豆状核变性中ATP7B基因复合突变的研究

目的通过对肝豆状核变性(Wilson’s disease,WD)患者ATP7B基因测序,探讨其突变率及与WD的关系,分析WD中ATP7B基因复合突变的意义。方法提取67例临床确诊的WD患者口腔黏膜细胞的基因组DNA,应用PCR技术对ATP7B全部外显子5′端→3′端扩增,运用DNA直接测序法检测突变。结果在67例患者中,发现WD中ATP7B基因突变患者52例,检出率为77.61%,其中16例纯合子突变(12例Arg778Leu纯合子突变和4例Arg919Gly纯合子突变),5例复合突变,31例单纯杂合子突变。5种ATP7B基因复合突变国内罕见报道。结论本研究发现5种ATP7B基因的复合突变,这些复合突变可能与WD的发生发展相关,值得进一步深入研究。     

天津地区汉族肝豆状核变性患者ATP7B基因突变热区的检测

目的：检测天津地区汉族肝豆状核变性(Hepatolenticular Degeneration，HLD)患者ATP7B基因的突变热区。方法：对91名HLD患者和80名对照人群提取基因组DNA，PCR扩增ATP7B基因8号和14号外显子，扩增产物分别进行MspI酶切反应和SSCP分析，异常者进一步行DNA序列分析。结果：在91名HLD患者中，66人存在8号外显子Arg778Leu纯合或杂合突变，而对照组未检出此突变；14号外显子病例组和对照组均未检出突变。结论：Arg778Leu是天津地区汉族HLD患者的高频突变点。     

肝豆状核变性家系ATP7B基因错义和同义突变

目的 通过第二代DNA测序技术,对以“头部不自主抖动”为首发症状的成人肝豆状核变性患者家系内ATP7B致病基因特点及候选突变位点进行分析,探讨错义和同义突变的临床意义。方法 采用第二代DNA测序技术,检测先证者及其家系其他成员ATP7B基因序列。结果 先证者ATP7B基因存在Exon8 c.2333G>T p.(Arg778Leu)错义杂合突变、Exon14 c.3243G>A p.(Glu1081=)同义杂合突变(参考序列NM＿000053.3),其小妹存在相同突变;先证者女儿基因检测提示：Exon14 c.3243G>A p.(Glu1081=)同义杂合突变(参考序列NM＿000053.3),其儿子及大妹存在相同突变位点;患者母亲基因检测提示：Exon8 c.2333G>T p.(Arg778Leu)错义杂合突变,与患者弟弟存在相同突变;生物信息学分析结果表明,突变位点c.2333G>T p.(Arg778Leu)致病,并同时存在c.3243G>A p.(Glu1081=)同义突变。结论 c.3243G>A同义突变影响mRNA的剪接,导致外...     

Wilson病ATP7B基因突变研究

目的：研究肝豆状核变性（WD）ATP7B基因常见突变种类和形式,以期建立WD的ATP7B基因突变热点的检测平台。方法：提取30名WD患者外周血基因组DNA,聚合酶链反应（PCR）扩增ATP7B基因第5、8、12号外显子,并进行DNA直接测序。结果：30例WD患者共检测到6种ATP7B基因突变,均为点突变,8号外显子检测到5种突变,突变频率40.00%;12号外显子检测到1种突变,突变频率23.33%;5号外显子未检测到突变。结论：ATP7B基因第8和12号外显子可能是WD基因突变热区,以Arg778Leu和Arg952Lys为高频突变位点,WD患者的基因突变检测应首选第8和12号外显子。     

广州地区非综合征性耳聋患者耳聋相关基因突变分析

目的分析广州地区非综合性耳聋患者相关耳聋基因突变,初步了解广州地区耳聋患者发病的分子机制。方法详细询问病史和临床检查后,收集广州地区52例非综合性耳聋患者的外周血,提取基因组DNA,用遗传性耳聋基因芯片对4个常见耳聋相关基因(GJB2、SLC26A4、线粒体12SrRNA及GJB3基因)的9个位点进行检测。结果 52例耳聋患者中共检出18例带有耳聋基因突变,检出阳性率为34.6%,其中GJB2基因235delC纯合突变6例,杂合突变2例,299delAT纯合突变1例;SLC26A4基因IVS7-2A>G纯合突变4例,杂合突变1例;线粒体12SrRNA A1555G均质突变4例。结论广州地区非综合性耳聋患者的耳聋相关基因检出阳性率、GJB2基因及SLC26A4基因的携带率均低于全国平均水平,而线粒体基因突变的携带率明显高于全国平均水平。     

3例Gitelman综合征患者临床特点和基因突变分析及文献总结

目的 分析3例Gitelman综合征患者临床表型以及基因突变类型,总结Gitelman综合征的临床特点。 方法 收集2016年1月—2017年1月浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院收治的3例Gitelman综合征患者的临床资料,并提取患者外周血单个核细胞基因组DNA,首先通过高通量测序法寻找与低钾血症相关的36个基因所有外显子的突变位点,再通过直接测序法对患者及其父母验证。同时在万方数据库和中国知网检索经过基因突变分析确诊的Gitelman综合征,比较不同基因突变型的血钾和血镁的差异。 结果 3例患者均表现为反复低钾血症、代谢性碱中毒、高肾素、正常血压,其中只有第2例有明显的低镁血症。基因测序结果显示病例1为SCL12A3基因复合杂合突变,病例2为SCL12A3基因纯合突变,病例3为SCL12A3杂合突变联合CLCNKB杂合突变。经检索共有79例临床资料完整的Gitelman综合征病例纳入分析,结果提示不同基因突变型之间血钾和血镁差异无统计学意义。移码和无意义突变与其他突变相比血钾和血镁差异无统计学意义。血镁降低组的血钾较血镁正常组偏低。 结论 Gitelman综合征临床表型多样,异质性明显,最终确诊仍需要基因突变分析。不同突变之间血钾和血镁差异无统计学意义,血镁降低者临床表型较重。      

肝豆状核变性的ATP7B基因变异分析及产前诊断

目的 对肝豆状核变性家系行遗传学分析,明确该家系的遗传病因.方法 对家系中肝豆状核变性先证者行全外显子测序分析,Sanger测序对先证者及父母筛出的可疑致病变异进行验证,该父母孕育的二胎胎儿行羊水穿刺,行产前基因诊断.结果 发现先证者存在ATP7B基因复合杂合变异,即NM_000053.3:c.2333G＞T(p.Arg778Leu)错义杂合变异和NM_000053.3:c.208delC(p.Gln70Serfs* 4)缺失移码变异;其中,c.2333G＞T错义杂合变异来源于父亲,为数据库已经报道的变异;c.208delC缺失移码变异来源于母亲,暂未见报道.先证者母亲孕20周,行胎儿产前基因诊断,发现胎儿仅携带来源于母亲的ATP7B基因c.208delC移码杂合变异,c.2333位点为野生型,胎儿和先证者基因型不同,预测胎儿不会出现和先证者一样的肝豆状核变性的临床表型.结论 该肝豆状核变性先证者临床表型异常是由ATP7B基因复合杂合变异所致,为生二胎先证者父母的遗传咨询和产前诊断提供了理论依据.     

CCC2基因缺陷型酵母对中国人Wilson病突变热点致病性的研究

【目的】应用CCC2基因缺陷型酵母研究中国人Wilson病（Wilson disease，WD）突变热点Arg778Leu的致病性，在蛋白水平上探讨中国人Wilson病的发病机制。【方法】应用RT-PCR和TOPOTA克隆技术分段克隆ATPTB的全长cDNA，USE定点诱变技术制备突变体，应用酵母功能互补分析的方法研究Arg778Leu的致病性。【结果】本研究应用USE定点诱变技术成功制备了ATPTB的Arg778Leu突变体，在CCC2缺陷型酵母内表达人的野生型ATPTB可以弥补酵母内CCC2蛋白的运铜功能，使CCC2缺陷型酵母在铜、铁及亮氨酸缺陷型培养基上生长良好；对突变体的研究表明Arg778ku只能部分代偿CCC2蛋白的运铜功能。【结论】本试验证明CCC2基因缺陷型酵母是研究人ATPTB的一种良好的细胞模型，证明了中国人WD的常见突变Arg778Leu是一种致病性的突变。     

Identification and analysis of mutations of the Wilson disease gene in Chinese population

Ｗｉｌｓｏｎｄｉｓｅａｓｅ (ＷＤ)ｉｓａｌｅｔｈａｌａｕｔｏｓｏｍａｌｒｅｃｅｓｓｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒｏｆｃｏｐｐｅｒｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ,ａｎｄｉｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｂｙａｃｕｔｅｏｒｃｈｒｏｎｉｃｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅａｎｄ/ｏｒｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃｄｅｆｉｃｉｔｓｄｕｅｔｏｃｏｐｐｅｒａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｌｉｖｅｒａｎｄｂｒａｉｎ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｓｔｏｒｅｍｏｖｅｔｈｅｅｘｃｅｓｓｃｏｐｐｅｒｂｙｃｈｅｌａｔｉｎｇａｇｅｎｔｓｓｕｃｈａｓｐｅｎｉｃｉｌｌａｍｉｎｅ1　…     

PCR技术对Wilson病基因进行定点突变的研究

【目的】利用聚合酶链反应 (PCR)技术对Wilson病 (WD)基因进行体外定点突变的研究。【方法】采用PCR定点突变技术 ,首先设计两对引物 ,将突变位点设计在引物上 ,通过重叠延伸法两次PCR扩增 ,扩增片段上含有所需要的突变位点 ,最后将扩增片段克隆入pRc/CMV载体中。【结果】DNA测序表明在预期位点已经发生突变 ,WD基因第 778位密码子由精氨酸 (Arg)残基突变为亮氨酸残基 (Leu) ,用PCR定点突变技术成功构建Wilson病基因突变体。【结论】PCR技术诱导定点突变准确、高效。Wilson病基因突变体的构建成功 ,为进一步研究该突变位点导致Wilson病的发病机制和Wilson病蛋白的结构和功能的关系奠定了基础。     

ATP7 B基因突变与肝豆状核变性发病关系的探讨

目的 对中国人肝豆状核变性( WD)患者 ATP7B 全基因测序,分析其突变及与WD的关系,并探讨ATP7B基因复合突变在WD发病中的意义. 方法 对临床确诊的WD患者84例及20 例健康者采集口腔黏膜细胞,提取基因组DNA为模板,应用聚合酶链反应对ATP7B 全部外显子5′ 端→3′ 端扩增;运用 DNA 直接测序法检测突变,并分析ATP7B基因突变临床意义及与预后的关系. 结果 在84例患者中,ATP7B基因突变率为82. 14%,还发现一些国内较少报道的ATP7B基因复合突变,可能与WD相关. 结论ATP7B基因突变有较大的异质性,对该基因突变的检测,能发现有相关ATP7B基因突变的WD患者.     

应用USE定点诱变技术制备Wilson病突变体

【目的】克隆Wilson病(WD)基因的全长cDNA,制备WD的突变体,为进一步研究突变蛋白的功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR和TOPO-TA克隆技术,克隆了全长WDcDNA,并以此为膜板应用USE定点诱变技术(特异性位点抹除技术)构建了778位(CGG→CTG)、1069位(GTG→GTC)两个突变体。【结果】成功克隆了WDcDNA,并经过全长测序没有发现突变的存在。以此为模板制备了WD基因8号外显子第778位密码子由CGG突变为CTG、14号外显子1069位GTG→GTC的突变体,从而构建了含中国人和欧美WD基因的高频突变点。【结论】USE定点诱变技术是寡核苷酸引物诱变技术的一个重大的改进,该技术采用双位点同时突变的方法,经两次酶切,两次转化,选择效率很高。     

Identification of a mutation hotspot in exon 8 of W ilson disease gene by cycle sequencing

Objective To screen for mutation hotspot of Wilson disease (WD) gene in Chinese population.Methods Cycle sequencing was used to detect mutation in exon 8 of WD gene in 30 patients with Wilson disease. Results The same missense mutation, Arg779Leu, was identified in 14 WD patients, four of whom were homozygous and the other heterozygous for this mutation.The frequency of this mutation in Chinese patients was 30%.Conclusion The codon 779 (CCG→CTG) of exon 8 of WD gene was one of mutation hotspots in Chinese.     

肝豆状核变性分子生物学研究

【目的】探讨中国人肝豆状核变性(WD)的分子发病机制和基因诊断的方法。【方法】应用基因工程技术对WD进行了10年的分子生物学研究。【结果】①WD的基因定位研究通过RFLP及微卫星多态性分析,应用两位点及多位点连锁软件,建立了中国人WD基因在D     

小鼠肝脏特异性表达载体ALB-ATP7B的构建

[目的] 构建人肝豆状核变性病 ATP7B基因野生型及常见突变型的小鼠肝脏特异性表达载体 ALB-ATP7B,为制备转基因小鼠及相关基因治疗作准备.[方法] 定点突变法获取人群中常见的 Arg778Leu及 His1069Gln两种 ATP7B基因突变体,定向克隆将小鼠白蛋白启动子 ALB序列及野生和突变的 ATP7B基因亚克隆至真核表达载体 kbpala上,得到可在小鼠肝脏特异性表达的人 ATP7B基因正常及突变型真核表达载体 ALB-ATP7B.[结果] 经测序及酶切鉴定证实,真核表达载体 ALB-ATP7B构建成功.[结论] 人类正常及突变 ATP7B基因真核表达载体 ALB-ATP7B的构建初步奠定了转基因小鼠制备的基础.     

Psychopathology and personality traits in patients with treated Wilson disease grouped according to gene mutations

Wilson disease (WD) is a recessively inherited copper storage disorder mainly affecting liver and brain. Genotype/phenotype correlations have been report ed but as yet not regarding psychic symptoms. Our aim was to investigate if a correlation might exist between genotype and phenotype concerning psychopathology and/or personality traits in patients with treated WD. Nine homozygous and three compound heterozygous Swedish patients were retrospectively investigated, representing four different mutation settings. Psychopathological symptoms were studied using the Comprehensive Psychopathological Rating Scale (CPRS), personality traits using the Karolinska Scales of Personality (KSP) and mutations were analyzed by manifold sequencing. Psychopathological symptoms: Patients with the Trp779Stop mutation had the lowest scores on the total CPRS, due to less pronounced reported CPRS items, as compared to the other three groups of patients. Compound heterozygotes for the His1069Gln/Arg1319Stop mutation showed the highest total CPRS scores. Personality traits: Patients homozygous for the Trp779Stop and the Thr977Met mutations had high scores on Psychopathy related scales whereas patients with His1069Gln/Arg1319Stop mutations had the lowest scores on these scales. Serum ceruloplasmin levels were undetectable in all patients with the Trp779Stop and Thr977Met mutations. The results show a trend towards a genotype/phenotype correlation regarding psychopathological symptoms and personality traits in treated patients with WD. If replicable, these results might contribute to the elucidation of the possible clinical importance of functionally deleterious gene mutations in WD psychopathology and personality traits.