人脐血单个核细胞诱导分化为神经元样细胞

目的 探讨人脐血单个核细胞体外向神经元样细胞定向诱导分化的条件。方法 无菌条件下采集正常人脐血,分离单个核细胞。用DMEM/F12培养基进行纯化和扩增培养。取扩增5代的间充质干细胞(MSC),分别用β-巯基乙醇(β-ME)、二甲基亚砜(DMSO)、神经条件培养液诱导脐血MSC向神经元样细胞分化。免疫组化法检测脐血MSC的Nestin表达和神经元样细胞特异性标志。结果 脐血原代和2、5代MSC的Nestin表达阳性率分别为6.7%、12.4%和20.8%。神经条件培养液诱导神经元样细胞阳性率最高达36%,β-ME、DMSO分别为33%和25%。结论 脐血MSC具有神经干/祖细胞的特性,在一定条件下能向神经元样细胞分化。     

人脐血间充质干细胞的分离培养与向神经元样细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨来源于人脐血的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化成神经元样细胞的可行性，以及在体外分离、纯化和扩增的条件。方法 无菌条件下收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血，经肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞，以偏酸性的Mesencult^TM作为培养基进行培养和纯化，获得贴壁细胞，取扩增第三代后的MSCs向神经元样细胞诱导分化。用免疫荧光标记方法检测神经元特异性标记物。结果 来源于脐血的单个核细胞种植于特定的培养基中后，可产生贴壁细胞，主要表现为破骨样和间充质样细胞；传3代后，这些细胞可得到纯化、扩增；免疫组化标记显示经诱导后的MSCs表达神经丝蛋白(NF)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)。结论 源于脐血的MSCs在体外可以培养、扩增，并向神经元样细胞分化，可作为神经干细胞的来源而用于实验研究和临床。     

脐血单个核细胞体外定向分化为神经干细胞及其致瘤性的实验研究

目的：探讨人脐血单个核细胞的分离培养和诱导后神经干细胞标志物mRNA的表达，并观察其致瘤性。方法：使用密度梯度离心法得到脐血单个核细胞，用体外贴壁生长的方法获得脐血间质干细胞（MSCs）。观察培养过程中脐血MSCs形态的变化，通过流式细胞仪检测干细胞表面抗原的表达。使用NGF和RA联合诱导后，用RT—PCR方法鉴定诱导前后神经干细胞（NSCs）标志物巢蛋白（Nestin）及Musashi-1蛋白mRNA的表达；收集培养后7d的MSCs，接种于裸鼠皮下，观察是否有增生物的出现，并观察细胞组织形态学变化。结果：脐血单个核细胞贴壁生长后大部分细胞呈梭形，诱导后可分化为神经元样细胞。流式细胞仪检测该细胞不表达CD34，CDlla和CDllb，强表达CD29，符合MSCs特征。诱导后，NSCs表面标志Nestin及Musashi-1表达明显增强（P〈0．05），48h达高峰，然后逐渐减弱；细胞接种后12周．在裸鼠皮下不能形成肿瘤，与对照组相比，细胞形态学未出现恶性变化。结论：脐血中存在MSCs，分离后可以体外扩增．诱导后分化为神经元样细胞，并表达NSCs表面标志。在裸鼠体内不具有成瘤性。脐血能够成为NSCs的新来源。     

大鼠骨髓间质干细胞定向分化为神经元的实验研究

【目的】研究体外培养骨髓来源的表达nestin的成年大鼠骨髓间质干细胞（MSC）并诱导分化神经元样细胞的潜能，为中枢神经系统疾病的细胞移植治疗提供理想的供体。【方法】采用全骨髓法分离培养成年SD大鼠MSC，传至第6代的MSC接种在前一天涂有100ug／L多聚赖氨酸的塑料培养瓶或培养皿中，用含100mL／LFBS的DMEM／F12培养液添加10ng／mLbFGF的培养液培养并以DMSO、BHA与Forskolin等诱导剂联合诱导MSC分化为神经元。流式细胞仪鉴定诱导前MSC的细胞表面抗原，免疫荧光检测诱导前及诱导后6h、12h、24h神经元特异性抗原nestin、NF-200和GFAP表达率。【结果】流式细胞仪检测传至第6代MSC表面抗原CD29和CD44阳性率分为98．8％，96．6％，CD34和CD45阴性。免疫荧光鉴定传至第6代的MSC表达nestin阳性率为57．1％±6．9％，不表达NF-200和GFAP。诱导后30min可见神经元样细胞出现，诱导后6h、12h、24h经nestin和NF．200免疫荧光鉴定，诱导后6h、12h、24hnestin阳性率分别为96．5％±1．9％，88．1％±5．4％，33．5％±5．4％，NF-200阳性率分别为90．1％±2．9％，97．5％±1．3％，98．1％±1．6％。【结论】骨髓来源的nestin阳性的MSC具有神经祖细胞特性并且可诱导分化为神经元样细胞，可作为种子细胞用于神经系统疾病的治疗。     

人脐带血细胞分化为神经样细胞的实验研究

为探讨人脐带血细胞分化为神经样细胞的可行性 ,无菌条件下采集正常人脐血 5 0～ 10 0mL置于加有抗凝剂的采血袋中 ,分离脐血单个核细胞进行培养 ,并加入细胞因子加以诱导分化 ,利用免疫细胞化学方法进行鉴定。结果显示 :脐血单个核细胞能在体外培养中增生分化和表达干细胞特异性抗原神经巢蛋白 (nestin) ,并最终分化为神经元样和神经胶质样细胞。免疫组化染色可见神经元特异性烯醇化酶 (NSE)和胶质原性纤维酸性蛋白 (GFAP)抗原表达。碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)和表皮生长因子 (EGF)协同作用对脐血细胞的分化有促进作用。提示 :脐血单个核细胞具有增生和分化潜能 ,可分化为神经元样及神经胶质细胞样细胞 ,可以作为神经细胞的种子细胞。     

人脐血干细胞培养及其向神经元样细胞定向诱导分化的研究

目的：通过体外培养脐血干细胞并诱导分化为神经元样细胞，为研究脐血干细胞移植修复脊髓损伤奠定基础。方法：用密度梯度离心法将脐血单个核细胞从脐血中分离出来，置于含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养、扩增、传代，取体外扩增5代的脐血间充质干细胞（MSCs），接种于培养板内，将诱导剂3－叔丁基4－羟基茴香醚（BHA）和二甲基亚砜（DMSO）加入条件培养基静置培养，观察细胞的形态学和组织学变化，取神经元样细胞进行免疫组化检测细胞表面标志物神经元烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）及胶质纤维酸性蛋白（GFAP），然后，在光镜下随机数取10个非重叠视野(×100), 计算NSE、NF及GFAP阳性细胞占总细胞数的比例，实验结果用统计学分析。结果:光镜下hMSC在预诱导液中处理24?h后,加入诱导液,1?h后细胞形态发生变化,原来宽大扁平的hMSCs胞质向核收缩,胞体向胞核收缩成锥形且变得致密并有折光性,有较多的长突起,6?h后多数细胞均转变为类似于神经元的形态，3?d后免疫组化检测NSE、NF及GFAP的阳性率分别为（35.24±3.63）％、（33.46±3.21）％、（15.12±1.65）%。结论:脐血MSC在体外有较强的扩增能力,并且在一定条件下可以诱导成为神经元样细胞。     

脐血单个核细胞体外分离和定向分化为神经干细胞的实验研究

目的 探讨人脐血单个核细胞的分离培养和诱导后神经干细胞(NSCs)标志物mRNA的表达.方法 使用密度梯度离心法得到脐血单个核细胞,用体外贴壁生长的方法获得脐血间质干细胞(MSCs),观察培养过程中脐血MSCs形态的变化,通过流式细胞仪检测干细胞表面抗原的表达,使用NGF和RA联合诱导后,用RT-PCR方法鉴定诱导前后NSCs标志物巢蛋白(nestin)及Musashi-1蛋白mRNA的表达.结果 脐血单个核细胞贴壁生长后大部分细胞呈梭形,诱导后可分化为神经元样细胞.流式细胞仪检测该细胞不表达CD34、CD11a、CD11b和强表达CD29,符合MSCs特征.诱导后,NSCs表面标志Nestin及Musashi-1表达明显增强,48h达高峰,然后逐渐减弱.结论 脐血中存在间质干细胞,分离后可以体外扩增,诱导后分化为神经元样细胞,并表达NSCs表面标志.脐血能够成为NSCs的新来源.     

脐血单个核细胞体外定向分化为神经干细胞及其致瘤性的实验研究

目的:探讨人脐血单个核细胞的分离培养和诱导后神经干细胞标志物mRNA的表达,并观察其致瘤性。方法:使用密度梯度离心法得到脐血单个核细胞,用体外贴壁生长的方法获得脐血间质干细胞(MSCs)。观察培养过程中脐血MSCs形态的变化,通过流式细胞仪检测干细胞表面抗原的表达。使用NGF和RA联合诱导后,用RT-PCR方法鉴定诱导前后神经干细胞(NSCs)标志物巢蛋白(Nestin)及Musashi-1蛋白mRNA的表达;收集培养后7d的MSCs,接种于裸鼠皮下,观察是否有增生物的出现,并观察细胞组织形态学变化。结果:脐血单个核细胞贴壁生长后大部分细胞呈梭形,诱导后可分化为神经元样细胞。流式细胞仪检测该细胞不表达CD34,CD11a和CD11b,强表达CD29,符合MSCs特征。诱导后,NSCs表面标志Nestin及Musashi-1表达明显增强(P<0.05),48h达高峰,然后逐渐减弱;细胞接种后12周,在裸鼠皮下不能形成肿瘤,与对照组相比,细胞形态学未出现恶性变化。结论:脐血中存在MSCs,分离后可以体外扩增,诱导后分化为神经元样细胞,并表达NSCs表面标志。在裸鼠体内不具有成瘤性。脐血能够成为NSCs的新来源。     

脂肪组织来源的基质细胞向神经元样细胞分化

目的：研究脂肪来源的基质细胞向神经元样细胞分化的可能性，为神经移植探索新的细胞来源。方法：采用β-巯基乙醇诱导脂肪来源的基质细胞向神经元样细胞分化，以免疫细胞化学方法对分化的和未分化的细胞进行鉴定。结果：从成年大鼠的脂肪组织中分离出基质细胞，在体外生长形态类似成纤维细胞，可以维持在未分化状态稳定增殖，体外扩增可超过10多代。β-巯基乙醇可诱导这种细胞向神经元样细胞分化，分化的细胞早期表达巢蛋白，后期则表达神经元的标志物——神经元特异性烯醇化酶和神经微丝，在最适合的诱导条件下约60％～85％的细胞表达这两种神经元的标志物。结论：脂肪组织中存在能分化为神经元样细胞的干细胞。     

成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的体外研究

目的 探索成人骨髓间充质干细胞在体外定向分化为神经元样细胞的条件。方法 采用Ficoll-paque(1．077g／m1)分离液密度梯度离心从人的骨髓分离出骨髓间充质干细胞，体外扩增到第10代，选择4组不同组合的神经分化诱导条件，分别诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化，通过免疫细胞化学鉴定诱导后细胞神经元烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白的表达情况。结果各组诱导剂诱导后，骨髓间充质干细胞分化为具有典型的神经元形态的细胞，免疫细胞化学显示、NF-M呈强阳性反应，NSE表达强度提高，在最佳的分化条件下，即加入bFGF、ATRA、BME、BHA、DMSO诱导条件下，大约80％细胞表达NF—M，86％的细胞为NSE强阳性。结论 成人MSCs在体外可定向诱导分化为神经元样细胞，且具有较高的阳性分化率。     

成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的逆转化现象

目的 研究成人骨髓问充质干细胞(hMSC)分化为神经元样细胞后的逆转化现象。方法 从成人骨髓分离、培养和扩增hMSC。用参芪液诱导hMSC分化为神经元样细胞，并用免疫组化方法鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。采用RT-PCR方法检测10个基因(内胚层基因ceruloplasmin；中胚层基因SM22；外胚层基因Amyloid precursor protein,syntaxin；生殖系基因protamine；神经元特异性基因Neuro D、NF、NSE、GFAP、Tau)在诱导分化为神经元样细胞的动态变化以及逆转化细胞的基因表达变化。结果 hMSC经参芪液诱导后，可见神经元样细胞。免疫组化显示诱导出的神经元样细胞表达NSE、NF阳性，GFAP阴性。去除参芪液，观察到神经元样细胞又恢复为hMSC的外形，呈现宽大扁平或长梭形。基因检测显示逆转化的细胞基因表达与未分化hMSC相似。结论 参芪液可以促进hMSC分化为神经元样细胞，诱导分化过程可以出现逆转化现象。     

脑源性神经营养因子体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的探讨脑源性神经营养因子(BDNF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞的作用及其对诱导后的神经元样细胞保护作用，为治疗神经系统疾病提供更优良的细胞。方法体外培养MSCs至第5代后，分别用BDNF、β-巯基乙醇(β-ME)诱导MSCs，诱导后的第1、3和6小时计算两组神经元样细胞数，对各时间点两组神经元样细胞阳性率进行了比较；诱导后行神经细胞标记抗体的免疫细胞化学、RT-PCR及蛋白质印迹鉴定。结果两组诱导剂诱导后的细胞均呈神经元样细胞的形态；BDNF组诱导分化后细胞的存活时间远较β-ME组长；BDNF组在诱导后6h近于诱导高峰，而β-ME在诱导2h即达高峰，但随后神经元样细胞渐死亡。免疫细胞化学结果显示在两组诱导后细胞的巢蛋白(Nestin)、神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(NF)表达均呈阳性，而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达呈阴性；RT-PCR显示NSE、NFL，MAP-2的mRNA表达阳性，GFAP有较弱的表达；蛋白质印迹可见两组诱导剂诱导的细胞均表达神经元的特异性标记抗体NSE。结论BDNF能单独诱导MSCs分化形成神经元样细胞．而且分化后细胞的存活时间长．有望用于治疗脑缺血、神经变性等疾病。     

当归诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的：研究当归体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的作用。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养。MSC用20μl当归注射液／ml含10％胎牛血清的L—DMEM为预诱导条件，预诱导24h后用当归注射液100μl/ml不含胎牛血清的L—DMEM进行诱导。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。当归诱导3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE及nestin呈阳性、GFAP性。结论:大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的逆转化现象

目的 研究成人骨髓间充质干细胞(hMSC)分化为神经元样细胞后的逆转化现象.方法 从成人骨髓分离、培养和扩增hMSC.用参芪液诱导hMSC分化为神经元样细胞,并用免疫组化方法鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.采用RT-PCR方法检测10个基因(内胚层基因ceruloplasmin;中胚层基因SM22:外胚层基因Amyloid precursor protein、syntaxin;生殖系基因protamine;神经元特异性基因Neuro D、NF、NSE、GFAP、Tau)在诱导分化为神经元样细胞的动态变化以及逆转化细胞的基因表达变化.结果 hMSC经参芪液诱导后,可见神经元样细胞.免疫组化显示诱导出的神经元样细胞表达NSE、NF阳性,GFAP阴性.去除参芪液,观察到神经元样细胞又恢复为hMSC的外形,呈现宽大扁平或长梭形.基因检测显示逆转化的细胞基因表达与未分化hMSC相似.结论 参芪液可以促进hMSC分化为神经元样细胞,诱导分化过程可以出现逆转化现象.     

成人骨髓间质干细胞诱导分化为神经元样细胞及其与细胞分裂的关系

目的探讨成人骨髓间质干细胞(hMSC)向神经元样细胞分化过程中分化与细胞分裂的关系。方法从成人骨髓中分离骨髓间质干细胞(MSC),培养扩增。用参芪液诱导MSC分化为神经元样细胞,经免疫组化鉴定其神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。诱导后进行神经元样细胞计数,掺入Brdu测定,计算标记系数。采用双标记间接免疫荧光法检测神经元样细胞特异性表面标记(NSE、NF)与细胞分裂的标记Brdu的关系。抑制DNA合成,计算Brdu、NSE和NF阳性细胞数。结果MSC经参芪液诱导后,可见神经元样细胞。免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF阳性,GFAP阴性。MSC诱导分化后的细胞总数增加,诱导分化后12h内细胞增殖较快。30%以上分化的神经元样细胞在表达NSE和NF的同时可见Brdu标记,而另一部分分化的神经元则无Brdu标记。抑制DNA合成,并不会阻止神经元的分化,仍有70%的分化神经元表达神经元特异性标记蛋白NSE。结论MSC诱导分化的部分神经元样细胞可进行细胞分裂,但抑制细胞分裂不影响神经元分化。     

差速贴壁法分离培养早期人胚骨髓间充质干细胞

目的:探讨差速贴壁法从早期人胚股骨分离、纯化骨髓间充质干细胞(MSCs)的可行性,并观察培养细胞是否向神经元样细胞诱导分化。方法:取2～3月龄新鲜健康流产人胚股骨,切碎,接种玻璃培养瓶内培养8～12h,待较多的成纤维细胞贴壁,立刻将未贴壁细胞转种至塑料培养瓶培养,并多次传代;用甲氧酚(BHA)和二甲亚砜(DMSO)诱导培养的细胞,免疫细胞化学方法检测诱导后细胞神经元烯醇化酶(NSE)、神经巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达情况。结果:原代培养3d可见塑料培养瓶内有长梭形细胞生长,至第10天前后形成集落样克隆,传至第4代后呈单层漩涡状排列的长梭形的成纤维样细胞,已无明显细胞克隆形成,经多次传代,细胞保持良好的增殖能力和稳定的性状;免疫细胞化学方法显示未诱导细胞NSE、Nestin、GFAP阴性,诱导后细胞NSE、Nestin呈阳性,GFAP阴性,间接证实培养所得细胞是MSCs。结论:差速贴壁培养法从早期人胚股骨中分离纯化MSCs,去除可能的成纤维细胞污染,是简便有效的,可供有关研究参考选择。     

特定微环境下诱导脐血间充质干细胞向神经细胞的分化

目的 在体外分离培养人脐血间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs),探讨脐血间充质干细胞体外培养生长特性及向神经细胞分化的诱导条件.方法 在体外将脐血MSCs进行向神经细胞的定向诱导,观察脐血MSCs的形态变化,并在诱导后第5天用免疫荧光染色检测脐血MSCs中神经元细胞特异性的标志物;并与单纯低糖DMEM培养基培养的对照组脐血MSCs相比较.结果 诱导组中的脐血MSCs生长伸展,形成突起,呈放射状,并可互相形成连接,免疫荧光显示特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase,NSE)阳性,表现出神经元细胞的特性.而对照组中的脐血MSCs未形成神经样形态结构,免疫荧光NSE阴性.结论 脐血MSCs可在体外经化学方法 定向诱导分化为神经细胞,可应用于神经修复及再生等领域.