血管内皮生长因子促进肺转移相关受体通路的研究

目的 探讨肺癌细胞分泌的血管内皮生长因子(VEGF)促进肺转移的受体相关机制。方法 应用噻唑蓝(MTT)与酶联免疫吸附(ELISA)方法测定9种肺癌细胞系的增殖状况和培养上清液中VEGF水平,筛选出差异表达VEGF且增殖无明显差异的两株细胞系。将两株细胞分别接种于SCID小鼠背部观察肿瘤生长,肺癌细胞经尾静脉注射建立肺转移模型,采用HE染色和免疫荧光实验检测肺转移瘤及血管密度。应用两种VEGFR中和抗体(MF-1和DC101)腹腔注射治疗肺转移小鼠,观察肺转移瘤数改变。结果 9种肺癌细胞系分泌VEGF水平不同,其中最高的是A549(182.7ng/mL),最低的是SPCA1(13.39ng/mL),A549细胞和SPCA1细胞的增殖差异无统计学意义(P>0.05)。A549细胞在小鼠背部形成的肿瘤体积明显大于SPCA1细胞,肿瘤组织内新生血管明显增多。A549细胞形成肺转移瘤数为SPCA1细胞的2.3倍。抗VEGFR-1治疗使肺转移瘤数明显减少,而抗VEGFR-2治疗后差异无统计学意义(P>0.05)。结论 肺癌细胞分泌的VEGF促进肿瘤生长、转移和肿瘤血管生成,VEGF通过VEGFR1通路促进肺转移。     

重组人p43蛋白抗血管生成活性及其机制

为了研究重组人p43(YS-1)蛋白对血管生成的影响及其机制,并考察其对肺癌实体瘤的抑制作用。采用内皮细胞增殖实验、细胞迁移实验、管腔形成实验、大鼠动脉环体外实验、鸡胚尿囊膜体内实验考察YS-1的抗血管生成作用;采用Western印迹法检测细胞内磷酸化MEK1/2、Akt蛋白质的表达;选用人肺腺癌A-549裸小鼠移植瘤模型检测YS-1的体内抗肿瘤活性。结果发现,YS-1能明显抑制内皮细胞迁移和管腔形成,可以抑制体外培养的大鼠动脉环微血管样结构及鸡胚尿囊膜血管,YS-1可以明显抑制血管内皮生长因子（VEGF）诱导的内皮细胞中VEGFR2及下游MEK1/2及Akt的磷酸化,YS-1高剂量(10mg/kg)能显著抑制肺癌A549移植瘤的生长。研究结果表明：YS-1能抑制人肺腺癌A-549裸鼠移植瘤的生长,其作用机制可能跟抑制VEGF引起的VEGFR2活化及信号转导而影响血管生成有关。     

科罗索酸抗肺癌作用机制的初步研究

目的研究科罗索酸(CRA)对人肺癌细胞A549生长的影响,初步探讨其抗肿瘤作用机制。方法采用MTT法检测不同浓度下CRA对肺癌细胞A549的体外生长的影响,建立生物发光标记的人肺癌细胞A549裸小鼠荷瘤模型,IVIS小动物活体成像系统检测实体瘤的生长情况,免疫组织化学法分析肿瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)和CD34的表达,以CD34阳性血管数作为微血管密度(MVD)。结果 CRA对A549的体外作用IC50值为26.8μg/ml。体内抗肿瘤实验中,不同剂量的CRA对A549实体瘤均有一定的治疗效果,VEGF和CD34蛋白的含量也有不同程度的影响。结论 CRA对人肺癌细胞A549实体瘤具有一定的治疗作用,其作用机制可能与抑制肿瘤组织中VEGF和CD34蛋白的表达有关。     

VEGF逆转miR-200b促进非小细胞肺癌增殖的作用

目的：探讨血管内皮生长因子(VEGF)在miR-200b抑制非小细胞肺癌(NSCLC)增殖中的作用及机制。方法选择2013年2月至2014年5月在本院经手术治疗的65例NSCLC患者的肿瘤组织,qRT-PCR检测NSCLC组织中miR-200b与VEGF的表达,并统计分析NSCLC组织中miR-200b与VEGF表达的相关性;常规培养A549、H460及16HBE细胞,qRT-PCR检测各组细胞中miR-200b与VEGF的表达;将常规培养的A549细胞随机分为四组,即 miR-200b mimics+vector、miR-200b mimics+VEGF组、miR-200b inhibitor+scramble组、miR-200b inhibitor+VEGF-siRNA组,其中miR-200b mimics+vector组与miR-200b inhibitor+scramble组作为阴性对照,采用MTT法检测各组吸光度值(OD值)。结果 qRT-PCR结果显示,miR-200b在NSCLC组织的表达水平为(0.682±0.106),VEGF在NSCLC组织的表达水平为(2.731±0.597),相关性分析显示在NSCLC组织中miR-200b与VEGF的表达呈负相关(r=-0.514,P<0.001);miR-200b在A549、H460细胞中的表达显著低于16HBE细胞,差异有统计学意义(P=0.000),而VEGF在A549、H460细胞中的表达明显高于16HBE细胞,差异有统计学意义（P=0.000）;MTT结果显示,miR-200b mimics+VEGF组A549细胞在48 h、72 h的细胞增殖率明显高于miR-200b mimics+vector组, miR-200b inhibitor+VEGF-siRNA组A549细胞在48 h、72 h的细胞增殖率明显低于miR-200b inhibitor+scramble组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 miR-200b与VEGF在NSCLC组织及细胞中表达呈负相关;VEGF逆转miR-200b对NSCLC细胞增殖的作用。     

环氧化酶-2在肺癌血管生成中的作用及机制

目的　探讨环氧化酶-2 (COX- 2) 在肺癌血管生成中的作用及可能机制。方法　应用免疫组织化学法研究79例人肺癌组织COX 2、血管内皮生长因子(VEGF) 的表达; 建立裸鼠肺癌细胞株A549 移植瘤模型, 观察选择性COX- 2抑制剂尼米舒利(NIM) 对肿瘤生长的影响, 并用RT-PCR及免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤组织的VEGF基因及蛋白表达。结果　在人肺癌组织中COX -2表达的阳性率为65. 8%, VEGF阳性率为72 .2%, COX -2 与VEGF显著相关(P<0 .01)。在裸鼠移植瘤体内实验中, NIM可有效抑制肿瘤的生长; 与对照组相比, NIM处理组肿瘤组织中VEGF mRNA及蛋白的表达均明显下调(均P<0. 01)。结论　COX -2与肺癌血管生成密切相关, 其作用机制可能是上调促血管生成因子VEGF的表达。关键词　肺癌; 　环氧化酶2; 　血管内皮生长因子     

miR-200b靶向VEGF抑制肺癌细胞侵袭

目的 探讨miR-200b是否通过靶向调控血管内皮生长因子(VEGF)抑制人非小细胞肺癌细胞侵袭,以揭示miR-200b的抑瘤机制。方法运用qRT-PCR检测miR-200b在非小细胞肺癌和癌旁正常肺组织中的表达;将非小细胞肺癌A549细胞分为miR-200b mimics组、miR-200b inhibitors组、scramble组、VEGF-siRNA组和control-siRNA组,分别将miR-200b mimics、miR-200b inhibitors、scramble、VEGF-siRNA、control-siRNA转染于A549细胞;采用Western blot检测A549细胞中VEGF蛋白表达,采用Transwell侵袭实验分别检测A549细胞侵袭能力。结果qRT-PCR检测结果显示,miR-200b在A549、16HBE细胞的表达分别为0.704±0.053、1.582±0.071,两者比较,差异有显著性(P<0.01);Western blot结果显示,外源过表达miR-200b或沉默VEGF能明显下调A549细胞中VEGF蛋白的表达水平;Transwell侵袭实验显示,转染miR-200b mimics或沉默VEGF 36 h后穿过基底膜的细胞数分别为(127±6)和(136±8),与对照组(189±14)比较能明显抑制A549细胞的穿膜能力(P<0.05),而转染miR-200b inhibitors可拮抗VEGF-siRNA对A549细胞的侵袭抑制作用。结论miR-200b通过靶向调控VEGF抑制人非小细胞肺癌细胞侵袭。     

Rg3对人肺腺癌A549细胞及其内源性VEGF的影响

目的探讨人参皂甙-RG3在抑制肿瘤新生血管生成过程中的作用,对人肺腺癌A549细胞的影响及其内源性分泌的血管内皮细胞生长因子(VEGF)的作用。方法培养人肺腺癌细胞株A549细胞,采用MTT法检测不同浓度RG3(10-4MOL/L,10-5MOL/L,10-6MOL/L)对人肺腺癌A549细胞增生的影响、流式细胞仪观察不同浓度RG3(3×10-7MOL/L、10-6MOL/L,3×10-6MOL/L)对A549细胞凋亡的影响、放射免疫分析法定量检测细胞培养液中加入不同浓度RG3(10-7MOL/L、10-6MOL/L、10-5MOL/L和10-4MOL/L)后内源性VEGF含量的变化。结果RG3对A549细胞的增生无明显抑制作用,3×10-6MOL/L RG3作用120H后A549细胞凋亡百分数为29.8%(P<0.05)。RG3浓度为10-5MOL/L和10-4MOL/L组的VEGF明显低于对照组(P<0.05),10-4MOL/L RG3组的VEGF低于10-7MOL/L和10-6MOL/L RG3组,作用72H的VEGF水平明显低于48H和24H组(P<0.05)。结论适当浓度的RG3作用一定时间后,可促使人肺腺癌A549细胞的凋亡,并可抑制肿瘤细胞内源性分泌的VEGF含量,RG3抑制肿瘤血管生成机制之一是通过影响细胞分泌上述因子而起作用的。     

熊胆粉对肝癌移植瘤裸鼠血管生成和细胞周期的影响

目的探讨熊胆粉对肝癌移植瘤裸鼠血管生成和细胞周期的影响。方法用人肝癌HepG2细胞建立裸鼠移植瘤模型,待皮下移植瘤形成后,将裸鼠随机分为熊胆粉组和对照组,每天分别给予熊胆粉和生理盐水灌胃,日1次,连续21 d。3周后剥取肿瘤。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测p21、细胞周期蛋白依赖激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白(CyclinE)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR2)mRNA的表达;免疫组化检测p21、CDK2、CyclinE、VEGF、VEGFR2蛋白表达,并通过CD31表达检测微血管密度(MVD)。结果 MVD结果显示熊胆粉显著抑制体内微血管的形成,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);RT-PCR和免疫组化结果表明,熊胆粉显著促进p21的表达,抑制CDK2、CyclinE、VEGF、VEGFR2的表达,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论熊胆粉诱导细胞周期阻滞和抑制血管生成可能是其治疗肝癌的作用机制之一。     

miR-18a对结肠癌血管生成的影响

目的 探讨miR-18a对结肠癌血管生成的影响及其机制.方法 以用合成的miR-18a模拟物转染人结肠癌细胞系SW620细胞.应用MTT法检测过表达miR-18a对细胞增殖活性的影响.分别用稳转miR-18a的SW620细胞接种建立裸鼠人结肠癌移植瘤模型.每周测量瘤体积.5周后麻醉处死裸鼠.免疫组化法检测增殖细胞核标志物Ki 67和血管内皮细胞标志物CD31的表达.应用Western blotting法检测血管生成相关的mTOR通路中mTOR下游靶蛋白S6K1和4E BP1的磷酸化情况,并检测肿瘤组织血管生成相关因子缺氧诱导因子1 α(HIF-1α)和血管内皮生长凶子(VEGF)的表达.结果 miR-18a过表达显著降低SW620细胞的增殖能力(P＜0.01).并且,该基因对裸鼠人结肠癌移植瘤有明显的生长抑制作用,SW620组瘤体显著减小,抑瘤率达71.8％(P＜0.01).免疫组化检测显示,miR-18a显著抑制细胞增殖核抗原蛋白Ki-67(P ＜0.01)和血管内皮细胞标记物CD31(P＜0.05)的表达.Western blot法检测显示,miR-18a显著抑制S6KI(P＜0.01)和4E-BPI(P ＜0.05)的磷酸化,而且抑制肿瘤组织中HIF-1 α (P＜0.05)和VEGF蛋白(P＜0.01)的表达.结论 过表达miR-18a抑制结肠癌生长和血管生成,这可能与其抑制mTOR/VEGF通路有关,提示过表达miR-18a 可能成为结肠癌治疗的新方法.     

miR-155-5p mimic靶向HIF-1α对非小细胞肺癌A549细胞生长和运动能力的调节作用和机制

【摘要】 目的 探讨miR-155-5p mimic靶向缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）对非小细胞肺癌A549细胞生长和运动能力的调节作用和机制。 方法 取对数期生长的A549细胞,将未经转染的细胞设为Control组,miR-155 mimic及HIF-1α分别转染至A549细胞,设为miR 155 mimic组和HIF-1α组;再将两者共同转染于A549细胞,设为mimic+HIF-1α组。采用荧光素酶报告基因检测miR 375与SLC7A11的靶向关系,利用RT PCR检测各组细胞miR 155-5p及HIF-1α mRNA表达水平,Edu染色检测细胞增殖,划痕实验检测细胞迁移,Transwell小室实验检测细胞侵袭,Western blot检测细胞中各蛋白表达。结果 HIF-1α是miR 155-5p-mimic的靶向基因。与Control组相比,miR-155-mimic组HIF-1α-mRNA水平、HIF-1α和Ki67蛋白表达量及增殖细胞数、侵袭细胞数及划痕愈合率均降低（P＜0.05）,HIF-1α组HIF-1α mRNA水平、HIF-1α和Ki67蛋白表达量及增殖细胞数、侵袭细胞数及划痕愈合率均升高（P＜0.05）。与HIF-1α组相比,mimic+HIF-1α组HIF-1α mRNA水平、HIF-1α和Ki67蛋白表达量及增殖细胞数、侵袭细胞数及划痕愈合率均降低（P＜0.05）。与Control组相比,miR-155-mimic组N cadherin、VEGF、VEGFR2、P38蛋白表达量降低,E cadherin蛋白表达量升高（P＜0.05）,HIF-1α组N cadherin、VEGF、VEGFR2、P38蛋白表达量升高,E cadherin蛋白表达量降低（P＜0.05）。与HIF-1α组相比,mimic+HIF-1α组N cadherin、VEGF、VEGFR2、P38蛋白表达量降低,E cadherin蛋白表达量升高（P＜0.05）。结论 miR-155-5p可通过靶向抑制HIF-1α表达抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖、侵袭及迁移,其作用机制可能与抑制上皮间质转化及VEGF/P38通路相关。     

苏拉明对肺癌血管生成的抑制作用

目的　研究苏拉明对肺癌血管生成的抑制作用及其机制。方法　采用细胞培养和免疫组织化学的方法离体研究肺癌A5 49细胞、人血管内皮ECV 30 4细胞VEGF及其受体 (Flt、KDR)的表达及苏拉明的影响。结果　苏拉明对肺癌细胞产生和分泌VEGF无影响 ;ECV 30 4细胞KDR、Flt的蛋白表达在苏拉明浓度为 0 .2 5ng/ml和 2 .5ng/ml时 ,受到显著抑制 ;而苏拉明浓度为 0 .2 5ng/ml和 2 5ng/ml时Flt的表达 ,以及苏拉明浓度为 2 .5ng/ml和 2 5ng/ml时KDR的表达则无明显变化 (与对照组比较 ,P >0 .0 5 ) ;苏拉明对A5 49、ECV 30 4细胞增生无影响。结论　苏拉明抑制肺癌血管生成的作用机制可能是通过抑制血管内皮细胞上的VEGF受体表达 ,减少VEGF与其受体结合所致。     

基于JAK2/STAT3/VEGF通路探讨周氏固金消瘤汤抗人肺腺癌A549细胞的机制研究

目的   研究周氏固金消瘤汤(ZSGJXLT)对人肺腺癌A549增殖、凋亡和血管生成的影响及其机制。方法   通过CCK-8法检测ZSGJXLT对细胞活性的影响;Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡;体外血管形成实验观察血管生成情况;Western blot法检测Bcl-2、Bax、VEGF、JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3表达;构建小鼠A549肺癌皮下移植瘤模型,并给予不同浓度ZSGJXLT治疗,21 d后处死小鼠称取瘤质量,计算抑瘤率。结果   ZSGJXLT显著抑制A549的活性(P < 0.01),具有时间及浓度依赖性;ZSGJXLT诱导A549细胞凋亡(P < 0.05~0.01),具有浓度依赖性;ZSGJXLT显著抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外小管形成(P < 0.01),呈浓度依赖性;Western blot结果显示ZSGJXLT能引起Bax/Bcl-2表达明显上调(P < 0.05~0.01),VEGF、p-STAT3/STAT3和p-JAK2/JAK2的表达明显下调(P < 0.01);小鼠体内实验结果表明,与模型组比较,不同浓度ZSGJXLT(0.25、1、4 g/kg)均可显著抑制肿瘤生长(P < 0.05~0.01),抑瘤率分别为21.66%、35.52%和48.24%。结论   周氏固金消瘤汤可以通过影响JAK2/STAT3/VEGF通路的活化,发挥抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,抗血管生成等多途径抗人肺腺癌A549的作用。为开发新型抗肺癌中药复方ZSGJXLT提供了实验依据。      

miRNA-155表达对人肺癌细胞A549增殖的影响

【目的】探讨miRNA-155在正常肺组织和非小细胞肺癌组织中的表达及miRNA-155对人肺癌细胞A549增殖的影响。【方法】采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术检测15例非小细胞肺癌组织及其癌旁组织中miRNA-155的表达;A549细胞分别转染miR-NC和miRNA-155 mimic ,采用Real-time PCR技术检测转染后A549细胞中的miRNA-155表达水平,同时采用MTT 技术和流式细胞技术检测转染后A549细胞增殖情况,Western印迹法检测转染后A549细胞中Akt、p-Akt（Ser473）、p27、bcl-2、bax的表达。【结果】miRNA-155在非小细胞肺癌组织中的表达情况明显高于癌旁组织（ P ＜0．05）;与转染 miR-NC 组相比, A549细胞转染miRNA-155 mimic后miRNA-155表达水平明显增高（ P ＜0．001）,MTT实验和流式细胞技术显示miRNA-155促进A549细胞的增殖;Western印迹法结果显示：转染miRNA-155的A549细胞p-Akt （Ser473）,bcl-2的表达水平增高,p27、bax的表达水平降低。【结论】miRNA-155可能通过促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,上调p-Akt（Ser473）、bcl-2表达,同时抑制p27、bax的表达来促进非小细胞肺癌的发生发展。     

EXPRESSION DIFFERENCES OF VASCULAR GROWTH FACTORS IN HUMAN LUNG ADENOCARCINOMA CELL LINE A549 AND CISPLATIN-RESISTANT HUMAN LUNG ADENOCARCINOMA CELL LINE ADDP549

Objective To elucidate the expression differences of vascular growth factors in human lung adenocarcinoma cell line A549 and cisplatin resistant human lung adenocarcinoma cell line ADDP549.MethodsRT PCR and immunohistochemistry was used to detect the Mrna and protein expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (Bfgf) in A549 and ADDP549.ResultsVEGF and Bfgf Mrna were expressed in A549 and in ADDP549. VEGF and Bfgf Mrna expression levels in ADDP549 were significant higher than those in A549 (P＜0.025). VEGF and Bfgf protein expressions were all strong positive in A549 and ADDP549.ConclusionThere are certain differences between VEGF and Bfgf expressions in A549 and ADDP549. Drug resistance of lung cancer is associated with those above genes over expressions. Over expression of vascular growth factors are related to drug resistance of lung cancer.     

NF-κB圈套寡脱氧核苷酸联合紫杉醇对肺癌血管生成的影响

目的 探讨NF-κB圈套寡脱氧核苷酸技术（NF-κB decoy ODN ）联合紫杉醇对肺癌血管生成的影响。 方法 培养人肺癌细胞A549:⑴用脂质体瞬时转染法介导NF-κB全硫代圈套寡核苷酸(decoy ODN)和全硫代错义圈套寡核苷酸(scramble decoy ODN)处理A549 细胞;⑵分为对照组、NF-κB decoy ODN组、紫杉醇组(1 000 ng/mL)和NF-κBdecoy ODN +紫杉醇组,RT-PCR法测COX-2mRNA水平表达;⑶免疫组织化学法测VEGF蛋白表达。 结果 ⑴NF-κB decoy ODN、紫杉醇干预后A549细胞的COX-2 mRNA水平表达下降,各组浓度分别是：0.71、0.44、2.51、0.34μg/μL（F＝7.8,P＜0.05）。⑵NF-κB decoy ODN、紫杉醇干预后A549细胞的VEGF蛋白表达下降,各组细胞阳性率分别是：85%、63%、57%、21%（F＝21,P＜0.05）, 结论 NF-κB decoy ODN 联合紫杉醇可明显抑制肺癌细胞血管生成,该作用可能与COX-2、VEGF 表达相关。     

EXPRESSION DIFFERENCES OF VASCULAR GROWTH FACTORS IN HUMAN LUNG ADENOCARCINOMA CELL LINE A549 AND CISPLATIN-RESISTANT HUMAN LUNG ADENOCARCINOMA CELL LINE A_(549)~(DDP)

Objective To elucidate the expression differences of vascular growth factors in human lungadenocarcinoma cell line A549 and cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549DDP . Methods RT-PCR and immunohistochemistry was used to detect the mRNA and protein expressions of vascular endothelial growth factor ( VEGF) and basic fibroblast growth factor ( bFGF) in A549 and A549DDP . Results VEGF and bFGF mRNA were expressed in A549 and in A549DDP VEGF and bFGF mRNA expression levels in A549DDP were significant higher than those in A549 (P< 0 .025 ). VEGF and bFGF protein expressions were all strong positive in A549 and A549DDP. Conclusion There are certain differences between VEGF and bFGF expressions in A549 and A549DDP . Drug-resistance of lung cancer is associated with those above genes over-expressions. Over-expression of vascular growth factors are related to drug resistance of lung cancer.     

环氧化酶-2对肺癌血管内皮生长因子及血管形成的影响

目的探讨环氧化酶-2（COX-2）对非小细胞肺癌（NSCLC）血管内皮生长因子（VEGF）的表达及血管生成的影响。方法应用免疫组化技术检测NSCLC中COX-2、VEGF的表达和微血管密度（MVD）,采用噻唑蓝（MTT）法观察阿司匹林对肺腺癌A549细胞增殖的影响,采用免疫细胞化学法观察阿司匹林对A549细胞VEGF表达的影响。结果（1）COX-2在NSCLC组织中的阳性表达率为62.5%,COX-2表达与VEGF表达显著相关（r=0.62,P〈0.05）,COX-2阳性组MVD（49.55&#177;17.18）高于COX-2阴性组（34.65&#177;22.25）,COX-2和VEGF均阳性组MVD（51.71&#177;15.42）明显高于两者均阴性组（28.70&#177;18.94）,差异均有高度统计学意义（均P〈0.01）。（2）阿司匹林呈剂量依赖方式抑制A549细胞增殖,48h细胞最大抑制率达65.49%,10mmol/L阿司匹林作用A549细胞48h后,A549细胞VEGF表达明显降低（作用前后分别为0.109&#177;0.012与0.517&#177;0.034）,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。结论NSCLC组织中存在COX-2的高表达,其通过增加VEGF表达促进肺癌血管的形成,进而促进肺癌的进展;阿司匹林可抑制A549细胞增殖,其作用可能与下调COX-2和VEGF的表达有关。