小片段DNA阳性重组子的快速筛选

PCR扩增的小片段DNA用T载体连接,转化受体菌后观察不到典型的蓝/白斑。用插入片段的特异性引物对菌落进行PCR来筛选阳性重组子,测序鉴定结果吻合率达100％,说明当利用颜色特性挑选阳性克隆成为困难时,菌落PCR技术是一种简便、快速、可靠的筛选方法。     

PCR法直接筛选重组阳性克隆

目的　建立一个简便、可靠的重组阳性克隆的筛选方法。方法　应用扩增小鼠生精细胞凋亡相关基因时使用的引物 ,以基因重组扩增后得到的菌落为模板 ,直接进行PCR扩增。结果　在筛选的阳性菌落中可扩增到与小鼠凋亡相关基因片段大小一致的阳性条带 ;以阳性克隆提取质粒进一步进行PCR和酶切鉴定及序列分析 ,证明结果正确。结论　菌落PCR是一种简便、快速、可靠、有效的筛选重组阳性克隆的方法。     

两种菌落聚合酶链反应在抗体库筛选中的应用比较

摘要：目的：探讨两种菌落PCR方法在抗体库筛选中的应用价值。方法：分别以5个阳性克隆细菌菌落直接悬浮于去离子水中及悬浮于含0．1％的TritonX-100后经水浴煮沸作为模板，进行PCR反应。同时提取质粒DNA，进行双酶切鉴定。结果：5个克隆的菌落PCR及酶切鉴定均检测到目的基因。结论：菌落PCR可用于筛选阳性重组克隆。菌落直接加入去离子水中作为模板进行PCR反应的方法可在大规模阳性重组DNA的筛选鉴定中推广应用。     

肝细胞永生化逆转录病毒载体pLTSN的构建

目的 构建含猿猴病毒40大T抗原基因(SV40T)的逆转录病毒永生化载体pLTSN，为肝细胞永生化奠定基础。方法以质粒pUCl9-SV40T为模板，高保真PCR扩增SV40T，双粘端连接法将其克隆到pLXSN的EcoRI和BamHI位点之间，通过菌落PCR和酶切法筛选、鉴定阳性克隆并经测序验证。结果用菌落PCR和酶切法随机筛选的10个菌落中9个为阳性，阳性克隆经质粒DNA测序分析确证。结论成功构建了逆转录病毒永生化载体pLTSN。     

PCR在消减文库构建中的应用

目的：消减文库构建过程中，用PCR技术快速筛选重组阳性克隆。方法：将白色单菌落加入氯苄抗性LB培养液中，37℃摇振培养过夜，取细菌悬液作PCR模板。结果和结论：以PCR方法筛查重组阳性克隆，可以简便快速鉴定重组阳性克隆，不需提取质粒。筛选重组阳性克隆可直接用细胞悬液作PCR模板，在消减文库构建时，能大大提高工作效率。     

菌落PCR快速鉴定Bcl-2基因及测序

目的克隆大鼠Bcl-2基因(B cell lymphoma)全长cDNA,快速筛选重组pMD18-T-Bcl-2阳性克隆。方法采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体中,用单菌活PCR扩增快速鉴定DNA片段后酶切进一步鉴定及序列分析。结果在筛选的阳性克隆中扩增到大鼠Bcl-2基因,经菌落PCR、酶切鉴定及DNA序列分析证实该序列正确。结论用单菌落PCR扩增快速鉴定克隆在pMD18-T载体上的Bcl-2基因是一种简便、经济的方法。成功克隆了Bcl-2基因,为进一步研究Bcl-2cDNA的基因功能及进行基因治疗奠定了基础。     

菌落PCR快速鉴定Bcl-2基因及测序分析

目的 克隆大鼠Bcl-2基因（B cell lymphoma）全长cDNA,快速筛选重组pMD18-T-Bcl-2阳性克隆。方法 采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体中,用单菌活PCR扩增快速鉴定DNA片段后酶切进一步鉴定及序列分析。结果在筛选的阳性克隆中扩增到大鼠Bcl-2基因,经菌落PCR、酶切鉴定及DNA序列分析证实该序列正确。结论 用单菌落PCR扩增快速鉴定克隆在pMD18-T载体上的Bcl-2基因是一种简便、经济的方法。成功克隆了Bcl-2基因,为进一步研究Bcl-2 cDNA的基因功能及进行基因治疗奠定了基础。     

菌落PCR差异筛选cDNA片段文库

目的探索菌落PCR差异筛选cDNA片段文库的可行性。方法在用抑制性PCR构建cDNA片段文库的同时，分别制备正、反向减法杂交探针并用碱性磷酸酶直接标记。随后用这些探针与菌落PCR的产物杂交，从而筛选出差异表达克隆，并再次用RT-PCR证实其差异表达。结果建立的菌落PCR反应体系经济实用．方法稳定．并成功地从500个克隆中筛选出差异表达克隆。结论菌落PCR可用于差异筛选构建于质粒载体的cDNA片段文库。     

PCR在消减文库构建中的应用

目的 :消减文库构建过程中 ,用PCR技术快速筛选重组阳性克隆。方法 :将白色单菌落加入氨苄抗性LB培养液中 ,37℃摇振培养过夜 ,取细菌悬液作PCR模板。结果和结论 :以PCR方法筛查重组阳性克隆 ,可以简便快速鉴定重组阳性克隆 ,不需提取质粒。筛选重组阳性克隆可直接用细菌悬液作PCR模板 ,在消减文库构建时 ,能大大提高工作效率。     

改良菌落PCR快速鉴定TRIM28基因阳性重组子的方法研究

目的:建立简便、可靠基因克隆菌落阳性重组子的筛选方法。方法:应用普通菌落PCR和改良的菌落PCR方法对TRIM28基因的阳性重组体进行阳性重组子的分析比较,同时探讨了PCR反应体系中模板浓度和DMSO对于扩增效率的影响。并对鉴定结果为阳性的克隆进行了进一步酶切和蛋白诱导表达分析。结果:运用改良的菌落PCR法简单快捷,结果可靠,反应体系中DMSO的浓度为4%左右可以很好地促进GC富集DNA模板的PCR扩增。其方法的可靠性得到了酶切验证和重组蛋白表达证实。结论:应用改良方法可以用于快速有效地筛选阳性重组菌落。     

应用抑制消减杂交技术构建哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库

目的构建哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法采用新近建立的抑制消减杂交方法，哮喘治疗前后的嗜酸细胞为试验和对比材料，分离哮喘病人嗜酸细胞中差异表达基因的cDNA片段，将其与T载体进行T／A连接构建文库，将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选，随机挑取100个白色克隆用菌落PCR进行鉴定。结果扩增消减cDNA文库获得3000余个白色阳性克隆，随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增，90％的克隆中均有200～600bp的插入片段，这些片段可能是哮喘嗜酸细胞差异表达基因的cDNA片段。结论用SSH法及T／A克隆技术成功构建了哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库，该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆哮喘病人嗜酸细胞差异表达的新基因奠定了基础。     

日本血吸虫外分泌蛋白、跨膜蛋白基因筛选与无缝克隆

目的:探讨无缝克隆技术在构建日本血吸虫基因重组质粒中的应用价值。方法:从血吸虫基因组数据库中筛选含有信号肽或跨膜结构域的基因,截取胞外段大于110个氨基酸残基的基因片段。根据无缝克隆技术原理,设计引物。以日本血吸虫基因组DNA为模板,进行PCR扩增。纯化后的PCR产物与线性化载体p ET32c(+)/Bam HⅠ+XhoⅠ以摩尔比6∶1混和,利用Seamless cloning enzyme在25℃反应30 min。化学法将连接产物转至大肠杆菌Trans 5α,菌落PCR筛选阳性克隆。提取质粒,Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切验证后送测序。测序结果用DNAStar进行序列分析。结果:通过生物信息学软件分析,在日本血吸虫基因组数据库中共筛选到278个含有信号肽或跨膜结构域且胞外段大于110个氨基酸残基的目标基因。对其中41个单一外显子的基因进行了无缝克隆引物设计和合成。PCR成功扩增到33个基因片段,并与线性化的p ET32c(+)进行无缝克隆连接。经菌落PCR和酶切验证获得28个阳性重组质粒。测序显示28个插入基因片段序列正确。结论:利用Seamless克隆技术成功获取了一批含有日本血吸虫基因或基因片段的重组质粒,省去了传统的酶切、连接、去磷酸化等手段,节省了时间,提高了效率,为后续的日本血吸虫免疫组学的高通量抗原筛选和鉴定奠定了基础。     

视神经慢性损伤相关差异表达cDNA文库的鉴定与分析

目的:对构建的猫视神经慢性损伤相关差异表达cDNA文库进行初步克隆、鉴定和分析.方法:用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行cDNA文库扩增和蓝白斑筛选,每个文库随机挑取300个白色克隆用菌落PCR进行鉴定.对阳性克隆菌落进行DNA测序以获得差异表达基因片段序列.将测序所得的序列通过互联网用Blast程序查找日本国家DNA数据库进行同源性分析.用实时定量PCR验证差异克隆.结果:PCR鉴定获得1000个阳性菌落,测序获得674个EST片段,序列长度在200～800 bp之间.同源性分析结果提示4周正向文库得到14个同源基因,4周反向文库得到20个同源基因,8周正向文库得到23个同源基因,8周反向文库得到19个同源基因.这些基因可归类于能量代谢、物质转运、信号转导、基因转录、细胞损伤与修复、MHC分子等.实时定量PCR检测的4个克隆证实是差异表达序列.结论:本研究构建的视神经慢性损伤相关差异表达cDNA文库为进一步鉴定和研究慢性视神经损伤相关基因提供了实验基础.     

结核分支杆菌38KD蛋白基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的构建和克隆结核分枝杆菌38kD蛋白的基因，以转基因技术导入大肠杆菌，诱导表达，以获得大量38kD抗原。方法根据GenBank上编码38kD蛋白的基因系列，设计一对特异引物，通过PCR技术从结核分支杆菌H37Rv基因扩增出38kD蛋白基因片段；目的基因连接到克隆载体pMD 18-T Simple Vector，测序鉴定，目的片段双酶切下来克隆到原核表达载体pET-30a中，成功构建成带有N末6His-tag的融合表达载体。表达载体用化学转化法转化E．coli BL21（DE3），用菌落PCR筛选得到阳性克隆；经1mmol／L IPTG诱导4h表达外源蛋白；而且在37℃时蛋白表达量最高；二烷基磺酸钠一聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析结果。结果38kD序列与GenBank报道完全一致；用菌落PCR筛选得到阳性克隆；经1mmol／L IPTG诱导4h表达外源蛋白；而且在37℃时蛋白表达量最高；二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析结果显示，在大约38kD处有表达产物特异条带；可溶性分析表明，该重组蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在；纯化的包涵体纯度达到90％。结论获得38kD蛋白工程菌株，为将此抗原用于临床诊断应用打下基础。     

食管癌消减cDNA文库的构建

目的 :采用消减抑制杂交技术 ,研究正常食管粘膜和食管癌组织之间的基因表达差异状况 ,分离食管癌相关基因片段 ,构建食管癌的消减cDNA文库。方法 :以食管癌癌组织为测试子 (tester) ,以正常食管粘膜组织为驱赶子 (driver) ,用消减抑制杂交方法分离食管癌差异表达片段。将该差异表达片段克隆至T载体 ,经蓝白斑筛选后 ,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒 ,构建食管癌消减cDNA文库。结果 :用消减抑制杂交技术分离食管癌差异表达片段 ,经蓝白斑筛选 ,得到 2 2 0个白色克隆 ;再用PCR方法快速筛选出 10 0个两端分别含连接子Adaptor1及Adaptor2R的阳性重组质粒 10 0个 ,从而成功地构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。结论 :构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。消减抑制杂交技术能快速有效地分离差异表达基因 ,方法简便、灵敏度高。使用PCR法快速筛选阳性克隆 ,对于消减文库的构建具有重要意义     

食管癌消减cDNA文库的构建

目的：采用消减抑制杂交技术,研究正常食管粘膜和食管癌组织之间的基因表达差异状况,分离食管癌相关基因片段,构建食管癌的消减cDNA文库。方法：以食管癌组织为测试子（tester),以正常食管粘膜组织为驱赶子（driver),用消减抑制杂交方法分离食管癌差异表达片段。将该差异表达片段克隆至T载体,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建食管消减cDNA文库。结果：用消减抑制杂交技术分离食管癌差异表达片段,经蓝白斑筛选,得到220个白色克隆;再用PCR方法快速筛选出100个两分别含连接子Adaptor1及Adaptor2R 的阳性重组质粒100个,从而成功地构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。结论：构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。消减抑制杂交技术能快速有效地分离差异表达基因,方法简便、灵敏度高。使用PCR法快速筛选阳性克隆,对于消减文库的构建具有重要意义。     

隐孢子虫鼠基因型糖蛋白GP900下段基因的克隆和鉴定

目的构建隐孢子虫鼠基因型糖蛋白GP900下段基因的克隆载体。方法采用巢式PCR方法扩增目的基因片段GP900下段,PCR产物纯化后,将目的片段与载体连接,将连接产物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中,对所得菌落进行阳性克隆的筛选,鉴定阳性结果后进行基因测序。结果成功构建GP900下段基因的克隆载体。结论GP900F段基因克隆载体的构建为下一步表达GP900、研究GP900蛋白功能及其在隐孢子虫侵入靶细胞中的作用、研制疫苗奠定了基础。     

碱性成纤维细胞生长因子真核荧光表达载体的构建

目的：构建可在真核细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的真核表达载体,为进一步开展bFGF基因治疗缺血性脑血管疾病奠定基础。方法：①采用线栓法建立SD大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型,取缺血灶周围脑组织经逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增bFGF基因;②将bFGFDNA克隆到pGEM-TEasy质粒,经菌落PCR和HindⅢ和EcoRI双酶切鉴定;③然后将bFGF DNA亚克隆到pEGFP-N3质粒;通过抗性基因筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切和测序鉴定。结果：菌落PCR、酶切和DNA序列鉴定均证实插入片段与GenBank报道的bFGF基因序列一致。结论：经RT-PCR反应得到了特异的bFGF基因片段并成功构建了bF-GF荧光真核表达载体。     

人脑髓鞘碱性蛋白cDNA重组质粒pRK41转化及全长编码区体外扩增

作者将含人脑髓鞘碱性蛋白(MBP)编码区和3’端非翻译区(1.2kb)的重组质粒pRK41—1.2转化宿主菌E.coli JM109,用非同位素标记鼠MBP cDNA克隆片段作探针,经菌落原位杂交筛选出阳性克隆并以此为模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增出含21.5kd MBP全长编码序列(600bp),又经限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ消化,电泳结果进一步证实该PCR产物的特异性,为人MBP全长编码序列。     

人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达。方法：用RT-PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落,用EcoRⅠ酶切获取目的片段,并与EcoRⅠ酶切过的pGEX-4T-1质粒连接,重组子转化BL21感受态大肠杆菌,PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega 2．0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX-4T-1融合蛋白表达,用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定,薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果：PCR扩增等方法证实,人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功,其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98．73％,氨基酸序列同源性为99．68％。Western blot检出GST-hTERT融合蛋白,其表达量达28．4％。结论：成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。