系统性红斑狼疮自体外周血干细胞移植T细胞克隆基因谱型变化

目的 通过系统性红斑狼疮(SLE)自体外周血干细胞移植(APBSCT)前后T细胞受体B(TCRβ)CDR3基因表达谱型的变化,探讨SLE发病机理以及患者干细胞移植后T淋巴细胞克隆的免疫重建特征。方法 应用RT-PCR扩增APBSCT的SLE患者外周血的TCRβ可变区(V)25个家族的基因序列,在长泳道测序胶上电泳,形成TCRβCDR3基因表达谱型图。通过谱型图上电泳条带分析SLE移植前T细胞克隆增生的特征以及移植后T细胞克隆群的变化,做增生T细胞克隆的TCRβ基因序列分析,了解TCRβ基因与自身免疫病的相关性。结果 正常HCRβV25个家族的基因序列电泳后分别出现呈高斯分布的10余条电泳条带,组成CDR3基因表达谱型图。8例SLE患者谱型图均出现异常,4例TCRβ在β3V13．1基因家族T细胞出现寡克隆增生,3例在βV8,βV9,βVl5家族中出现寡克隆性增生。APBSCT后T细胞克隆分布趋于正常,CDR3恢复多态性,部分恢复到正常TCRβ基因分布。测序结果显示谱型图上单一条带过度浓集往往是单克隆或者寡克隆T细胞增殖;发现SLE一个异常T细胞克隆的TCRβV8 CDR3氨基酸序列与已报道强直性脊椎炎疾病相关克隆完全一致。结论 SLE患者出现T细胞寡克隆增生,增生的T细胞克隆可能与自身免疫病发病有关。APBSCT后免疫重建,抑制了致病的T细胞寡克隆,可能是移植后SLE治疗缓解的主要因素。     

肺结核患者外周血αβT细胞CDR3谱系研究

目的探讨活动性肺结核患者外周血T细胞TCRα,β链CDR3谱系漂移,为肺结核患者特异性T细胞免疫应答机制和免疫治疗研究提供基础。方法采用基因扫描谱型分析技术,分析6例正常献血员及6例活动性肺结核患者PBMC中T细胞TCR CDR3谱型分布特征及患者TCRVα和Vβ基因家族的优势取用情况,对克隆性增生T细胞CDR3区进行序列分析。结果6例正常献血员外周血中TCR 32 Vα,24Vβ家族CDR3谱型均呈高斯分布(gaussian distribution),6例活动性肺结核患者出现不同Vα和Vβ家族优势取用,对部分单/寡克隆增生T细胞α,β链CDR3区基因进行测序,证实存在不同的CDR3序列。结论肺结核患者活动期外周血T细胞TCRα,β链CDR3谱系出现明显漂移,提示CDR3的选择性表达与结核患者细胞免疫应答机制有关,优势取用Vα,Vβ家族T细胞TCR CDR3序列的确定,为肺结核患者特异性T细胞免疫治疗研究提供基础。     

肺结核患者外周血alpha/betaT细胞CDR3谱系研究

[摘要] 目的 探讨活动性肺结核患者外周血T细胞TCR α、 链CDR3 谱系漂移，为肺结核患者特异性T细胞免疫应答机制和免疫治疗研究提供基础。方法 采用基因扫描谱型分析技术，分析6例正常献血员及6例活动性肺结核患者PBMC中T细胞TCR CDR3谱型分布特征及患者TCR Vα和Vβ基因家族的优势取用情况，对克隆性增生T 细胞CDR3区进行序列分析。结果 6例正常献血员外周血中TCR 32 Vα、24 Vβ家族CDR3谱型均呈高斯分布（gaussian distribution），6例活动性肺结核患者出现不同Vα和Vβ家族优势取用，对部分单/寡克隆增生T细胞α、 链CDR3区基因进行测序，证实存在不同的CDR3序列。结论 肺结核患者活动期外周血T细胞TCR α、 链CDR3谱系出现明显漂移，提示CDR3的选择性表达与结核患者细胞免疫应答机制有关，优势取用Vα、Vβ家族T细胞TCR CDR3序列的确定，为肺结核患者特异性T细胞免疫治疗研究提供基础。     

寻常型天疱疮患者外周血T细胞受体β链可变区CDR3基因克隆谱型分析

目的:探讨寻常型天疱疮（PV）患者外周血T细胞受体（TCR）互补决定区（CDR3）基因谱型变化,了解克隆扩增的T细胞与自身免疫性疾病的相互关系。方法:采用免疫扫描谱型分析技术,分析6例正常人外周血单个核细胞TCR β链可变区(BV) CDR3谱型分布特征以及6例PV患者CDR3谱型变化情况。结果:6例正常人TCR BV CDR3谱型均符合正态分布,6例PV患者TCR BV CDR3谱型均出现多态性降低,BV亚家族单/寡克隆增生。结论:PV患者外周血TCR可变区β链CDR3谱型异常可能与PV发病有关。     

基因扫描分析小鼠T细胞受体CDR3谱型检测T细胞克隆技术的建立

目的 建立小鼠T细胞受体(TCR)互补决定区3(CDR3)谱型的基因扫描分析术,为分析T细胞克隆提供研究方法.方法 应用RT-PCR方法分别扩增近交系小鼠C57BL/6H-2b,Balb/CH-2d和F1代小鼠[Balb/cx C57BL/6 F1H-2d/b,CB6F1)脾脏T细胞的21个TCK Va家族和18个TCK VB家族的CDR3,并用基因扫描分析扩增产物以确定T细胞的克隆性.结果 3种小鼠脾脏T细胞均表达所有的TCR Vα和Vβ CDR3基因,基因扫描显示全部TCK CDR3谱型呈高斯(钟型)分布,提示均为多克隆T细胞.各家族CDKs基因表达频率接近,但呈现不同的多态性和长度分布.结论 基因扫描分析TCR.αβ CDR3基因谱型是检测小鼠T细胞克隆性的精确敏感方法.     

系统性红斑狼疮患者外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移和序列鉴定

目的 探讨系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移，为SLE的免疫应答机制和个性化治疗研究提供基础。方法 采用免疫扫描谱型分析技术，分析5例正常献血员的CDR3分布特征及5例SLE患者PBMC中T细胞TCRβ链CDR3的优势利用情况，对克隆性增生T细胞的CDR3区进行序列分析。结果 5例正常献血员PBMC TCR BV CDR3谱型均呈高斯分布，5例活动型SLE患者24TCR BV CDR3家族均出现不同的优势表达。对单／寡克隆性增生T细胞B链CDR3区基因进行测序，证实存在不同的CDR3序列。结论 SLE活动期外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系出现明显漂移，提示CDR3的选择性表达可能与SLE的免疫发病机理有关。特异应答的T细胞TCRCDR3序列的确定，将为SLE的发病机制研究和个性化治疗提供新的方法与手段。     

FQ-PCR溶解曲线技术分析白血病患者PBMC中T细胞TCR仪／βCDR3谱系特征

目的采用FQ-PCR溶解曲线技术分析临床白血病患者外周血单个核细胞（PBMC）中T细胞TRAV和TRBV基因各家族的CDR3谱系特征。方法提取4例健康志愿者和15例临床白血病患者PBMC中mRNA,逆转录成cDNA,FQ-PCR扩增32个TRAV基因和24个TRBV基因家族的CDR3区,FQ—PCR溶解曲线技术分析CDR3谱系特征,并测序分析单克隆家族CDR3区氨基酸序列的组成。结果4例健康志愿者PBMC中（α／βT细胞的CDR3谱系FQ-PCR溶解曲线峰型图,均表现为多峰图;而15例白血病患者PBMC中α／βT细胞CDR3谱系FQ—PCR溶解曲线峰型图,多数患者出现寡或偏峰型图、低或无峰型图、典型的单峰型图;不同白血病患者异常峰的频率不一致;单峰型图TRAV和TRBVPCR产物基因测序,未发现不同患者存在完全相同的CDR3区。结论FQ-PCR溶解曲线技术能很好的分析白血病患者PBMC中TCRα／βCDR3谱系的单、寡、多克隆性增殖;非T细胞白血病患者PBMC中TCRα／βCDR3的单峰（或寡峰）家族T细胞,可能来源于机体对肿瘤应答的T细胞,而在T细胞白血病患者,可能为肿瘤T细胞或机体抗肿瘤T细胞。本实验可为进一步研究白血病的免疫应答机制和个体化治疗提供基础。     

外周造血干细胞移植后及出现GVHD时T细胞β链CDR3谱型分析

目的 初步探讨外周造血干细胞(PBSC)移植后以及出现移植物抗宿主疾病(GVHD)时,外周血T细胞a链的CDR3谱型变化和特征.方法 采用免疫扫描谱型分析技术,监测1例重型β-地中海贫血移植前、移植后23 d、GVHD时(移植后28 d)患者外周血单核细胞(PBMC)及供者PBSC标本T细胞a链的CDR3谱型变化,基因扫描(GeneScan)和测序分析克隆性增生T细胞TCR分子特征.结果 患者移植前PBMC的24个TCR BV家族CDR3谱型均呈高斯分布,部分家族在移植后23 d、和GVHD时呈现为寡峰和单峰,同时部分家族消失,单克隆增生T细胞TCR beta链的测序结果 显示不同的CDR3区组成,设计特异的CDR3引物进一步分析提示其可能来源于干细胞移植后的分化.结论 PBSC移植后23 d,PBMC中的多数24TCRBV家族CDR3谱型表现为多克隆,GVHD时,部分家族出现明显的单、寡克隆增生,这些特异T细胞可能在GVHD中发挥重要作用.对移植前后TCRCDR3谱型和特异TCR分子特征的分析将有助于PBSC移植后免疫重建的评估和出现排斥反应时的特异性治疗.     

APL细胞诱导脐血TCR Vα和Vβ亚家族T细胞增殖和细胞毒性研究

目的 了解急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞体外诱导脐血T细胞的TCR Vα和Vβ亚家族克隆性增殖及针对APL细胞特异性杀伤情况.方法 采用混合淋巴细胞和肿瘤细胞培养(MLTC)方法,利用APL细胞体外诱导脐血T细胞增殖,用RT-PCR和基因扫描分析MLTC后T细胞的29个TCR Vα亚家族基因和24个TCR Vβ亚家族基因的互补决定区(CDR3),了解各亚家族的T细胞克隆性增殖特点,并应用LDH法分析诱导增殖的T细胞针对APL细胞特异性杀伤作用.结果 经APL细胞刺激后增殖的脐血T细胞表达部分Vα和Vβ谱系基因,并在Vα10、Vβ5和Vβ15出现有克隆增殖趋势,诱导后T细胞对APL细胞的杀伤性均高于未诱导组的T细胞.结论 APL细胞体外诱导脐血T细胞出现抗原相关的TCR Vα和Vβ亚家族优势利用和克隆性增殖;诱导后的T细胞对APL细胞具有特异性细胞毒性作用.     

KG1a细胞体外诱导人外周血T细胞杀伤活性和TCR Vβ T细胞增殖的研究

【摘　要】　目的　了解急性髓系白血病KG1a细胞体外诱导人外周血T细胞的特异性细胞毒作用和T细胞受体(TCR) Vβ谱系表达和克隆性情况。方法　分别以Jurkat和Raji细胞作为阳性和阴性对照，建立TCR Vβ谱基因扫描技术，并用其检测5例健康个体T细胞克隆表型。采用混合淋巴细胞/肿瘤细胞培养方法，以照射后的KG1a细胞作为刺激原体外诱导外周血单个核细胞增殖，应用LDH释放法检测不同效靶比时诱导前后T细胞杀伤KG1a细胞的活性，同时利用基因扫描技术分析诱导后TCR Vβ亚家族的克隆性增殖特点。结果　基因扫描显示5例健康人全部TCR Vβ谱型均呈高斯(钟型)分布，各亚家族表达频率接近，但呈现不同的多态性和长度分布。KG1a细胞可以诱导出呈单克隆、寡克隆或寡克隆趋势生长的亚家族T细胞，并具有特异性识别和杀伤KG1a细胞的功能。结论　KG1a细胞在体外可诱导T细胞呈克隆性增殖，此优势增殖的克隆性T细胞具有特异性细胞毒作用，对KG1a细胞具有选择性杀伤作用。     

IL-2体外诱导健康人外周血T细胞TCR β链CDR3谱系漂移的研究

目的 研究IL-2对体外培养的T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移的影响.方法 分离健康志愿者外周血T细胞,加入IL-2,常规体外培养,乳酸脱氢酶释放法检测其非特异性杀伤活性;采用免疫谱型分析技术,分析其CDR3长度以判断T细胞的克隆性.结果 3例健康志愿者外周血T细胞对鼻咽癌细胞系CNE2没有杀伤作用;PBMC的TCR Vβ CDR3谱型均呈高斯分布,经IL-2体外培养后部分家族出现不同的优势表达.结论 IL-2对体外培养的T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移有一定影响,对其非特异性杀伤无影响.     

抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体介导的αβT细胞CDR3谱系漂移

目的探讨抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体(BHL-1)介导的αβT细胞CDR3谱系漂移,为双特异性抗体介导的T细胞免疫应答机制提供理论基础。方法采用免疫扫描谱型分析技术,分析6例正常献血员T细胞在人卵巢癌SKOV3细胞联合BHL-1刺激前后的TCR库多样性变化(CDR3谱型分布特征)及刺激后T细胞TCRα、β链CDR3优势利用情况,对克隆性增生T细胞的CDR3区进行序列分析。结果刺激前6例正常献血员TCR CDR3谱型均呈高斯分布,刺激后发生CDR3谱系漂移,部分TCR Vα、Vβ家族出现优势增生,明确了BHL-1介导下单克隆增生T细胞的α、β链CDR3序列。结论 SKOV3联合BHL-1诱导的T细胞CDR3谱系出现明显漂移,提示CDR3的选择性表达可能与BHL-1介导的特异性T细胞免疫反应有关,特异应答T细胞TCR CDR3序列的确定,将为卵巢癌的T细胞免疫治疗提供基础。     

难治性天疱疮自体外周血干细胞移植后T细胞受体克隆性的分析

目的探讨难治性天疱疮患者自体外周血干细胞移植（APBSCT）前、后T细胞抗原受体B链（TCRl3）互补决定区3（CDR3）基因表达谱型变化,深入了解天疱疮发病机制以及患者造血干细胞移植后T细胞克隆的免疫重建特点。方法应用RT—PCR方法扩增天疱疮患者移植前、后外周血单个核细胞24个TCRl3CDR3区段基因序列,分析其基因表达情况。采用免疫扫描谱型分析技术,分析正常人外周血单核细胞TCRl3链CDR3谱型分布特征,以及难治性天疱疮患者干细胞移植前、后CDR3谱型变化情况。结果动员前天疱疮患者TCRl3CDR3谱型均出现异常,表现为一定程度的T细胞单（寡）克隆增生性表达;移植后12个月内仍出现部分表达缺失及寡克隆表达;而后T细胞克隆分布渐趋于正常,CDR3恢复多态性。结论难治性天疱疮患者外周血T细胞表现单（寡）克隆增生,CDR3多态性降低,可能与其发病机制有关。APBSCT后的免疫功能重建恢复了CDR3的多态性,提示造血干细胞移植是治疗难治性天疱疮的有效手段。     

慢性特发性血小板减少性紫癜相关T细胞克隆的T细胞受体特征

目的研究与特发性血小板减少性紫癜（ITP）发病相关的反应性T细胞克隆的T细胞受体13链可变区（TCRBV）基因特征。方法应用逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）扩增25例ITP患者和20名正常人外周血以及20例脐带血的TCRBV24个家族的基因序列,在长泳道测序胶上电泳,形成TCRBV互补决定区3（CDR3）基因表达谱型图。通过谱型图上电泳条带分析TCRBV基因分布特征,切割代表性条带测序。结合临床特点进行分析。结果（1）急性ITP（aITP）和慢性ITP（cITP）的TCRBV CDR3基因表达谱型图有明显不同,15例aITP浓集条带与正常对照组相比,差异无统计学意义（P=0．179）。10例cITP则都出现以一些浓集条带为代表的寡克隆T细胞增生,浓集条带明显多于正常对照组（P〈0．05）。其中6例cITP在TCRBV8亚家族分别出现1～2条浓集条带,共8条浓集条带,3例cITP在TCRBV 13．1亚家族各出现1条浓集条带,4例cITP在TCRBV 14亚家族出现5条浓集条带,3例cITP在TCRBV17亚家族出现4条浓集条带。将这20个浓集条带直接测序,有19个条带测序为单克隆T细胞扩增,1条BV14条带测序呈多克隆性。（2）比较10例cITP患者T细胞克隆的TCRBV基因或者编码CDR3的氨基酸,其中2例患者的TCRBV8全部基因序列相同,另有3例患者的TCRBV13．1全部基因序列相同。4例cITP患者中有2例的T细胞克隆TCRBV17的CDR3完全一致,全部序列仅仅框架区4有3个氨基酸不同,另有2例的T细胞克隆的TCRBV17的CDR3序列仅有4个氨基酸不同,表明不同cITP患者有同样或者功能类似的TCRBV基因编码的T细胞克隆增殖。不同患者分属不同TCRBV基因家族的19个T细胞克隆的CDR3区共用3种模体,有7个T细胞克隆的TCRBV CDR3共用模体E（D）TQYFGPG;4个T细胞克隆的TCRBV CDR3共用模体N（K）EQFFGPG;4个TCRBV17的T细胞克隆中有3个T细胞克隆的TCRBV17 CDR3共用模体GANVLTTGAG。结论cITP发病与特定的T细胞寡克隆扩增有关,这些T细胞克隆的CDR3共享3种可能结合同样抗原的模体。aITP没有明显的T细胞克隆变化。