抗T细胞受体αβ单抗和抗CD80单抗联合供体骨髓移植诱导小鼠皮肤移植耐受

目的:探讨抗T细胞受体(T cell receptor, TCR)αβ单抗和抗CD80单抗联合供体骨髓细胞输注方法在同种异基因小鼠皮肤移植耐受诱导中的作用.方法:第0天,向C57BL/6小鼠(受体)尾静脉输注2×10⁸个BALB/c小鼠(供体)来源的骨髓细胞,同时腹腔注射抗TCRαβ单抗500 μg;第2天,向C57BL/6小鼠腹腔注射抗CD80单抗500 μg.第6天进行皮肤移植.在不同的时间对C57BL/6小鼠进行迟发型超敏反应测定和混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction, MLR)分析,并进行MLR的白细胞介素-2(interleukin-2, IL-2)逆转实验、过继转移实验和嵌合体检查,探讨耐受形成的机制.结果:接受了抗TCRαβ单抗和抗CD80单抗联合供体骨髓移植的C57BL/6小鼠,供体皮肤移植物平均存活70 d;在迟发型超敏反应和混合淋巴细胞反应中均表现出显著的低反应性.IL-2逆转实验结果表明克隆不应答可能参与了移植耐受的形成.体内、体外过继转移实验均显示耐受C57BL/6小鼠脾细胞中存在抑制细胞的活性.嵌合体检查结果表明在耐受C57BL/6小鼠的胸腺和脾中均形成了混合嵌合体,嵌合体水平随时间下降.结论:抗TCRαβ单抗和抗CD80单抗联合大剂量供体骨髓细胞输注可以在组织相容性抗原完全不相同的成年小鼠间成功诱导出皮肤移植物的长期耐受.     

抗Ia单克隆抗体促进异基因皮肤移植耐受

目的:探索抗Ia单克隆抗体促进"细胞+环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)"系统诱导移植耐受的作用及其机制.方法:BALB/C(H-2d)小鼠经尾静脉注入C57BL/6(H-2b,B6)小鼠脾细胞,48 h后腹腔注射CP,接着两天分别经尾静脉注入抗小鼠Ia单克隆抗体500 μg,然后进行皮肤移植,并于耐受30 d对受体小鼠作混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)、迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity,DTH)等耐受状态的检查.结果:B6小鼠的皮肤移植物在耐受BALB/C小鼠中存活期特异性延长,MLR和DTH检查证明BALB/C小鼠对B6小鼠的脾细胞产生特异性耐受,对无关第3者KM小鼠的脾细胞仍表现出强烈的免疫反应.机制研究发现,克隆不应答(anergy)和抑制细胞在耐受中起作用.结论:抗Ia单克隆抗体可明显促进"细胞+CP"诱导的异基因皮肤移植耐受.克隆不应答和抑制细胞是耐受的主要机制.     

皮肤移植耐受及其机制的研究

目的探讨静脉注射异基因脾细胞(SC)和抗T细胞受体(TCR)αβ单克隆抗体加腹腔注射环磷酰胺(CP)诱导的成年小鼠异基因皮肤移植耐受及其形成的机制.方法对C57BL/6(H-2b,B6)小鼠经尾静脉注射BALB/c小鼠(H-2d)脾细胞,2d后腹腔注射CP,之后第2、4天分别经尾静脉注射抗小鼠-TCRαβ的单克隆抗体,然后进行皮肤移植.分组(1)未处理B6小鼠,皮肤供者为BALB/c小鼠;(2)未处理B6小鼠,皮肤供者为KM小鼠;(3)SC+CP+抗TCRαβ单抗处理的B6小鼠,皮肤供者为BALB/c小鼠;(4)SC+CP+抗TCRαβ单抗处理的B6小鼠,皮肤供者为KM小鼠.每组各5只B6小鼠通过嵌合体检查、过继转移实验及外源白细胞介素2(IL-2)对耐受小鼠供体特异性混合淋巴细胞反应(MLR)的影响,探讨耐受形成的机制.采用成组t检验进行统计学分析.结果BALB/c小鼠的皮肤移植物在耐受B6小鼠中存活66.3d,与各对照组比较,差异有显著意义(P<0.001),流式细胞分析仪分析结果表明,耐受小鼠胸腺和脾脏内均形成了微量混合嵌合体,耐受诱导后第15天、35天和第70天胸腺内供体来源细胞嵌合水平依次为2.67%,1.61%,0.47%,脾脏中依次为7.66%,5.99%,3.87%;体、内外细胞转移实验均未显示耐受小鼠脾细胞中存在抑制细胞活性;耐受小鼠供体特异的MLR受到抑制,3H-TdR掺入值为4725cpm±406cpm,但外源IL-2的加入使掺入值增加到18175cpm±3642cpm(P<0.01),说明耐受小鼠MLR的抑制可被部分逆转.结论嵌合体的形成和克隆不应答(anergy)是耐受形成的主要机制.     

供体NKT细胞输注促进小鼠皮肤移植耐受及其机理的研究

目的探讨供体NKT细胞静脉输注诱导移植耐受的作用及其机制。方法C57BL/6和BALB/c小鼠分别为供体和受体,建立皮肤移植模型。对照组:术后注射生理盐水;NKT组:术前静脉注射供体鼠NKT细胞(5×106个/只),术后腹腔注射生理盐水;CsA组:术后腹腔注射环孢素(CsA)(4mg/kg);NKT CsA组:手术前1日静脉注射供体鼠NKT细胞(5×106个/只),术后腹腔注射CsA(4mg/kg)。术后逐日观察移植皮肤存活情况及小鼠一般状况;术后14天对植皮BALB/c小鼠做混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)、迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity,DTH)等确定耐受的状态;并通过过继转移实验及脾细胞中细胞因子mRNA表达情况,进一步探讨耐受形成的机制。结果采用此诱导方案,移植皮片存活时间明显延长,耐受可被过继转移,Th2型细胞因子IL-10、IL-4在耐受小鼠中明显升高。结论供体NKT细胞静脉输注能诱导异基因小鼠皮肤移植耐受,抑制细胞、Th1/Th2偏移在耐受中起了一定作用。     

胸腺内注射异基因骨髓细胞诱导特异性免疫耐受的实验研究

目的:探索通过胸腺内注射异基因骨髓细胞加腹腔注射环磷酰胺,以小鼠皮肤移植为模型,诱导移植免疫耐受,为免疫耐受提供理论和实验依据.方法:提取供体B6小鼠(H-2b)骨髓细胞,注入受体BALB/C(H-2d)小鼠胸腺内,48 h后腹腔注射200 mg/kg的环磷酰胺,2周后移植供体小鼠(H-2b)和无关供体C3H(H-2k)小鼠皮肤.共设空白对照组、CP对照组、BM对照组、实验组、第三方供体组5个组.观察皮肤存活时间;皮肤移植2周后对受体小鼠作单向混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)、脾细胞增值反应及迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity,DTH)耐受状态的检测.结果:受体小鼠获得了对供体小鼠的特异性皮肤移植耐受,实验组移植皮肤平均存活时间(MST)为(22.00±2.51)d,对照组MST为(8.75±1.04)d,耐受的受体小鼠对第三供体C3H小鼠的移植皮肤仍正常排斥,MST为(10.25±1.91)d.单向混合淋巴细胞反应和迟发型超敏反应证明耐受的BALB/C小鼠对B6小鼠的脾细胞的反应性特异性降低,而仍保持对第三方供体C3H小鼠的免疫反应.耐受的受体小鼠脾细胞对丝裂原(ConA)的增殖反应在正常范围.结论:使用胸腺内注射供体异基因骨髓细胞,结合腹腔应用环磷酰胺的方法,可在成年动物诱导出对供体移植物的特异性免疫耐受,无非特异性免疫抑制.小鼠皮肤移植模型是观察免疫耐受状态的可靠动物模型.     

混合胸腺移植诱导皮肤移植物免疫耐受的实验研究

目的通过建立混合胸腺移植模型,对混合胸腺移植诱导皮肤移植物免疫耐受及其机制进行初步研究.方法混合胎胸腺移植3个月后,进行异基因皮肤移植,观察异种皮肤移植物的存活情况,并利用流式细胞仪检测各组受体动物外周血中CD4 CD25 T细胞的百分率,利用免疫组化观察宿主骨髓源细胞在胸腺移植物内的分布情况.利用脾细胞过继转移,观察对异种供体抗原已产生耐受的受者脾细胞,能否将耐受状态过继转移至正常BALB/c小鼠.结果混合胸腺移植3个月后,受体外周血白细胞中CD4 CD25 T细胞的百分率为(2.83±0.20)% ,与正常BALB/c小鼠相比,相差不显著.免疫组化染色显示,在移植胸腺内宿主源MHC-Ⅱ分子阳性细胞主要位于髓质,并具有典型树突样外观.将对F344大鼠皮肤已产生耐受的脾细胞,过继转移至免疫健全的BALB/c小鼠,可特异延长胸腺供体来源的F344大鼠皮肤移植物的平均存活时间.结论通过胸腺移植诱导的免疫耐受,主要是以胸腺内的中枢排除机制以及调节性T细胞的免疫抑制作用为主,而且此种耐受具有一定的"可转传性".     

非清髓性预处理联合髓腔内骨髓细胞输注诱导免疫耐受的实验研究

目的本研究通过非清髓性预处理方案联合髓腔内骨髓移植建立异基因小鼠免疫耐受模型,并探讨其诱导耐受的机理.方法受鼠C57BL/6(B6)于第0天接受60Coγ射线全身照射(TBI,550-cGy),4 h内输注雄性BALB/C(H2d)小鼠来源的骨髓细胞,2 d后腹腔注射环磷酰胺(CTX,200 mg·kg-1).通过皮肤移植、混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction, MLR)检测耐受状态,并应用体外过继转移实验、IL 2逆转实验等探讨免疫耐受机制.结果经骨髓移植的B6小鼠对BALB/C小鼠的皮肤移植物平均存活时间超过300d,较空白组明显延长(P＜0.001);MLR结果证明B6小鼠获得供体特异性耐受,该耐受可以被IL 2逆转且可被过继转移;所有受鼠均未出现GVHD表现.结论非清髓预处理联合髓腔内骨髓移植可以有效诱导异基因小鼠的免疫耐受.     

诱导持久稳定的嵌合体维持异种耐受的研究

目的　探讨诱导持久稳定的嵌合体来维持耐受的方法。方法　给SD大鼠亚致死照射 +BALB/c小鼠骨髓细胞 +环磷酰胺建立混合嵌合体模型后 ,于BMT后 14d输注供鼠脾细胞 3× 10 7或于 14 ,2 1,2 8d输注供鼠脾细胞 1×10 7、3× 10 7、5× 10 7,在输注脾细胞后 90 ,12 0d ,检测小鼠源性细胞在受鼠体内植活情况 ,通过混合淋巴细胞反应 (MLR)及迟发性超敏反应 (DTH)检测诱导维持耐受情况。结果　模型建立后未输注组 ,受鼠外周血于 90d时可测出小鼠源性细胞 ,但 12 0d已测不出 ,MLR和DTH检测显示耐受已消失 ,而输注组 12 0d时受鼠外周血仍可测得小鼠源性细胞 ,MLR及DTH检查仍出示特异性耐受 ,且BMT后第 14 ,2 1,2 8天输注组和 14d输注组 ,差异有显著性。结论　输注供体脾细胞可成功诱导持久稳定的混合嵌合体来维持特异性耐受。     

小鼠到大鼠骨髓移植诱导供者特异的免疫耐受

目的　探索适用临床的异种骨髓移植诱导免疫耐受的方案。方法　受体SD大鼠接受亚致死剂量照射(5 5Gy)当天尾静脉注射BALB/c小鼠骨髓细胞 8× 10 7,2d后腹腔内注射环磷酰胺 15 0mg/kg。分别于移植后 3 0 ,60及90d取受体大鼠外周血 ,用特异性单抗作直接免疫荧光染色后上流式细胞仪 (FACS)分析 ,检测骨髓植入的嵌合情况 ,并于 4周后作皮片移植和混合淋巴反应 (MLR) ,检查免疫耐受情况。结果　受体大鼠外周血可检测到小鼠骨髓源性细胞 ,嵌合体在 90d时仍存在。皮片移植和MLR证明受体SD大鼠对供体BALB/c小鼠产生特异性免疫耐受 ,对无关第 3者C5 7BL/ 6小鼠仍有强烈免疫应答。结论　小鼠到大鼠骨髓移植成功地诱导了特异性免疫耐受。     

供体MHC抗原胸腺注射诱导皮肤移植免疫耐受

为建立一种经胸腺诱导移植免疫耐受的动物模型。方法：从供体Ｃ５７ＢＬ／６小鼠脾细胞提取主要组织相容性复合体抗原，注射到异基因受体小鼠ＢＡＬＢ／Ｃ胸腺内，诱导成年小鼠对异基因供体皮肤移植物的特异性免疫耐受。结果：实验组移植皮片平均存活时间为８３天，对照组ＭＳＴ为１１天。第三供体组ＭＳＴ为１２天。结论：胸腺注射异基因小鼠脾细胞ＭＨＣ抗原，可能诱导特异性移植免疫耐受。皮肤移植模型是一种可靠易行的诱导耐受的     

混合胸腺移植诱导免疫耐受和防止发生自身免疫性疾病的实验研究

目的：探讨混合胸腺移植诱导移植免疫耐受而不发生自身免疫性疾病的可行性。方法：BALB／c裸小鼠的肾包膜下植入胸腺，建立异种、同系与异种混合、同种与异种混合胸腺移植模型。4个月后，用流式细胞仪技术检测受者外周血中T细胞，用混合淋巴细胞培养了解T细胞对刀豆素A(ConA)以及同种异种淋巴细胞的反应性，异基因皮肤移植观察皮肤移植物存活期。术后6个月内比较各组发生自身免疫性疾病情况，观察胃的组织学变化，用ELISA法检测受者血清中抗DNA自身抗体。结果：胸腺移植后，受者T细胞重建良好；T细胞对ConA及无关的SD鼠淋巴细胞的反应强，而对移植胸腺供者来源的淋巴细胞无增殖反应；受者对胸腺供者来源皮肤移植物不发生排斥，而对无关的SD鼠皮肤移植物发生排斥。异种组发生自身免疫性疾病率高，异种组胃组织有明显的炎性损害，血清中自身抗体明显高，而混合组未观察到明显的炎性改变。结论：同系或同种、异种胎胸腺混合移植，可诱导供者特异性免疫耐受和防止器官特异性自身体免疫性疾病。     

腺病毒介导的CTLA4Ig和OX40Ig基因转移诱导大鼠心脏移植物长期存活的作用

目的探讨腺病毒介导CTLA4Ig和OX40Ig基因转移延长异基因大鼠心脏移植物存活时间的作用及其相关机制。方法将Lewis大鼠随机分为5组对照组、空载病毒AdEGFP处理组、AdCTLA4Ig处理组、AdOX40Ig处理组和AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig处理组。在心脏移植的同时,对照组不予其他处理,其他各组分别经尾静脉注射(1~5)×109pfu/ml AdEGFP、AdCTLA4Ig、AdOX40Ig、AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig进行耐受诱导,每天观察心脏移植物的存活情况,完全停跳的心脏经组织学证实后定为排斥。ELISA法测定目的基因的表达水平。混合淋巴细胞反应、过继转移实验、IL-2逆转实验和RT-PCR检测研究其诱导耐受的机制。结果心脏移植物的平均存活时间AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig处理组(151.5d±42.8d),AdCTLA4Ig处理组(43.2d±11.1d),AdOX40Ig处理组(60.2d±11.4d)与对照组(5.7d±0.5d)和空载病毒AdEGFP处理组(5.2d±0.4d)比较明显延长(P均<0.01),并且AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig处理组在延长移植物存活时间上明显优于AdCTLA4Ig和AdOX40Ig处理组(P均<0.01)。耐受Lewis大鼠脾细胞对供体DA大鼠脾细胞表现为低应答,并且该低应答状态能够被外源性白细胞介素-2(IL-2)部分逆转。过继转移结果说明该低应答状态能够转移给同系正常Lewis大鼠。在耐受大鼠体内发生了Th1/Th2型细胞因子偏移。结论AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig介导的基因转移能够在大鼠体内长期高效表达,并诱导异基因心脏移植物长期存活,其机制可能与T细胞无能、Th1/Th2型细胞因子偏移及其调节性T细胞等有关。     

成年大鼠联体诱导的移植耐受与嵌合状态相关性的研究

目的 将异基因成年大鼠联体共生（ｐａｒａｂｉｏｓｉｓ）以诱导相互特异的移植耐受，探讨嵌合体与耐受的关系。方法 联体前后低剂量环磷酰胺（ＣＰ，１００ｍｇ／ｋｇ）腹腔注射，观察联体大鼠存活时间。分别于联体５、１５、４５ｄ时将联体大鼠分开，并相互植皮，观察皮肤存活情况，并在上述时间点以流式细胞仪检测联体分开后大鼠胸腺、脾脏中供体来源细胞的嵌合状态。在联体１５ｄ时检测同种异型混合淋巴细胞反应（ＭＬＲ）、迟     

NBD多肽预处理的树突状细胞延长移植心存活时间的实验研究

目的 探讨NBD多肽预处理的供体源性树突状细胞(DC)在诱导心脏移植免疫耐受中的作用及可能机制.方法 体外培养供体源性BALB/c小鼠骨髓树突状细胞并以NBD多肽预处理(NBD多肽-DC,在小鼠心脏移植前7 d,将NBD多肽.DC输至受者C57BL/6小鼠体内.应用Cu-T建立小鼠颈部异位心脏移植模型,观察心脏移植物存活时间,病理分析检测排斥反应程度.混合淋巴细胞反应(MLR)测定受者脾脏T细胞对供者同种抗原的反应性,并用ELISA方法测定受者血清Thl型细胞因子(IFN-γ和IL-12)和Th2型细胞因子(IL-4和IL-10)水平的变化.结果 NBD多肽-DC可使移植心脏存活天数延长至(21.83±3.54)d,较PBS对照组的(6.66±1.21)d明显延长(P＜0.01),降低排斥反应病理分级(Stanford 1～2级),能诱导受者脾脏T细胞的抗原特异性低反应性,使受者小鼠血清INF-γ和IL-12水平显著降低(P＜0.01).而IL-4和IL-10水平明显升高(P＜0.01).结论 NBD多肽预处理的供体源性DC能够诱导针对移植供者产生的特异性免疫耐受现象,其机制可能与诱导受者T细胞的抗原特异性低反应性及Th1/Th2免疫偏移有关.     

供者特异性抗原诱导免疫耐受的实验研究

目的 比较不同特异性抗原和不同输注途径诱导免疫耐受的强度及探讨春可能机理。方法 建立大鼠颈部异位心脏移植模型,采用供体特异性全血、供体特异性脾细胞和骨髓细胞（DSBM）,通过外周、门静脉和胸腺三种不同途径输注以诱导免疫耐受的产生和维持。结果 供体特异性抗原诱导免疫耐受以DSBM及通过胸腺接种途径效果最佳。结论 供者特异性抗原能诱导受体免疫耐受并促进移植物存活,可望成为较理想的临床免疫耐受诱导方法。     

FasL嵌合蛋白修饰的供者脾脏细胞输注诱导免疫耐受的机制

 目的 探讨FasL嵌合蛋白修饰的供者脾脏细胞输注诱导移植免疫耐受的内在机制。方法 采用ProtExTM外源蛋白修饰技术,以FasL嵌合蛋白修饰供者WF大鼠的脾脏细胞,于心脏移植围手术期多次输注给受者ACI大鼠,按注射细胞的不同随机将实验动物分为3组：(1)SA-FasL修饰的供者脾脏细胞组（SA-FasL组,n=23）;(2)链霉亲和素蛋白（streptavidine,SA）修饰的供者脾脏细胞组（SA组,n=20）;(3)未修饰的供者脾脏细胞对照组（Spl组,n=8）。围手术期未作任何治疗为空白对照组（Control组,n=10）。进行体外混合淋巴细胞反应,将第三方F344大鼠心脏移植给耐受大鼠,观察排斥反应。检测受者体内CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺调节性T（Treg）细胞,并将其选出用于进行过继免疫研究。结果 SA-FasL组移植心脏长期存活率为70%,显著高于其他组（P<0.05）。混合淋巴细胞反应与对第三方心脏的排斥反应表明已建立供者特异性免疫耐受。耐受大鼠体内Treg细胞明显增多（P<0.05）,输注这群细胞能够过继免疫耐受。结论 FasL嵌合蛋白修饰的供者脾脏细胞输注能够诱导供者特异的免疫耐受,Treg细胞在免疫耐受状态的建立与维持中发挥重要作用。     

双向排斥反应联体动物模型的建立

OBJECTIVE: To establish a parabiosis model between allogenic conspecific adult mice to study two-way paradigm. METHODS: Fifty-four female Balb/c mice and 54 male C57BL/6 mice were paired and equally divided into 3 groups, namely group 1 with normal saline (NS) injection, group 2 with injections of spleen cells and cyclophosphamide (CP), and group 3 injected with spleen cells, CP, and cyclosporin A (CsA). The treatments were performed by injecting the spleen cells from one of the mice in a pair into the other via tail vein and vise versa, and two days after the operation, CP (150 mg/kg) was injected intraperitoneally. Intraperitoneal CsA (30 mg/kg daily) injection was given starting from 2 days before till 7 days after the operation. Twelve of the 18 pairs of parabiosis mice in each group were separated after 1 week, and part of the skin were transplanted to each other. The maintenance of parabiosis was observed in the other 6 pairs of parabiosis mice were observed. Mixed lymphocyte reaction (MLR) and delayed-type hypersensitivity (DTH) were observed and studied in the separated mice. RESULT: The duration of parabiosis maintenance and skin survival of the group 3 was significantly longer than those in the other two groups, and group 3 showed suppressed MLR and DTH. CONCLUSION: With the application of immunosuppressants, we have successfully established the two-way paradigm model in mice.     

腺病毒介导CTLA4-FasL基因转移诱导大鼠心脏移植物长期存活的作用

目的　探讨腺病毒介导细胞毒T淋巴细胞相关抗原 (CTLA4 ) FasL基因转移延长异基因大鼠心脏移植物存活的作用及其相关机制。方法　供体DA大鼠心脏移植给受体LEW大鼠后 ,经门静脉注入 5× 10 9空斑形成单位 /毫升 (pfu/ml)CTLA4 FasL腺病毒 (AdCTLA4 FasL) ;随后 ,通过每天触摸受体大鼠腹壁 ,记录心脏移植物存活时间。受体大鼠尾静脉取血 ,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定CTLA4 FasL融合蛋白的体内表达 ;通过过继性转移试验、混合淋巴细胞反应 (MLR)及白细胞介素 (IL) 2逆转实验、细胞毒T细胞 (CTL)活性测定、辅助性T淋巴细胞前体 (HTLp)和细胞毒T淋巴细胞前体 (CTLp)频数测定及辅助性T细胞 (TH) 1/ 2型细胞因子检测 ,探讨耐受机制。结果　经AdCTLA4 FasL处理的受体大鼠 ,异基因心脏移植物平均存活时间达 (71 0± 2 3 7)d(n =6 ) ,而对照的未处理组、绿色荧光蛋白 (EGFP)腺病毒处理组和细胞毒T淋巴细胞相关抗原 4免疫球蛋白 (CTLA4Ig)腺病毒处理组平均存活时间分别为 (5 7± 0 5 )d(n =6 )、(5 2± 0 4 )d(n =6 )和 (4 5 7± 12 4 )d(n =6 ) ,差异具有显著意义 (均P <0 0 5 )。心脏移植物长期存活的受体大鼠对供体抗原的低应答可以被过继转移 ;MLR活性特异性降低 ,且不被外源性IL 2逆转 ;CTL活