地塞米松快速抑制大鼠背根神经节细胞中ATP所致的钙升高

目的 通过观察地塞米松对大鼠背根节神经元中ATP所致的细胞内游离钙离子浓度(intracellular calcium concentration,[ca2+]i)升高的影响,了解糖皮质激素是否通过非基因组作用影响初级感觉神经元的兴奋性.方法 分离、培养大鼠背根神经节细胞,采用激光共聚焦技术观察地塞米松对培养神经元ATP所致的[Ca2+]i升高的影响.结果 ATP(100 μmol/L)可导致背根节神经元[Ca2+]i升高,是由P2X受体介导细胞外Ca2+内流所致;地寨米松预孵育5 min可剂量依赖性地抑制背根节神经元ATP所致的[Ca2+]i升高,地塞米松的抑制作用可被糖皮质激素受体拮抗剂RU38486(10 μmol/L)、蛋白激酶A抑制剂H-89(10 μmol/L)所阻断.结论 地塞米松通过糖皮质激素受体激活细胞内蛋白激酶A信号途径可显著抑制大鼠背根节神经元ATP所致的[Ca2+]i升高.糖皮质激素可通过非基因组作用影响初级感觉神经元的ATP/P2X受体功能而参与痛觉的调制.     

吗啡对大鼠培养海马神经元钙离子作用机制的研究

目的 研究吗啡对海马神经元游离子浓度([Ca^2 ]i)影响的机制，探索吗啡成瘾的神经生物学机制及对吗啡成瘾可能的治疗途径。方法 运用新型荧光探针Fluo-4 , 利用激光共聚焦显微镜研究吗啡对大鼠培养海马神经元[Ca^2 ]i作用机制。结果 10μmol/L吗啡急性刺激引起海马神经元[Ca^2 ]i升高，μ阿片受体选择性拮抗剂CTOP（1μmol/L）不能阻断吗啡引起的细胞内[Ca^2 ]i增加，δ2阿片受体选择性拮抗剂Naltrindole(1μmol/L）阻断了吗啡引起的细胞内[Ca^2 ]i反应，特异性的内质网钙泵抑制剂Thapsigargin(TG,1μmol/L）预处理海马神经元组断吗啡引起的细胞内[Ca^2 ]i增加，L－钙通道阻断剂Verapamil(20μmol/L）预处理海马神经元不能完全抑制吗啡引起的细胞内[Ca^2 ]i增加；100μmol/L吗啡长时程（24h）作用于海马神经元，细胞内[Ca^2 ]i升高，加入10μmol/L纳络酮急性戒断后，不能阻断细胞内[Ca^2 ]i升高，反而引起[Ca^2 ]i异常升高。结论 吗啡急性刺激引起的海马神经元内钙增加主要来源于δ2阿片受体介导的IP3敏感的钙库释放。     

环匹阿尼酸对大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度的影响

目的研究环匹阿尼酸(CPA)对大鼠远端肺静脉平滑肌细胞(PVSMC)细胞内钙浓度([Ca2+]i)的影响及可能机制。方法原代培养大鼠远端PVSMC,并通过形态学和免疫荧光染色鉴定,利用荧光显微镜和InCyte细胞内钙浓度检测系统观测高钾(60 mmol/L KCl)溶液及CPA对PVSMC的[Ca2+]i影响。结果原代培养的PVSMC表现出典型血管平滑肌细胞生长特征,并对平滑肌α-actin免疫荧光染色呈阳性反应;高钾溶液使PVSMC的[Ca2+]i显著升高,5μmol/L硝苯地平能完全阻断PVSMC的[Ca2+]i对高钾溶液的反应;10μmol/LCPA能使含5μmol/L硝苯地平的无钙Krebs溶液孵育的PVSMC的[Ca2+]i短暂小幅升高,恢复细胞外Ca2+至2.5 mmol/L后,10μmol/L CPA能使含5μmol/L硝苯地平的Krebs溶液孵育的PVSMC的[Ca2+]i迅速升高。结论 CPA能够使大鼠远端PVSMC的[Ca2+]i升高,其机制可能与Ca2+从肌浆网释放,并诱发细胞外Ca2+通过钙池操纵性钙通道(SOCC)内流有关。     

睫状神经营养因子对毒胡萝卜素所致大鼠海马神经元[Ca2+]i升高的抑制作用

目的:观察睫状神经营养因子(CNTF)对内质网钙泵特异性抑制剂毒胡萝卜素(thapsigargin,Tg)引起海马神经元内胞质游离Ca2 浓度([Ca2 ]i)升高的抑制作用.方法:出生24 h以内SD大鼠海马神经元原代培养10～14 d备用,以活细胞内荧光探针Frua2/AM 实时检测[Ca2 ]i.实验分3组:A组(n=20),EGTA(3 mmol/L);B组(n=40),EGTA(3 mmol/L) Tg(10 μmol/L);C组(n=12),EGTA(3 mmol/L) Tg(10 μmol/L) CNTF(500 U/μl).结果:用足量EGTA螯合细胞外Ca2 后,测得[Ca2 ]i≤(30.73±7.25) nmol/L;加入EGTA Tg后,[Ca2 ]i显著升高([Ca2 ]i≥[91.55±12.24] nmol/L);加入EGTA Tg CNTF后,升高的[Ca2 ]i明显降低([Ca2 ]i≤[26.09±7.16] nmol/L,P<0.01).结论:CNTF可明显减弱Tg的钙库质膜钙泵抑制作用,使胞质[Ca2 ]i降低.提示CNTF通过增加胞内钙库对细胞内游离Ca2 的吸收作用来降低海马神经元的Ca2 负荷.     

乙醇对颈上神经元细胞内外钙信号的双重作用

目的:探讨乙醇对原代培养颈上神经节神经元(SCGs)细胞质钙稳态的影响。方法:分散、培养新生12 h内大鼠SCGs,应用激光共聚焦显微技术,观察不同浓度乙醇对SCGs细胞质Ca2+浓度([Ca2+]i)的作用。结果:KCl及钙离子载体A23187所诱发的[Ca2+]i增高,可被乙醇(100 mmol/L)显著抑制,但是乙醇(30,100,600 mmol/L)自身却可浓度依赖性增加[Ca2+]i,并且使用无Ca2+外液和氯化镉对该增加作用无影响。结论:乙醇可抑制细胞外Ca2+内流,同时增加细胞质[Ca2+]i,来源可能是胞内钙库的释放。     

PKA参与ATP对大鼠背根神经节神经元电压门控性钙通道的抑制

目的 探讨ATP对大鼠背根神经节(DRG)神经元的电压门控性钙通道(VGCC)的抑制效应及其信号转导途径.方法 在急性分离的大鼠DRG神经元上应用全细胞膜片钳技术记录ATP诱导的电流以及VGCC电流;应用钙离子成像技术检测胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的变化.结果 ATP能够可逆性地抑制DRG神经元的VGCC电流和VGCC介导的[Ca2+]i升高.用PKA抑制剂H-89预处理DRG神经元,ATP对VGCC电流及其介导的[Ca2+]i升高的抑制被反转;而用PKC抑制剂bisindolylmaleimide(Bis)预处理DRG神经元,ATP对VGCC介导的[Ca2+]i升高的抑制效应则无影响.结论 在大鼠DRG神经元中,PKA参与了ATP对该神经元VGCC的抑制.     

三氧化二砷对海马神经元细胞内钙离子浓度的影响

目的 研究三氧化二砷(As2O3)对海马神经元细胞内钙离子([Ca2 ]i)浓度的影响与其神经毒性的可能机制.方法 用激光共聚焦显微镜结合Fluo-3-AM观察As2O3对大鼠原代培养的海马神经元[Ca2 ]i的影响.结果 有钙液中10 μmol/L、100 μmol/L As2O3升高海马神经元[Ca2 ]i与对照组相比[Ca2 ]i分别提高了0.24±0.09和0.41±0.08.20 μmol/L的维拉帕米不能阻断10 μmol/L As2O3升高[Ca2 ]i作用.无钙液中10 μmol/L、100 μmol/Ls2O3升高海马神经元[Ca2 ]i与对照组相比[Ca2 ]i分别提高了0.12±0.06和0.30±0.07.100 μmol/L 2-APB阻断了10 μmol/L As2O3升高[Ca2 ]i作用.结论 As2O3可以升高海马神经元[Ca2 ]i,IP3信号转导途径可能参与As2O3升高海马神经元[Ca2 ]i.     

人参皂苷Rg1对吗啡依赖海马神经元胞内游离钙离子浓度的影响

目的探讨人参皂苷Rg1对吗啡依赖海马神经元胞内游离钙离子浓度(intracellular free Ca2+concentration,[Ca2+]i)的影响。方法采用荧光钙离子指示剂Fluo-3/AM,利用激光扫描共聚焦显微镜观察低剂量(1μmol/L)、中剂量(10μmol/L)、高剂量(100μmol/L)人参皂苷Rg1处理吗啡依赖原代培养大鼠海马神经元后[Ca2+]i的改变。结果低、中、高剂量人参皂苷Rg1单独处理海马神经元前后并没有引起胞内[Ca2+]i的显著改变(P>0.05),而吗啡依赖海马神经元胞内[Ca2+]i较正常海马神经元细胞明显增高(P<0.01)。此外,低、中、高剂量人参皂苷Rg1处理吗啡依赖海马神经元细胞后,均能显著抑制胞内[Ca2+]i的升高(P<0.01),并呈剂量依赖性,Rg1剂量越大,抑制作用越明显(P<0.01)。结论人参皂苷Rg1可以抑制吗啡依赖海马神经元细胞内[Ca2+]i的增高,对吗啡的成瘾性具有明显的拮抗作用,为合理安全有效地应用人参戒毒提供了实验依据。     

五味子酮对β-淀粉样蛋白诱导大鼠海马神经元内游离钙离子浓度变化的影响

目的观察中药五味子酮对β-淀粉样蛋白(Aβ25~35)诱导的大鼠海马神经元内游离钙离子浓度([Ca2+]i)变化的影响。方法采用大鼠海马神经元原代培养技术,运用双激发波荧光指示剂Fura-2/AM标记胞内相对[Ca2+]i的变化并进行比较。结果1μmol/L Aβ25~35作用于海马神经元48 h后,[Ca2+]i为0.5951±0.0311,明显高于空白对照组的0.3617±0.0197(P<0.05);1μmol/L Aβ25~35和100μmol/L五味子酮共同作用于海马神经元48 h后,[Ca2+]i为0.4168±0.0468,仍明显高于空白对照组(P<0.05),但较单纯Aβ25~35作用后明显下降(P<0.05)。结论中药五味子酮可以通过抑制Aβ诱导的神经元[Ca2+]i增加,维持细胞内钙稳态,对神经元有一定的保护作用。     

GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂RGDS对血小板聚集和胞浆游离钙的影响

[目的]探讨血小板GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂RGDS对血小板聚集和血小板[Ca2+]i的影响.[方法]比浊法测定PAG;采用Fura-3/AM荧光探针标记血小板胞浆钙离子,使用共聚焦显微镜观察单个血小板荧光强度的变化,计算机图像系统分析血小板[Ca2+]i的变化.[结果]凝血酶(0.03 U/mL)为激动剂时,血小板PAG(M)为(78.2±12.4)%.在所取的62.5～1 000μmol/L RGDS内的5种浓度下,RGDS可呈浓度依赖性地抑制凝血酶诱导的PAG(M).正常人静息血小板[Ca2+]i荧光强度值为376.1±70.5;凝血酶(0.03 U/mL)激动的血小板[Ca2+]i荧光强度值升高为977.9±108.8;GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂RGDS(250 μmol/L)对静息血小板的[Ca2+]i荧光强度值无抑制作用;GPⅡ b/Ⅲa受体拮抗剂RGDS(250μmol/L)作用于血小板后,凝血酶(0.03 U/mL)激动的血小板[Ca2+]i荧光强度值升高受到抑制,抑制率为(9.37±7.5)%.[结论]凝血酶(0.03 U/mL)可以引起血小板的聚集和血小板[Ca2+]i的升高.GP Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂RGDS可以抑制凝血酶(0.03 U/mL)引起的血小板聚集和[Ca2+]i的升高.     

小檗碱对急性分离成年大鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度的影响

目的　研究小檗碱对急性分离大鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度 ([Ca2 + ] i)的影响。方法　采用酶解法分离单个大鼠心肌细胞 ,用钙敏感的荧光指示剂Fluo 3/AM染色 ,以荧光强度 (FI)来代表 [Ca2 + ] i,应用激光扫描共聚焦显微镜实时监测FI的变化。结果　在静息状态下 ,小檗碱 (3～ 1 0 0 μmol/L)对 [Ca2 + ] i 无影响。 3～ 1 0 0 μmol/L小檗碱对KCl 60mmol/L介导的钙内流也无影响。但小檗碱 (30和 1 0 0 μmol/L)对caffeine 1 0mmol/L引起的钙动员有明显促进作用 (P <0 .0 1 )。结论　小檗碱对于KCl通过电压依赖性钙通道 (VDC)介导的 [Ca2 + ] i 升高无影响 ;但小檗碱 (30和 1 0 0 μmol/L)可能通过影响RyRs而促进肌浆网 (SR)内钙外流 ,也可能对SR钙摄取 ,钙的跨膜转运及Na+ Ca2 + 交换有抑制作用     

大鼠肠肌间神经元胃动素受体的表达及胃动素引起神经元内钙信号的机制

目的观察大鼠肠肌间神经元胃动素受体(MTLR)的表达,并探讨胃动素引起神经元内钙信号的机制。方法采用免疫荧光双标技术观察大鼠肠肌间神经元MTLR的表达;应用激光共聚焦显微镜技术检测不同药物处理组胃动素引起的单个神经元内Ca2+荧光强度的变化。结果大鼠肠肌间神经元呈MTLR免疫反应阳性表达;在Hank's液中,10-6mol/L胃动素可引起神经元内Ca2+浓度的显著升高,其峰高(峰值减去静息值)为30.6±3.7,荧光强度相对变化百分比为(100.8±18.4)%。在D-Hank's液(去除细胞外Ca2+)中或用L型钙离子通道阻断剂维拉帕米预处理细胞后,胃动素可轻度升高胞内Ca2+浓度。与单独应用胃动素组相比差异有统计学意义(P<0.05)。当分别用G蛋白拮抗剂NEM和PLC抑制剂Compound48/80预处理细胞后再加入胃动素,胞内Ca2+浓度升高的程度明显降低,与单独应用胃动素组相比差异有统计学意义(P<0.05)。当用PKC抑制剂D-鞘氨醇预处理细胞后,再加入胃动素,其峰高和荧光强度相对变化百分比同单独应用胃动素组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论大鼠肠肌间神经元能自身表达MTLR。胃动素可明显升高神经元内Ca2+浓度,胞内Ca2+浓度的升高既源于外钙的内流又源于内钙的释放。外钙的内流主要通过L型Ca2+通道,G蛋白偶联型MTLR-PLC-IP3途径参与细胞内钙的释放。     

丙泊酚对人子宫平滑肌细胞Ca2+跨膜内流和肌浆网钙释放功能的影响

目的观察丙泊酚对足月产妇子宫平滑肌细胞Ca2+跨膜内流和肌浆网Ca2+释放功能的影响,探讨其抑制子宫平滑肌收缩功能的可能机制。方法取正常孕足月待产的子宫平滑肌组织,胶原酶消化法培养子宫平滑肌细胞。①40个孔板中活性良好的子宫平滑肌细胞随机等分为4组(n=10):对照组(C组)、低浓度丙泊酚组(P1组)、中浓度丙泊酚组(P2组)、高浓度丙泊酚组(P3组),用Fluo-3AM钙荧光指示剂染色后,分别给予Hank液、10μmol/L丙泊酚(终浓度)、50μmol/L丙泊酚、250μmol/L丙泊酚处理20 min,然后加入40 mmol/L氯化钾,每个孔板在激光共聚焦显微镜下随机选定10个子宫平滑肌细胞,利用图形分析软件分析细胞内钙荧光强度,取钙荧光强度峰值的平均值反映子宫平滑肌细胞游离Ca2+浓度([Ca2+]i)。②再以20 mmol/L咖啡因代替氯化钾,其余处理及分组同前。结果①与基础值比较,各组加入丙泊酚后子宫平滑肌细胞[Ca2+]i差异无统计学意义(P>0.05),加入氯化钾后[Ca2+]i均升高(P<0.01);与C组相比,加入氯化钾后P1组子宫平滑肌细胞[Ca2+]i差异无统计学意义(P>0.05),P2组和P3组加入氯化钾后[Ca2+]i明显低于C组(均P<0.01),且P3组[Ca2+]i低于P2组(P<0.05)。②与基础值比较,各组加入丙泊酚后子宫平滑肌细胞[Ca2+]i差异无统计学意义(均P>0.05),加入咖啡因后[Ca2+]i升高(P<0.01);加入咖啡因后各组子宫平滑肌细胞[Ca2+]i差异无统计学意义(P>0.05)。结论丙泊酚可浓度依赖性地抑制足月产妇子宫平滑肌细胞电压依赖型钙通道开放而减少Ca2+跨膜内流,而对肌浆网Ryanodine型Ca2+释放功能无明显影响。     

SKF96365和氯化镍对环匹阿尼酸诱导的大鼠PASMC［Ca2＋］i升高的影响

目的：研究SKF96365和氯化镍（NiCl2）对环匹阿尼酸（CPA）诱导的大鼠远端肺动脉平滑肌细胞（PASMC）内游离钙离子浓度（[Ca2＋]i）变化的影响。方法培养大鼠PASMC,运用荧光显微镜和InCyte细胞内钙浓度检测系统观测CPA、SKF96365和NiCl2对PASMC[Ca2＋]i的影响。结果含5μmol／L硝苯地平的无钙Krebs溶液孵育PASMC,10μmol／LCPA使PASMC[Ca2＋]i短暂小幅升高,恢复细胞外Ca2＋至2．5mmol／L后,10μmol／LCPA使PASMC[Ca2＋]i迅速显著升高;50μmol／LSKF96365和500μmol／LNiCl2均能明显抑制10μmol／LCPA引起的PASMC[Ca2＋]i升高,但对高钾（60mmol／LKCl）溶液引起的PASMC[Ca2＋]i升高无影响。结论CPA可致大鼠PASMC[Ca2＋]i升高,且能被SKF96365和NiCl2阻断,提示CPA可能诱发细胞外Ca2＋经钙池操纵性钙通道（SOCC）内流,SKF96365和NiCl2能选择性抑制SOCC活性使经SOCC的Ca2＋内流减少。     

容积性钙内流与花生四烯酸介导性钙内流之间的相互作用

目的：在人胚肾细胞（HEK293 cells）研究容积性钙内流和花生四烯酸激活性钙内流的相互作用。方法：采用荧光探针Fura2/AM技术测定HEK293细胞内钙对花生四烯酸、Thapsigargin反应变化。结果：容积性钙内流可被花生四烯酸明显抑制，花生四烯酸所致钙内流亦可被容积性钙内流激动剂所抑制，这种交互抑制并非由药物化学性互相影响，肌浆网钙泵的抑制，钙池耗竭，或来自于容积性钙内流本身。相反，这种抑制可能与容积性钙内流激活过程和花生四烯酸激活过程相互作用在关。结论：容积性钙内流与花生四烯酸所致的钙内流呈现相互抑制作用，这种抑制可防止细胞出现中毒性钙超载。     

Influence of calcium influx on intracellular pH of neocortical and hippocampal neurons in primary culture

研究钙内流对原代培养的皮质和海马神经元内ｐＨ（ｐＨｉ）的影响。为了达到此目的，暴露单个神经元于谷氨酸（Ｇｌｕ，１００μｍｏｌ／Ｌ）或氯化钾（ＫＣｌ，５０ｍｍｏｌ／Ｌ）。用微荧光法测定细胞内游离钙（〔Ｃａ２＋〕ｉ）和ｐＨｉ。结果表明，Ｇｌｕ暴露或Ｋ＋－诱导的去极化可导致海马神经元明显酸化（△ｐＨ～０．４）。在无钙溶液中，这一ｐＨ降低被显著减少（Ｇｌｕ暴露）或转化成增高（Ｋ＋－诱导的去极化）。相反，皮质神经元对Ｇｌｕ的反应很弱，只有轻微的酸化。实际上，去极化诱导的ｐＨｉ在两种细胞中呈反方向变化。由上述结果得出结论：海马与皮质神经元的不同是海马神经元在钙通道激活后允许更大量的钙离子从细胞外液流入。     

Flunarizine inhibits sensory neuron excitability by blocking voltage-gated Na+ and Ca2+ currents in trigeminal ganglion neurons

Background  Although flunarizine has been widely used for migraine prophylaxis with clear success, the mechanisms of its actions in migraine prophylaxis are not completely understood. The aim of this study was to investigate the effects of flunarizine on tetrodotoxin-resistant Na⁺ channels and high-voltage activated Ca²⁺ channels of acutely isolated mouse trigeminal ganglion neurons.

Methods  Sodium currents and calcium currents in trigeminal ganglion neurons were monitored using whole-cell patch-clamp recordings. Paired Student’s t test was used as appropriate to evaluate the statistical significance of differences between two group means.

Results  Both tetrodotoxin-resistant sodium currents and high-voltage activated calcium currents were blocked by flunarizine in a concentration-dependent manner with the concentration producing half-maximal current block values of 2.89 μmol/L and 2.73 μmol/L, respectively. The steady-state inactivation curves of tetrodotoxin-resistant sodium currents and high-voltage activated calcium currents were shifted towards more hyperpolarizing potentials after exposure to flunarizine. Furthermore, the actions of flunarizine in blocking tetrodotoxin-resistant sodium currents and high-voltage activated calcium currents were use-dependent, with effects enhanced at higher rates of channel activation.

Conclusion  Blockades of these currents might help explain the peripheral mechanism underlying the preventive effect of flunarizine on migraine attacks.

     

ATP Evokes Calcium Transients in Single Pulmonary Artery Endothelial Cell in

（胡清华）（王迪浔）（张宇）（陈荣三）（王金唏）ＡＴＰＥｖｏｋｅｓＣａｌｃｉｕｍＴｒａｎｓｉｅｎｔｓｉｎＳｉｎｇｌｅＰｕｌｍｏｎａｒｙＡｒｔｅｒｙＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌｉｎＰｒｉｍａｒｙＣｕｌｔｕｒｅｓ￥ＨＵＱｉｎｇ－ｈｕａ，ＷＡＮＧＤｉ－...     

Effects of Arecoline on Calcium Channel Currents and Caffeine—induced Calcium Release in Isolated Single Ventricular Myocyte of Guinea Pig

Summary The effects of Arecoline (Are) on calcium mobilization were investigated. In isolated single ventricular myocyte of guinea pig, patch clamp whole cell recording techniques were used to record the current of L-type calcium channel and cytosolic Ca²⁺ level (Ca²⁺i) labeled with fluorescence probe Fluo-3/AM was measured under a laser scanning confocal microscope. Results revealed that Are (3–100 μmol/L) could inhibit L-type calcium current in a concentration-dependent manner and the value of IC₅₀ was 33.73 μmol/L (n=5). In the absence of extracellular calcium, the resting levels of [Ca²⁺]i was not affected by Are (n=6,P>0.05), but pretreatment with Are (30 μmol/L) could significantly inhibit the [Ca²⁺]i elevation induced by caffeine (10 mmol/L,n=6,P<0.01). It was concluded that Are could inhibit not only calcium influx through L-type calcium channel but also calcium release from sarcoplasmic reticulum. This project was supported by a grant from Natural Sciences Foundation of China (No. 39670661).