ITS基因测序对须癣毛癣菌的鉴定分析

目的 探讨ITS基因测序对须癣毛癣菌进行分子生物学鉴定的可行性,以确定致病菌株的种属.方法 从病人头皮及头发分离出一株真菌,采用直接涂片镜检和培养的方法,观察其镜下形态和菌落特征,同时取纯培养物进行普通PCR,PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析,Tanon-3500凝胶成像系统进行鉴定,收集目的片段进行ITS基因测序.结果 本菌的镜下形态和培养特征与其他毛癣菌属极其相似,难以直接鉴定分离菌为须癣毛癣菌,将其纯培养后用真菌通用引物ITS4、ITS5进行PCR扩增,所得的扩增片段大小约700 bp,将目的片段送至公司进行双向测序,测序结果经Blast比对,须癣毛癣菌与之相符率达99.5％.结论 ITS基因测序可以准确鉴定从临床分离的须癣毛癣菌.     

基因扩增联合测序法对痰标本分离的60株真菌病原学鉴定

目的:应用PCR扩增真菌ITS2区基因,结合基因测序法对痰标本中分离的60株真菌进行病原学鉴别。方法:收集痰标本分离的真菌菌落60份及2种真菌标准菌株(白色念珠菌,烟曲霉菌)培养菌落,分别提取基因组DNA,半巢式PCR扩增ITS2区,扩增产物经测序后,结果与NCBI基因库中的核酸序列进行比对,确定致病菌的种属,并对其分布特征进行分析。结果 :2种真菌标准菌株的ITS2区基因序列比对结果与种属一致。痰标本中60株真菌测序鉴定结果为:曲霉菌属24株(其中烟曲霉菌17例、黑曲霉菌3例、黄曲霉菌2例、土曲霉菌1例、变色曲霉1例),青霉菌属3株(小刺青霉菌1株、娄地青霉菌1株、产黄青霉菌1株),念珠菌属29株(白色念珠菌20株、热带念珠菌3株、近平滑念珠菌2株、光滑念珠菌2株、鲁西坦念珠菌1株、季也蒙毕赤酵母菌1株),其它丝状菌还有暗孢节菱孢菌2株,淡紫拟青霉菌1株和串珠状赤霉菌1株。结论:基因测序法能快速、简便、准确地鉴别痰培养的真菌种属,为本地区呼吸道真菌性疾病病原菌流行病学调查及个性化治疗奠定基础。     

应用rDNA ITS测序检测海南岛条件致病性真菌

目的:应用内转录间隔区(ITS)引物建立一种较为敏感、特异检测和鉴定条件致病性真菌的方法,为进一步鉴定不同真菌的种、型的亲缘关系提供分子生物学依据。方法:用常规的真菌检验方法对76份口腔标本做初步鉴定,采用通用引物ITS1、ITS4对可疑真菌菌悬液进行PCR扩增,PCR扩增产物纯化、DNA测序,做序列比对分析。结果:ITS-PCR扩增出种特异的DNA条带,检测菌株76株,DNA测序鉴定出白假丝酵母菌53株(69.7%),其他真菌23株(30.3%)。结论:采用ITS引物测序法,可准确地检测出不同种的条件致病性真菌,并为进一步鉴定菌株的变异性,发现亚种提供基础。     

临床难鉴定细菌和真菌核糖体基因扩增及序列分析

目的建立核糖体测序方法鉴定临床难鉴定的细菌和真菌。方法分别利用通用引物扩增细菌16S rRNA基因和真菌核糖体转录间隔区2（ITS2）,对PCR产物进行测序,在GenBank中对测序结果进行Blastn等分析。结果21株临床常见细菌和8株真菌测序结果与表型鉴定符合,检测出6株临床难鉴定细菌和真菌。结论核糖体测序可以作为临床难鉴定细菌和真菌的分子生物学诊断方法。     

虫卵基因序列分析鉴定斯氏并殖吸虫病

目的探索运用分子生物学技术分析虫卵基因序列鉴定并殖吸虫病。方法从云南省的并殖吸虫病流行区采集溪蟹,常规分离囊蚴,经形态学鉴定后感染实验终宿主家猫,从猫粪便中分离虫卵,对虫卵进行详细的形态学观察和鉴定。用匀浆器研磨虫卵提取基因组DNA,PCR扩增出虫卵中完整的核糖体基因第二间隔区(ITS2)和部分线粒体细胞色素C氧化酶亚单位I基因(COI),测序获得该基因的核苷酸序列。将核苷酸序列输入GenBank中进行Blast比较,通过ITS2和COI的同源性来判断所感染的并殖吸虫种类。结果取自猫粪便中的虫卵形态符合并殖吸虫卵的形态特征。该虫卵的ITS2基因序列与GenBank中的斯氏并殖吸虫的基因序列同源性为99%,COI基因序列的同源性也高达98%。结果鉴定为斯氏并殖吸虫虫卵,证明家猫感染的是斯氏并殖吸虫病。结论通过并殖吸虫卵的基因序列分析,不仅可以快速诊断并殖吸虫病,而且还能准确地鉴定感染者所感染的并殖吸虫虫种。     

长沙人间布鲁菌分离株omp25基因扩增和系统进化分析

目的了解长沙地区人间布鲁菌omp25基因的序列特征并阐明其系统进化关系,为布鲁菌病防控以及omp25基因克隆与表达研究提供参考。方法根据Gen Bank公布的羊种布鲁菌16M的omp25基因序列设计1对PCR引物,采用PCR法从长沙地区布鲁菌分离株基因组中扩增omp25基因,产物用凝胶电泳进行分析后进行双向核苷酸序列测定,测序结果用DNAstar 7.1进行分析,将测序结果提交Gen Bank,并利用Mega 7软件构建布鲁菌长沙分离株系统进化树。结果 41株布鲁菌成功扩增出omp25基因片段,片段长度约640 bp,通过测序后Blast同源性分析,证实41株菌株均为羊种布鲁菌,长沙分离株与10株羊种布鲁菌序列100%相同,进化树显示长沙分离的布鲁菌和国内外羊种布鲁菌位于同一进化分支上,同广西的LA1105参考株亲缘关系最近。结论长沙地区人间布鲁菌分离株omp25基因序列与参考菌株序列同源性高,且与羊种布鲁菌在同一分支,表明omp25基因序列是一个保守序列。该研究结果可为布鲁菌的分子生物学鉴定和诊断试剂的研制提供参考。     

rDNA⁃ITS序列分析鉴定皮肤癣菌的应用评价

目的：探讨对核糖体RNA（ribosomal RNA,rDNA）内转录间隔区（internal transcribed space,ITS）的基因扩增测序技术在皮肤癣菌鉴定中的应用价值。方法：从39株临床收集的皮肤癣菌临床标本和经培养后的标本中分别提取DNA,应用通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增和基因测序,测序结果在NCBI的基因库中查询,通过BLAST工具比对分析进行rDNA?ITS序列分析分子鉴定。同时根据形态特征、生长特性以及生理生化指标对经培养后的标本进行表型鉴定,并与分子鉴定结果相比较。结果：两组标本均成功扩增到ITS靶基因,经测序分析,临床标本和经培养后标本rDNA?ITS序列分析结果一致,与表型鉴定结果相吻合。结论：直接从临床标本中提取致病菌DNA并进行ITS基因序列扩增和测序分析可快速、有效鉴定皮肤癣菌。     

我国西南地区主要谷物表面污染真菌的分离与分子鉴定?

目的：了解我国西南地区2014-2015年产主要谷物污染状况,探索谷物表面污染真菌的快速鉴定方法。方法利用孟加拉红培养基进行谷物表面真菌的分离与纯化。选用扩增真菌18S 序列的通用引物 ITS1和ITS4,通过 PCR 扩增和序列分析进行菌种鉴定。结果从157份谷物样品中分离得到277株真菌,利用分子生物学鉴定方法成功鉴定,污染率为42.0%,其中小麦主要侵染真菌为枝孢菌属、链孢霉属和小光腔菌属,玉米、大米主要侵染真菌为链孢霉属、曲霉菌属和青霉菌属。结论我国西南地区谷物样品的污染现象比较普遍,产毒菌株污染较为严重,存在潜在风险。选用的引物通用性较好,可用于谷物表面污染真菌的鉴定。     

聚合酶链反应-反向线点杂交技术鉴定分枝杆菌的多中心评价

目的 评价以16S-23S rDNA间隔序列作为靶基因的聚合酶链反应-反向线点杂交(PCR-RLB)技术用于鉴定分枝杆菌.方法 在5个中心同时进行试验.采用PCR-RLB技术检测60株属于50个种的分枝杆菌标准株;10株非分枝杆菌标准株.以胶体金法结合测序法或是气相色谱(gas chromatography,GC)法作为对比,检测鉴定383株分枝杆菌临床分离株.结果 所有的分枝杆菌标准株和临床分离株PCR扩增产物均可与分枝杆菌属探针杂交, 而种特异性探针仅与相应的种杂交,非分枝杆菌PCR扩增产物均不与分枝杆菌属及种探针杂交.与胶体金法或是GC法结合测序法相比,PCR-RLB法准确率100%,成功地将380株分枝杆菌鉴定到种(另外3株仅鉴定到分枝杆菌层未鉴定到种),包括11株其他方法不能准确鉴定的混合感染.结论 以16S-23S rDNA间隔序列作为靶基因的PCR-RLB技术,鉴定分枝杆菌敏感性和特异性高,快速、实用,具有很好的临床应用前景.     

PCR在猴B病毒鉴定中的应用研究

目的为鉴定新分离毒株是否为B病毒.方法根据ScinicarielloF报道的引物,用PCR方法扩增BV147、HSV-1、HSV-2,对扩增产物进行SacⅡ内切酶消化.结果这一对引物可同时对这3种病毒进行扩增,但只有BV147的扩增产物可被SacⅡ内切酶切开.对BV147扩增片段克隆测序的结果证实,其与美国B病毒E2490株部分基因(UL27)相对应位置的核苷酸同源性为100%.结论初步建立了检测B病毒DNA的PCR方法并测定了新分离病毒毒株的部分基因序列,证明新分离的病毒为B病毒.     

血流感染病原菌AmpC酶及相关耐药机制的初步研究

目的 了解血流感染病原菌中产AmpC β-内酰胺酶(简称AmpC酶)菌株的分布情况和临床病例特点,并对相关基因ampC和ampD进行初步研究.方法 收集2006年1月-2008年9月血流感染革兰阴性菌181株,分别采用头孢西丁初筛试验和三维试验筛选产AmpC酶菌株和高产AmpC酶菌株;对初筛试验阳性相关临床病例进行回顾性分析.同时对初筛试验阳性菌株ampC,ampD基因PCR扩增、测序和比对,Rep-PCR分析ampC阳性菌株基因型.结果 181株病原菌中头孢西丁初筛试验法检出产AmpC酶39株,概率为21.5%(39/181);三维试验法检出高产AmpC酶菌株的概率为43.6%(17/39).PCR结果显示ampC和ampD基因阳性率分别为41%(16/39)和56.4%(22/39).对16株ampC阳性菌进行基因测序,与GenBank相应ampC核酸序列比对发现同源性达98%-100%;2株阴沟肠杆菌ampD基因的测序发现在ampD基因羧基端存在可疑的突变位点.结论 本研究相关败血症患者血流耐药病原菌感染主要源自院内感染.在产AmpC酶的血流病原菌中,ampC基因突变比较少见,而阴沟肠杆菌ampD基因突变发生率比较高,且ampD蛋白羧基末端氨基酸的缺失或替代可能与AmpC酶去阻遏表达高度相关.     

血流感染病原菌AmpC酶及相关耐药机制的初步研究

目的了解血流感染病原菌中产AmpCβ-内酰胺酶（简称AmpC酶）菌株的分布情况和临床病例特点,并对相关基因ampC和ampD进行初步研究。方法收集2006年1月-2008年9月血流感染革兰阴性菌181株,分别采用头孢西丁初筛试验和三维试验筛选产AmpC酶菌株和高产AmpC酶菌株;对初筛试验阳性相关临床病例进行回顾性分析。同时对初筛试验阳性菌株ampC、ampD基因PCR扩增、测序和比对,Rep—PCR分析ampC阳性菌株基因型。结果181株病原菌中头孢西丁初筛试验法检出产AmpC酶39株,概率为21．5％（39／181）;三维试验法检出高产AmpC酶菌株的概率为43．6％（17／39）。PCR结果显示ampC和ampD基因阳性率分别为41％（16／39）和56．4％（22／39）。对16株ampC阳性菌进行基因测序,与GenBaak相应ampC核酸序列比对发现同源性达98％～100％;2株阴沟肠杆菌ampD基因的测序发现在ampD基因羧基端存在可疑的突变位点。结论本研究相关败血症患者血流耐药病原菌感染主要源自院内感染。在产AmpC酶的血流病原菌中,ampC基因突变比较少见,而阴沟肠杆菌ampD基因突变发生率比较高,且ampD蛋白羧基末端氨基酸的缺失或替代可能与AmpC酶去阻遏表达高度相关。     

万古霉素耐药肠球菌的分子特征及同源性分析

目的 研究北京朝阳医院临床分离的万古霉素耐药肠球菌(VRE)的基因型及同源性.方法 采用WHONET软件调查北京朝阳医院2003年6月至2007年3月VRE的发生率,收集这段时间分离的、来自不重复患者的38株VRE,采用含6 ms/L万古霉素筛选平皿确定VRE.多重PCR及序列分析确定糖肽类耐药基因的基因型,脉冲场凝胶电泳(PFGE)确定耐药株的亲缘关系.结果 VRE较多出现在重症监护病房(34.2%,13/38).2003至2007年,VRE的分离率如下:2003年2.6%(5/190),2004年1.8%(6/340),2005年0.7%(2/271),2006年6.8%(20/294),2007年1至3月3.3%(5/153).38株VRE中,PCR和序列分析证明15株为vanB基因型,均为粪肠球菌,万古霉素最低抑菌浓度(MIC)在16～48 ms/L,替考拉宁MIC在0.4～0.5 ms/L;23株为vanA基因型,均为屎肠球菌,万古霉素MIC≥256 ms/L(除E31为32 ms/L),替考拉宁MIC在2～32 mg/L.23株vanA基因型屎肠球菌中有12株表现为vanA基因型、vanB表型.PFGE共分为10型,15株粪肠球菌中有14株均来自同一克隆(B型),1株分型未明;23株屎肠球菌中21株分为9型,主要是A、D、E、F型,2株分型未明.结论 北京朝阳医院流行的VRE主要有vanA、vanB两种基因型.vanA基因型屎肠球为多克隆传播,vanB基因型粪肠球为单克隆传播.部分vanA基因型屎肠球存在基因型与表型不一致现象.     

ITS结合RPS0两步PCR快速鉴定临床5种假丝酵母菌

目的:建立快速准确鉴定常见假丝酵母菌种类的基因检测技术。方法:提取假丝酵母菌基因组DNA;第一步PCR用通用引物扩增ITS基因;第二步三重PCR用种特异性引物扩增RPS0基因;分别对已知及未知样本检测、验证。结果:ITS基因扩增,光滑假丝酵母菌(Cg)和克柔假丝酵母菌(Ck)分别得到与预期结果吻合的881bp和419bp的PCR产物;白假丝酵母菌(Ca)、热带假丝酵母菌(Ct)和近平滑假丝酵母菌(Cp)的ITS扩增片段均略大于500bp;RPS0三重PCR对Ca、Ct和Cp DNA扩增,分别得到约310bp、147bp及110bp的片段,与预期结果相符;30株已知假丝酵母菌两步PCR检测结果,种类符合率为100%;43株未知样本两步PCR鉴定结果,经RPS0扩增产物序列测定,符合率亦为100%。结论:建立了ITS通用基因结合RPS0种特异基因鉴定5种常见假丝酵母菌种类的两步PCR技术,该技术简单、快速、准确及廉价;对双重感染患者更有鉴别优势,有临床应用价值。     

鲍曼不动杆菌TEM-1型ESBLs基因及其多重耐药的研究

目的分析产TEM-1型超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）鲍曼不动杆菌的耐药性及其基因序列。方法用聚合酶链式反应（PCR）扩增产ESBLs鲍曼不动杆菌的TEM-1型耐药基因，用克隆测序方法分析质粒上TEM-1型ESBLs基因。结果15株产ESBLs鲍曼不动杆菌中，TEM-1型ESBLs阳性菌株有12株，TA克隆后测序表明，与鲍曼不动杆菌（AY560328．1）bla TEM-1基因序列99％源。结论质粒上带产TEM-1型ESBLs的鲍曼不动杆菌，bla TEM-1基因与鲍曼不动杆菌多重耐药密切相关。     

16SrRNA序列分析技术对临床标本中疑难细菌的鉴定

目的：应用16S rRNA序列分析技术鉴定临床少见或疑难细菌,提高细菌鉴定的准确性。方法收集临床少见或疑难细菌44株,提取DNA,采用通用引物进行PCR扩增及目的片段基因测序,并将测序结果在核酸数据库中比对分析以确定菌种。结果44株临床少见或疑难细菌均扩增到16S rRNA目的基因片段并成功测序,40株(90．9%)鉴定到“种”,4株(9．1%)鉴定到“属”;其中常规方法与测序方法在“属”水平一致的有34株(77．3%),不一致的有10株(22．7%)。结论16S rRNA序列分析技术可以准确、快速地鉴定临床少见或疑难细菌,可以作为临床细菌鉴定的重要方法之一。     

A Five-year Surveillance of Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in a Pediatric Hospital in China Reveals Increased Predominance of NDM-1

Objective To characterize carbapenem(CPM)-non-susceptible Klebsiel a pneumoniae(K. pneumoniae) and carbape-nemase produced by these strains isolated from Beijing Children's Hospital based on a five-year surveillance. Methods The Minimal Inhibition Concentration values for 15 antibiotics were assessed using the Phonix100 compact system. PCR amplification and DNA sequencing were used to detect genes encoding carbapenemases. WHONET 5.6 was finally used for resistance analysis. Results In total, 179 strains of CPM-non-susceptible K. pneumoniae were isolated from January, 2010 to December, 2014. The rates of non-susceptible to imipenem and meropenem were 95.0% and 95.6%, respectively. In the 179 strains, 95(53.1%) strains carried the blaIMP gene, and IMP-4 and IMP-8 were detected in 92(96.8%) and 3(3.2%) IMP-producing isolates, respectively. 65(36.3%) strains carried the blaNDM-1 gene. 6(3.4%) strains carried the blaKPC gene, and KPC-2 were detected in 6 KPC-producing isolates. In addition, New Delhi-Metallo-1(NDM-1) producing isolates increased from 7.1% to 63.0% in five years and IMP-4 producing isolates decreased from 75.0% to 28.3%. Conclusion High frequencies of multiple resistances to antibiotics were observed in the CPM-non-susceptible K. pneumoniae strains isolated from Beijing Children's Hospital. The production of IMP-4 and NDM-1 metallo-β-lactamases appears to be an important mechanism for CPM-nonsusceptible in K. pneumoniae.     

尿路致病性大肠杆菌临床株I型菌毛FimH基因检测及分析

目的检测尿路致病性大肠杆菌 (uropathogenicEscherichiacoli,UPEC)临床株I型菌毛的携带频率 ,并对其粘附素基因FimH作序列分析。方法用血凝方法检测尿路致病性大肠杆菌的I型菌毛 ;根据GENEBANK的大肠杆菌I型菌毛粘附素FimH基因序列设计引物 ,用聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)检测临床分离的 15 5株UPEC的目的基因 ,选取典型阳性株的扩增产物测序。结果 15 5株尿路致病性大肠杆菌 ,用血凝方法仅检测到 5 5株携有I型菌毛 ,阳性率 3 5 .5 % ;而用基因扩增方法检测 14 0株 (90 .5 % )含有FimH基因。扩增产物序列与尿路致病性大肠杆菌标准株J96的序列基本一致。结论FimH基因存在于大多数尿路致病性大肠杆菌临床株中 ,是其重要毒力因子 ,具有重要的临床意义。