多重PCR快速检测3种致泻性大肠埃希菌方法的建立

目的利用多重聚合酶链反应(PCR)技术,建立一种可以同时快速检测肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)3种致泻性大肠埃希菌的多重PCR方法。方法根据EPEC的eae基因、EIEC的ipaH基因、EHEC的stx1基因筛选设计引物,建立多重PCR检测体系,并对PCR反应体系和条件进行优化。结果设计的3对PCR引物均能特异地扩增出相应的目的基因,该多重PCR体系能同时检测3种目的菌,特异度强。结论初步建立了一种能够同时快速检测3种致泻性大肠埃希菌的多重PCR检测方法,可用于食品安全及食物中毒事件的快速筛查。     

虎红平板凝集试验检测人血浆布氏菌抗体干扰来源分析及处理对策

目的探讨虎红平板凝集试(RBPT)检测人血浆中布氏菌抗体干扰来源及处理对策。方法选取14例布病抗体阳性人员和20例健康人员,收集血清和枸橼酸钠、K2EDTA、肝素钠抗凝血浆,分别做RBPT和试管凝集试验(SAT)分析干扰情况;20例健康人员血清中分别加入3种不同抗凝剂后做RBPT分析是否抗凝剂直接干扰;20例健康人员3种不同抗凝剂血浆加入凝血酶时间(TT)检测试剂,温育1 h后,取上清做RBPT分析干扰来源和应对措施。结果 14例布病抗体阳性血清和血浆SAT结果相同;20例健康人员血清和血浆的RBPT结果完全相反,血清中加入3种不同抗凝剂对RBPT无影响,经TT试剂去除纤维蛋白原处理后的血浆标本除肝素钠组外,其他RBPT结果均与血清组相同。结论血浆不能直接做RBPT,纤维蛋白原能与虎红抗原产生非特异性凝集,是RBPT干扰的来源;可以通过TT试剂去除纤维蛋白原后消除干扰;在无法得到血清标本时,也可以直接用血浆做SAT来提供诊断参考。     

沙门菌属LAMP检测方法在食品卫生检验中的应用评价

目的探讨沙门菌属环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法在食品卫生检验中的应用价值。方法利用文献报道的LAMP检测方法和分离培养法分别对135份食品标本进行沙门菌检测,评价LAMP法和分离培养法的一致性。结果 LAMP方法检出14份食品标本沙门菌阳性,阳性率为10.4%,电泳和加荧光染料染色后均能判断结果;分离培养法检出6份食品标本沙门菌阳性,阳性率为4.4%。LAMP法检出阳性率高于培养法(P=0.021)。LAMP方法可在24 h内从食品中检测出沙门菌,而分离培养法检出沙门菌需要4~7 d,LAMP检测方法更快速。结论沙门菌属LAMP方法检测阳性率高于分离培养法,LAMP方法可用于食品中沙门菌的核酸检测。     

10种食源性疾病病原体高通量LAMP分子鉴别检测体系的建立及应用

目的建立一种LAMP分子鉴别检测体系,应用于10种食源性疾病病原体的分子鉴别检测。方法针对8种细菌（沙门菌属、志贺菌属、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、EHEC O157：H7、奇异变形杆菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌）和2种病毒（Norwalk病毒和轮状病毒）分别建立LAMP和RT-LAMP方法,分别对25种常见肠道细菌和病毒进行LAMP扩增,水浴箱内65℃扩增60 min（LAMP）或120 min（RT-LAMP）,扩增完成后利用电泳和肉眼进行结果判断。对365份食源性疾病患者呕吐物、肛拭子和食品等标本进行10种食源性疾病病原体LAMP分子检测。结果 10种食源性疾病病原体LAMP或RT-LAMP方法均只对靶病原体出现阳性结果,电泳显示为LAMP特异性梯状条带,加SYBRGreen I后肉眼观察反应液变为绿色;8种细菌性病原体LAMP检测方法的敏感度为3×100~1.2×102cfu/ml,其中6种LAMP方法敏感度高于PCR方法,其他病原体（霍乱弧菌、EHEC O157：H7、Norwalk病毒和轮状病毒）敏感度与PCR方法相同。从365份标本中检出沙门菌属11份、志贺菌属6份、金黄色葡萄球菌13份、EHEC O157：H7 2份、副溶血性弧菌2份、单增李斯特菌2份、Norwalk病毒12份和轮状病毒7份。结论建立了一个较为完整的LAMP分子鉴别检测体系,可以在一台水浴箱内同时对10种食源性疾病病原体进行高通量的分子鉴别检测,具有快速、不需要特殊仪器和肉眼判断结果的优势,适合基层单位的实验室开展食源性疾病的分子鉴别诊断。     

长沙市家禽市场环境中H5N1亚型禽流感病毒传播风险研究

目的 对长沙市家禽市场职业暴露人群进行禽流感病毒（AIV）H5N1亚型抗体水平和环境AIV核酸检测,并对环境中AIV H5N1亚型的血凝素（HA）基因进行测序分析。方法 抽取长沙市1个区和1个县,各选择2个城区或乡镇家禽市场进行职业暴露人群H5N1抗体和环境AIV核酸检测。利用单放射免疫扩散溶血实验（SRH）对102份家禽市场职业暴露人员血清标本进行H5N1抗体检测,real-time PCR方法检测160份家禽市场环境标本（污水、禽类粪便、羽毛和禽类笼具表面涂抹标本）AIV核酸,对4份污水H5N1亚型AIV核酸阳性标本进行HA基因RT-PCR扩增和TA克隆测序,测序结果利用Lasergene和Mega 5.0软件进行氨基酸比对和进化树构建。结果AIVH5N1抗体监测结果显示,家禽市场职业暴露人群血清H5N1抗体阳性率为25.5%（26/102）,其中乡镇和城区家禽市场职业暴露人群阳性率分别为50.0%（9/18）和25.4%（17/67）,乡镇家禽市场职业暴露人群阳性率高于城区。长沙市家禽市场环境中H5亚型AIV核酸阳性率为31.3%（50/160）,其中乡镇家禽市场阳性率为37.3%（31/83）,高于城区家禽市场24.7%（19/77）;不同标本H5亚型AIV核酸阳性率不同：污水（50.0%,24/48）、羽毛（44.5%,4/9）、禽类粪便（29.8%,14/47）和禽类笼具表面涂抹（14.3%,8/56）;差异均有统计学意义（P＜0.01）。TA克隆测序得到4个AIVH5N1亚型HA基因序列,进化树显示4个AIVH5N1亚型HA基因与中国内地和香港禽来源的AIV分离株为同一分组,属于欧亚分支;4个AIV H5N1亚型HA基因受体结合位点氨基酸序列仍然为禽源（QSG）、HA1和HA2蛋白之间连接肽为多个碱性氨基酸序列（RERRRKK或RERRGKK）,与入源AIV H5N1亚型具有相同的受体结合位点和高致病性的分子特征。结论 长沙市家禽市场环境中存在较多数量的AIVH5N1亚型,是导致职业暴露人群抗体阳性率达25.5%的原因之一;环境中存在的AIVH5N1亚型HA基因表现出来的高致病性分子特征,增加了家禽市场环境中发生AIV传播的风险。     

痰中结核分枝杆菌DNA提取方法的比较及在LAMP检测中的应用

目的:对5种DNA提取方法进行比对,为选择适用于痰中结核分枝杆菌DNA的提取方法提供依据。方法:采用PureLink genomic DNA kits(PLKm)、苯酚与氯仿法(PCm)、Chelex-100法(Cm)、磷酸盐缓冲液法(PBm)及硅珠法(SBm)5种方法提取痰标本中的DNA,对提取产物的浓度、纯度等技术指标进行分析,并对核酸扩增结果进行统计。结果:DNA浓度均值由高到低依次是PBm、Cm、PCm、SBm、PLKm,组间比较差异有统计学意义,两两比较发现PLKm与PCm、Cm、PBm之间差异有统计学意义,但Cm与SBm间的比较有统计学意义;5种提取方法的OD260:OD280比值均值与1.8的接近程度依次是PLKm、PCm、Cm、PBm、SBm,组间比较差异有统计学意义,两两比较发现除SBm与另外4种方法间存的差异具有统计学意义外,其余各组间的比较均无统计学意义;采用PLKm、PCm及Cm提取的产物均扩增出阳性结果,而PBm、SBm提取产物分别有18例和11例未获得阳性结果,经Mc-Nemar x2检验方法间的差异有统计学意义。结论:Chelex-100提取痰标本中结核分枝杆菌DNA是一种简便、省时、廉价适用于基层结核病实验室进行核酸检测的方法。     

快速检测单核细胞增生李斯特菌LAMP方法的建立

目的:建立一种检测单核细胞增生李斯特菌核酸的快速、特异的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification,LAMP)方法。方法:针对单核细胞增生李斯特菌的李斯特菌溶血素hlyA基因设计4条LAMP引物,在水浴箱内65℃保温约60 min,完成对单核细胞增生李斯特菌的扩增,扩增产物经肉眼、SYBR Green I染色和电泳鉴定。利用LAMP和PCR方法同时检测1株单核细胞增生李斯特菌和10株非单核细胞增生李斯特菌(对照组)来验证LAMP方法的特异性。用LAMP和PCR方法分别检测一系列稀释后的单核细胞增生李斯特菌菌液,比较两者的敏感性。结果:经肉眼、加染料和电泳均能观察到1株单核细胞增生李斯特菌LAMP扩增阳性反应,10株非单核细胞增生李斯特菌没有出现LAMP扩增。LAMP敏感度比PCR高,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌的检测下限为3 cfu/ml,PCR检测下限>300 cfu/ml。LAMP检测速度比PCR更快,只需要60 min。结论:建立了一种检测单核细胞增生李斯特菌的快速、特异的LAMP方法。     

2016-2018年长沙市人群及活禽市场环境H5N6亚型禽流感病毒监测分析

目的开展2016-2018年长沙市人群感染和活禽市场(live poultry markets,LPMs)环境污染H5N6亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)监测,为防控人感染H5N6亚型AIV提供实验室数据。方法采集2016-2018年长沙市流感样病例和不明原因肺炎病例咽拭子6909份及LPMs环境样品1719份,利用实时RT-PCR进行A型、H5、H7、H9和N6亚型AIV核酸扩增,并对82份AIV核酸阳性样品进行高通量核苷酸测序,然后对测序结果进行BLAST比对和氨基酸(amino acids,aa)关键位点分析。结果从6909份病例的咽拭子样品中检出H5N6亚型AIV核酸阳性1份,从1719份LPMs环境样品中检出A型AIV核酸阳性927份(53.93%),H5N6亚型AIV核酸阳性193份(11.23%)。高通量核苷酸测序获得14株H5N6亚型AIV的基因组序列,aa关键位点分析显示病毒血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白连接肽第338~347位出现6个碱性aa,对禽表现为高致病性的分子特征,受体结合位点(receptor binding site,RBS)第238~240位aa(对应H3型流感病毒第226~228位编码aa)为QSG或QRG,受体特征为禽源。神经氨酸酶(neuraminidase,NA)蛋白第290位耐药基因位点aa未出现R290K突变现象,对NA抑制剂(达菲/磷酸奥司他韦)敏感;病毒PB2蛋白发生E627K和D701N(I)突变,表明病毒致病力强。结论长沙市人群感染H5N6亚型AIV为偶发,LPMs环境H5N6亚型AIV污染较重,需要进一步加强LPMs环境AIV监测。     

96、97年长沙市城区一次性使用卫生用品的消毒监测

为了解我市一次性使用卫生用品的卫生状况，加强卫生监督，保护生产厂家和消费者合法权益，保证人们的身体健康，９６、９７两年来我们共完成２６１个一次性使用卫生用品，包括卫生巾、一次性婴儿尿布（裤）、餐（面）巾纸、卷筒纸和条状卫生纸的消毒监测，现将监测结果报...     

长沙市疾控系统离退休人员血糖、血脂异常调查及其相关性分析

目的了解疾控系统离退休人员血糖、血脂水平,分析高血糖与高血脂的相关性。方法利用生化分析仪对416名50岁以上离退休人员进行血糖、血脂检测。结果血脂异常率73.08%,高脂血症罹患率66.35%,血糖升高率24.04%,85.00%血糖升高患者伴有高脂血症。结论本组人群血脂、血糖异常率较高,女性高脂血症罹患率明显高于男性。高脂血症作为糖尿病的病理基础又是易患因素,应引起高度重视。