目标序列捕获二代测序技术在苯丙酮尿症基因诊断中的应用

 目的  评估目标序列捕获二代测序技术在苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)基因诊断中的应用价值。方法  采用目标区序列捕获及第二代测序技术对9例经典型PKU患者的苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)基因进行检测;采用Sanger测序技术对患者及其父母基因突变型进行验证。结果  9例患者检测到PAH基因的12种致病性突变,包括7种错义突变(p.I65T、p.F161S、p.Q204C、p.R241C、p.L242F、p.R243Q和p.Q375E),2种无义突变(p.R111X和p.Y356X),3种剪接突变［c.442 1G>A(IVS4 1G>A)、c.1315+6T>A(IVS12+6T>A)和c.1316 2A>C(IVS12 2A>C)］,以及3种非致病性的变异(p.Q232Q、p.V245V和p.L385L),致病性突变均来自患者父母。其中,2个致病性突变未见报道,分别为c.1316 2A>C和p.Q375E(CAA >GAA)。结论  目标序列捕获二代测序可以准确检测出PAH基因突变,对遗传病因明确的疾病具有一定的临床应用价值。     

WNT5B基因与人类神经管畸形(NTDs)的相关性

 目的 探讨WNT5B基因序列变异与人类神经管畸形(neural tube defects,NTDs)发生的相关性。方法 应用PCR-Sequencing和SNaPshot技术在163例NTDs患者和357例对照人群中进行WNT5B基因突变扫描和关联分析。结果 在NTDs患者的WNT5B基因中共检测到3个新发现的序列变异位点:c.-57-123G>A、c.622-38G>A和c.622-99C>T。其中,c.-57-123G>A位点变异在357例对照人群中未检测到,其为NTDs患者所特有的变异位点。对rs2270036(c.329-16T>C)、rs6489313(c.329-84G>A)和rs58317077(c.329-122T>C)这3个SNP位点的关联分析结果表明:在显性遗传模式下,rs58317077位点的C等位基因与NTDs的发生显著相关,携带C/C或C/T基因型的个体的患病风险是携带T/T基因型的个体的1.62倍(OR=1.62,95%CI=1.05~2.52,P=0.028);生物信息学预测结果表明:rs58317077位点的C等位基因会改变转录因子NF-kap和MZF1对该区域的结合。结论c.-57-123G>A和rs58317077位点的C等位基因是人类NTDs发生的遗传性风险因子。     

PAX6基因R203X无义突变导致家族性先天无虹膜

目的探讨一个先天性无虹膜家系致病的分子基础。方法对一个先天性无虹膜家系进行全面的眼部检查,采集该家系的4例患者和两名健康成员外周静脉血,提取基因组DNA。采用DNA直接测序的方法分析无虹膜候选致病基因PAX6的14个外显子及其外显子-内含子拼接部的序列。结果该家系患者PAX6基因第8外显子存在一个杂合性突变c.C607T,导致编码蛋白在203位的精氨酸(p.R203X)处提前终止,产生一个变异蛋白;而家系正常成员未发现此突变,表型与突变位点呈共分离。结论 c.C607T(p.R203X)突变是PAX6基因导致无虹膜的突变热点之一,也存在于中国无虹膜家系中。     

WNT9B基因新突变与子宫纵隔发生相关联

目的 明确6例子宫纵隔患者的遗传学致病因素。方法 应用全外显子组测序技术寻找患者潜在致病基因突变,之后通过Sanger测序验证患者WNT9B基因变异。结果 全外显子组测序发现两例患者分别携带WNT9B罕见变异c.71A>G;p.Y24C和c.832T>A;p.S278T。其中p.Y24C突变在不同物种中非常保守,且被多个在线功能预测程序预测为致病性变异。结论 WNT9B基因突变p.Y24C可能与子宫纵隔发生相关。     

六例KIF1A基因变异相关常染色体显性遗传神经发育障碍患儿临床和遗传学分析

目的:分析驱动蛋白家族成员1A(KIF1A)基因变异致常染色体显性遗传神经发育障碍患儿的临床和遗传学特点。方法:收集并回顾性分析2018至2020年在上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心就诊的6例KIF1A基因新生杂合变异患儿的临床及基因检测资料。致病性变异的确定基于对先证者行全外显子组基因测序，同时使用桑格测序对家系成员进行验证，并进一步采用生物信息学方法分析变异对蛋白三维结构以及稳定性的影响。结果:6例患儿中男性4例，女性2例，确诊年龄7月龄～18岁。6例患儿自幼即有不同程度的大运动发育迟缓，其中4例可走路患儿存在步态异常或易摔倒；2例患儿同时合并智力发育迟缓、癫痫以及眼部发育异常。基因检测发现6例患儿均存在KIF1A基因杂合新生突变，包括4个错义突变和1个剪接突变。除c.296C>T(p.T99M)和c.761G>A(p.R254Q)外，c.326G>T(p.G109V)、c.745C>G(p.L249V)和c.798+1G>A均未曾报道。生物信息学分析表明G109V和L249V可损害其与邻近氨基酸残基的结合从而损害蛋白质功能，并降低蛋白质的稳定性...     

近亲结婚1家系Leber先天性黑矇TULP1基因新突变

目的 检测近亲结婚Leber先天性黑矇(LCA)家系致病基因突变。方法 选择近亲结婚Leber先天性黑矇家系作为研究对象,收集家系成员眼科检查资料和病史,采集外周静脉血,提取DNA。先证者采用全基因组外显子测序技术进行致病基因突变筛查;通过生物信息学分析后得到候选致病突变位点。运用Sanger测序进行验证及家系共分离分析,确定致病性突变位点。结果 基因检测在先证者TULP1基因(MIM#602280)第11号外显子检测到新的纯和错义突变c.C1024G(p.R342G),编码区第1024位的核苷酸C(胞嘧啶)变异为G(鸟嘌呤),变异导致编码蛋白序列内的氨基酸改变p.R342G,第342号氨基酸由精氨酸(Arg)变异为甘氨酸(Gly)。342号氨基酸位点在不同物种间具有高度保守性。生物学信息预测提示为致病性。结论 TULP1基因纯和错义突变c.C1024G:p.R342G是该家系的致病原因。该纯合突变国内外均未见报道,是一种新发现的LCA致病基因突变。本研究扩大了LCA基因突变谱,为LCA基因治疗及发病机制研究提供了依据。     

板层状鱼鳞病TGM1基因突变的研究

目的探讨一个板层状鱼鳞病家系转谷氨酰胺酶I编码基因TGMl的致病性突变。方法提取板层状鱼鳞病患者及家系成员的外周血基因组DNA,采用PCR扩增TGMl基因15个外显子及外显子-内含子交界处,并行双向直接测序。结果患儿携带TGMl基因复合性杂合错义突变c．424C〉T（p．R142C）和c．967C〉T（p．R323W）,分别遗传自表型正常的母亲和父亲。结论复合性突变c．424C〉T和c．967C〉T可导致板层状鱼鳞病的发生。     

DYNC1H1基因突变导致以下肢受累为主的脊髓性肌萎缩症家系分析

目的 总结1个以下肢受累为主的脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy with lower extremity predominant,SMALED)家系的临床、电生理及影像特点,并对该家系进行致病突变分析.方法 收集2020年8月首都医科大学宣武医院确诊为常染色体显性遗传的1例SMALED患者的家系资料.采集先证者及其女儿的临床资料,进行血常规、肝功能、肌酸激酶等检验,肌电图和神经传导检查,脊髓、头颅、双下肢MRI检查,表型匹配分析,对先证者进行SMN1基因拷贝数检测和全外显子组测序分析.按照美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Ge-nomics,ACMG)和美国分子病理学会(Association for Molecular Pathology,AMP)基因变异解读标准和指南进行致病性分析,对先证者及其女儿进行Sanger验证.结果 家系调查发现,先证者及其女儿表型与SMALED表型匹配.两人均存在DYNC1H1基因(c.1792C＞T;p.R598C)杂合突变,根据ACMG和AMP指南考虑为强致病性突变.结论 在2例患者中鉴定出DYNC1H1基因p.R598C的致病性突变,符合常染色体显性遗传方式,提示对中国人群SMALED的研究需进行DYNC1H1基因检测.     

X染色体连锁显性遗传先天性眼球震颤家系的致病基因突变研究

目的对4个X染色体连锁显性遗传先天性眼球震颤(XL-CIN)家系进行候选致病基因FRMD7突变筛查。方法采集家系成员外周血5 ml,提取基因组DNA;以4个家系的先证者基因组DNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增FRMD7基因的全部外显子及其外显子-内含子拼接部的序列,DNA直接测序筛查突变位点;一旦发现突变致病性位点,则采用DNA双向测序方法在其他家系成员进行疾病与致病突变共分离分析,以及进一步确认突变,将患者的FRMD7基因外显子8和10的扩增产物克隆至TA克隆载体测序。结果 4个XL-CIN家系皆为X染色体连锁显性遗传伴外显不全,其中2个家系携带FRMD7基因已知致病性突变:XL-CIN 02家系存在c.G886C/GGT>CGT(p.G296R)错义突变,位于FRMD7基因外显子8;XL-CIN 03家系存在c.C910T/CGA>TGA(p.R304X)无义突变,位于外显子10。结论 FRMD7 G296R和R304X是导致XL-CIN 02和XL-CIN 03家系致病的主要原因。     

以糖尿病为主要表现的Johanson-Blizzard综合征分析

目的：探讨以糖尿病为主要表现的Johanson-Blizzard综合征（JBS）患者的临床表型和基因型。方法：收集JBS患者的临床资料、实验室检查、影像学检查，提取相关家庭成员的基因组DNA，使用全外显子组测序及Sanger测序验证。结果：患者以糖尿病为主要表现，伴有眼距增宽，鼻根低平，鼻翼发育不全，发际线低等畸形。基因检测证实UBR1 基因存在c.4463T＞C（p.Ile1488Thr）纯合错义突变，为新的突变位点，且致病性分析表明该位点为致病性突变。结论：该患者携带新的UBR1 基因c.4463T＞C纯合突变，提高了临床上对JBS临床表型谱的认识并拓宽了UBR1 基因的基因谱。     

雄激素不敏感综合征临床与遗传学分析

目的：分析雄激素不敏感综合征(androgen insensitivity syndrome,AIS)的临床特征与遗传学特点。方法：收集2015年至2020年重庆医科大学附属儿童医院就诊的10例AIS患者临床资料，提取患儿及父母外周血DNA，对患儿DNA样本进行内分泌疾病相关基因高通量测序，并进行家系DNA样本Sanger测序验证。结果：10例患者均检测到雄激素受体(androgen receptor,AR)基因变异，其中5个变异以前未报道过，分别是c.401dupA(p.P135Afs23)、1 350 bp缺失突变、c.2505C>G(p.Y835X)、c.1747T>C(p.F583L)和c.610G>T(p.E204X)，其中c.610G>T(p.E204X)为嵌合体突变。结论：本研究中5例未报道变异均可能致病，提示基因检测有助于AIS的确诊，有利于AIS患者的临床决策和遗传咨询。     

Rett综合征患儿甲基化CpG结合蛋白2基因和细胞周期依赖性激酶样5蛋白基因的突变

目的 了解Rett综合征(RTT)患儿甲基化CpG结合蛋白2基因(MECP2)和细胞周期依赖性激酶样5蛋白基因(CDKL5)突变及热点突变,建立适合临床诊断的检测方法和策略.方法 对1987至2007年北京大学第一医院儿科神经专业组诊断的177例散发RTT患儿抽取外周抗凝血提取DNA,用PCR-DNA测序方法对MECP2的全部外显子进行突变筛查,如未发现突变,用多重连接依赖的探针扩增(MLPA)法进行基因剂量分析.对MECP2未发现突变的患儿用变性高效液相色谱法(DHPLC)进行CDKL5突变筛查.结果 在177例患儿中发现145例MECP2突变,1例CDKL5突变,总的突变率82%.MECP2突变中错义突变频率最高(39%);其后依次为无义(28%)、移码(17%)和大片段缺失突变(14%).所有突变中8种最常见突变依次为p.T158M(13%)、p.R168X(12%)、c.806delG(7%)、p.R255X(6%)、p.R270X和p.R133C各(5%)、p.R306C(4%)、p.R106W(3%).11%的患儿存在一个或多个外显子的缺失.结论 中国RTT患儿MECP2突变谱和国外报道相似,有热点突变.c.806delG是中国人群特有的一个热点突变.     

嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者RET、VHL、SDHD、SDHB遗传基因变异的检测

目的：检测嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者的4种与该病相关基因（RET、VHL、SDHD、SDHB）的胚系遗传变异,以了解我国该病患者上述基因变异情况。方法：以2012年9月至2014年3月就诊于北京大学第一医院,并经病理确诊的嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者为研究对象,共入选12例,其中嗜铬细胞瘤患者11例,副神经节瘤患者1例。提取患者外周血白细胞DNA,采用PCR技术扩增RET基因的第10、11、13～16外显子,VHL、SDHD、SDHB基因的全部外显子,以及各外显子的邻近内含子（±20 bp）,并对扩增产物进行测序。比对测序结果及野生型序列,确定基因变异。对1例诊断为多发性内分泌腺瘤病2A型的患者进行家系分析,在家族成员中检测相应基因变异。结果：共3例患者发现胚系基因变异：1例恶性嗜铬细胞瘤患者存在SDHB基因c.136C>T（p.R46X）变异;1例多发性内分泌腺瘤病2A型患者存在RET基因c.1901G>A（p.C634Y）变异及c.2071G>A（p.G691S）/ c.2712C>G（p.S904S）变异,其家系中发现其他5名成员携带上述变异;1例散发、无恶性表现的嗜铬细胞瘤患者存在RET基因c.2071G>A（p.G691S）/ c.2712C>G（p.S904S）变异。1例患者存在先天性单心室畸形合并嗜铬细胞瘤,其上述4个基因均未发现有临床意义的变异。结论：本研究在25%（3/12）的嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者中发现了错义或无义胚系基因变异,包括SDHB基因的c.136C>T（R46X）变异、RET基因的c.1901G>A（C634Y）变异以及RET基因的c.2071G>A（p.G691S）/ c.2712C>G（p.S904S）变异等,其中前两种变异具有明确的致病性。本研究验证了上述变异在嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者中的存在,临床工作中应该对嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者开展广泛的遗传基因筛查。     

营养不良性大疱性表皮松解症COL7A1基因诊断及产前诊断

目的 分析2个营养不良性大疱性表皮松解症(DEB)家系致病基因COL7A1基因突变位点,并在此基础上探讨COL7A1基因分析用于产前诊断的可行性.方法 应用全基因捕获新一代测序(NGS)对2013年10月和2014年4月在郑州大学第一附属医院就诊的2个DEB家系中2例先证者COL7A1基因进行全基因突变检测,获得变异序列后,针对所检出变异序列进行PCR扩增后Sanger双向测序对2个DEB家系中2例先证者及其父母和100名健康个体的COL7A1基因序列进行突变验证分析,确定致病突变后,对其中1个家系中的高危胎儿进行孕早期产前诊断.结果 共发现4种COL7A1基因突变:c.5230G ＞T (p.E1744X)、c.5932C ＞T (p.R1978X)、c.5605-10 T＞G(IVS66-10 T＞G)、c.8305-1G＞A(IVS110-1G＞A).其中p.E1744X、IVS66-10 T＞G和IVS110-1G＞A为国际首次报道的突变.家系1中先证者携带COL7A1基因p.E1744X和p.R1978X无义突变,父母分别为杂合突变携带者;家系2中先证者携带COL7A1基因IVS66-10T＞G和IVS110-1G ＞A剪接区突变,父母分别为杂合突变携带者;100名健康个体未检测到上述突变.家系1中产前诊断胎儿携带与其先证者相同的突变为受累胎儿,胎儿父母选择治疗性引产术后,取胎儿标本行基因诊断,结果与产前诊断相同.结论 COL7A1基因突变是该2个DEB家系的致病原因,NGS结合Sanger测序方法可以快速且准确地进行该病的基因诊断和产前诊断.     

肾病综合征合并心律失常患儿1例临床特点及基因变异分析

目的：总结分析1例激素耐药性肾病综合征（SRNS）合并心律失常（房室传导阻滞、室性早搏）患儿的临床特征和基因变异特点,提高临床医师对该病的认识。方法：收集1例临床确诊为SRNS、房室传导阻滞和室性早搏患儿的临床资料,复习相关文献,分析其基因变异与临床特征的联系。结果：女性患儿,8岁2个月,临床表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高胆固醇血症、肾小球源性血尿、高血压,肾脏病理为局灶节段性肾小球硬化（FSGS）,予泼尼松和他克莫司治疗无效,符合SRNS的诊断,同时合并房室传导阻滞、室性早搏等心律失常表现。高精度临床外显子检测发现,患儿Podocin编码基因（NPHS2）存在复合杂合突变c.412C>T(p.R138*)和c.8710T(p.R291W);Sanger测序验证提示c.8710T(p.R291W)来源于母亲（杂合状态）,c.412C>T(p.R138*)为新发变异（杂合状态）。检出心脏钠通道孔隙形成α亚基基因（SCN5A）存在杂合变异c.4018G>A(p.V1340I),Sanger测序验证提示该变异来源于父亲（杂合状态）。结论：NPHS2基因突变是导致本例患儿发...     

伴镶边空泡远端肌病患者GNE基因突变分析

目的探讨5例伴镶边空泡远端肌病(DMRV)患者GNE基因突变类型。方法对5例患者行肌活检,所有患者及例5的父母、妹妹、女儿行GNE基因编码区外显子及其侧翼序列聚合酶链反应扩增,纯化后产物经测序比对分析基因突变点,应用SnaPshotTM技术在100名健康对照者中进行新发突变位点检测。结果 5例患者均携带GNE基因突变,例1-4为复合杂合子,例5为纯合子。共检测到已知突变6个,1个无义突变(p.R8X),5个错义突变(p.D176V、p.I298T、p.A591T、P.A631V、p.V696M),发现新发错意突变1个(c.317T>C,p.I106T),例5父母、妹妹及女儿均为P.A631V健康携带者。结论本研究为p.R8X、p.I298T、p.A591T、p.V696M突变首次在中国人群中的报道,且p.I106T为GNE基因新发突变,这些发现进一步扩展了中国人群GNE基因突变谱。     

家族性慢性良性天疱疮一家系ATP2C1基因突变检测

目的研究家族性慢性良性天疱疮一家系的ATP2C1基因突变情况。方法采用聚合酶链反应(PCR)及直接测序的方法对家系中4例患者ATP2C1基因进行突变检测,以家系中3例健康者和100例无血缘关系的正常人作对照。结果该家系4例患者ATP2C1基因的7号外显子第457位碱基胞嘧啶C被胸腺嘧啶T替代,导致第153位的精氨酸被终止密码子取代(R153X),家系中健康对照及无血缘关系的正常人均未发现该突变。结论无义突变c.457C>T(p.R153X)是导致该家系发病的主要原因。     

中国人群腺苷脱氨酶2缺乏症致病基因携带者筛查

目的 分析中国人群腺苷脱氨酶2缺乏症（deficiency of adenosine deaminase 2,DADA2）致病基因频率,为有效开展中国人群DADA2的防控和干预工作提供依据。方法 回顾性分析2015年1月至2021年1月于北京智因东方转化医学研究中心有限公司进行全外显子组测序的11.1万例原始数据,对ADA2基因致病和可能致病性突变进行携带者筛查,分析ADA2基因杂合突变的类型和等位基因频率。结果 发现29种ADA2基因致病和可能致病性杂合突变,其中6种[c.730G>T（p.E244X）、c.1049_c.1061delAGCTGCCTTACTT（p.K350Tfs*14）、c.940A>T（p.K314X）、c.1239+2（IVS8）T>C、c.1240-1（IVS8）G>A、c.1087C>T（p.Q363X）]既往未见报道,等位基因累计频率为0.58%。人群基因频率最高的为p.F355L（0.5%）,其次为p.Y453C（0.014%）和p.P193L（0.013%）,其他26种位点均小于0.01%,为罕见突变位点。结论 通过筛查丰富了ADA2基因突变谱,明确了中国地区人群的ADA2基因突变的携带率约1/171,推测中国人群的DADA2患病率约1/116 964。     

两个雄激素不敏感综合征家系中 AR基因突变检测

目的：对两个疑似雄激素不敏感综合征（ AIS）家系进行基因诊断和其他临床相关检查,旨在发现其致病基因并进行遗传咨询。方法：对两个AIS家系的先证者及相关成员行体格检查、染色体核型分析、内分泌检测及超声检查后,提取外周血全基因组DNA,扩增位于X染色体上AR基因的8个外显子,扩增产物测序后与基因库中正常人的序列进行比对,查找是否存在致病突变。结果：两个AIS家系的先证者均检测到AR基因突变,分别为c．2042T＞C（p．681I＞T）和c．1822C＞T（p．608R＞X）,家系中女性携带者中检测出了上述位点的杂合突变。家系1先证者行腹腔镜性腺切除术后证实性腺为睾丸。结论：AR基因的p．681 I＞T和p．608 R＞X是两个AIS家系患者的致病性突变;对AR基因进行基因检测是46,XY性发育异常,特别是AIS有效的诊断方式。     

温州地区非综合征型耳聋患者GJB3基因c.538C＞T突变及其临床表型分析

目的探讨温州地区非综合性耳聋患者GJB3基因c.538C＞T突变情况,结合患者的临床表型分析c.538C＞T突变的致病性。方法收集589例非综合征型耳聋患者的家系临床资料,采用耳聋基因芯片或Sanger测序法检测患者GJB2、SLC26A4、线粒体12SrRNA基因以及GJB3基因c.538C＞T突变情况,并以1288例听力正常的婚育女性作为对照,观察两者GJB3基因c.538C＞T突变检出率的差异。结果共检出5例耳聋患者和3例正常婚育女性携带GJB3基因c.538C＞T突变,分别占0.85%和0.23%,两者检出率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。5例携带该突变的耳聋患者其临床表型均为重度或极重度全频听力损失性耳聋,与文献报道有差异。结论与国内其他地区相同,GJB3基因c.538C＞T突变在温州地区非综合征型耳聋患者中的检出率低;该突变可能并非是上述耳聋患者的真正致聋原因;该位点致病性仍有待更大样本的数据进一步研究。