t—PA指形区,上皮生长因子样区缺失突变体cDNA克隆的构建及…

研究ｔ－ＰＡＦ区和ＥＧＦ区在ｔ－ＰＡ郭清中的作用。利用本室构建的ｔ－ＰＡｃＤＮＡ克隆，采用片段重组技术缺失突变指形区，上皮生长因子样区和部分三角区，组装了由逆转录病毒长末端重复顺序启动和终止的ｐＭＤＧＢ△ＦＥ表达质粒。     

t－PA cDNA基因在CHO细胞中的稳定表达

建立稳定表达人组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔ－ＰＡ）的细胞株。将ｔ－ｐＡｃＤＮＡ连接在真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＨｉｎｄⅢ位点，构建成重组质粒ｐｃＤＮＡ３ｔＰＡ，用磷酸钙介导的贴壁细胞转染法导入哺乳动物中国仓鼠卵巢（ＣＨＯ）细胞中，Ｇ４１８筛选培养后形成阳性克隆。结果：培养液中重组ｔ－ｐＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔ－ｐＡ，ｒｔ－ｐＡ）活性＞６０００ＩＵ／１０６细胞ｄ－１．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证实ｔ－ＰＡｃＤＮＡ基因的转录。高表达细胞连续传代１０次后，培液中ｒｔ－ｐＡ活性未见明显变化。结论：转染ｔ－ＰＡｃＤＮＡ基因的ＣＨＯ细胞已形成稳定的工程细胞。     

胰岛素样生长因子结合蛋白－3基因在乳腺癌中的表达

我们应用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ法、组织原位分子杂交、细胞生长曲线和ＤＮＡ合成等技术，检测９例人类乳腺癌细胞株和２０例乳腺癌标本中胰岛素样生长因子结合蛋白－３（ＩＧＦＢＰ－３）基因的蛋白质和ｍＲＮＡ水平的表达，研究其生物学作用。结果：①在乳腺癌细胞株中，雌激素受体阴性（ＥＲ－）者，分泌大量的ＩＧＦＢＰ－３，而雌激素受体阳性（ＥＲ＋）者不分泌ＩＧＦＢＰ－３；②在乳腺癌病人标本中，ＥＲ（－）者ＩＧＦＢＰ－３ｍＲＮＡ的定量表达明显高于ＥＲ（＋）者（Ｐ＜０．００５）；③ＩＧＦＢＰ－３能明显增强乳腺癌ＭＣＦ－７细胞株胰岛素样生长因子－Ⅰ（ＩＧＦ－Ⅰ）所致的细胞生长和ＤＮＡ合成作用。结论：我们认为ＩＧＦＢＰ－３基因蛋白质和ｍＲＮＡ的表达水平有可能成为乳腺癌患者的预后指标。     

肿瘤坏死因子α基因转染人脑胶质瘤浸润淋巴细胞的实验研究

采用脂质体转染技术将能表达肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ－α）基因的重组逆转录病毒质粒ｐＬ（ＴＮＦ－α）ＳＮ导入病毒包装细胞ＰＡ３１７，在细胞培养上清液中得到重组病毒，滴度为１．４×１０９ＣＦＵ／Ｌ。将此病毒上清液感染人脑胶质瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ），用Ｇ４１８筛选出能表达标记基因ＮｅｏＲ的阳性克隆，ＥＬＩＳＡ法测得ＮｅｏＲ阳性ＴＩＬ培养上清液中存在ＴＮＦ－α，可达５３０ｎｇ／Ｌ，Ｌ９２９依赖细胞法并测出上清液中有ＴＮＦ－α生物学活性。结果表明，我们构建的重组逆转录病毒可介导ＴＮＦ－α基因在人脑胶质瘤ＴＩＬ中的表达     

rhG—CSF cDNA表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组人表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ＰＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５     

供转导PDGF-A基因的高滴度逆转录病毒的制备

目的制备高滴度供转导血小板衍生生长因子Ａ链（ＰＤＧＦ－Ａ）基因的重组逆转录病毒,为体内、外深入研究该基因表达产物自分泌和旁分泌的生物学功能奠定基础。方法将人ＰＤＧＦ－ＡｃＤＮＡ片段插入含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子序列的逆转录病毒ＧＩＮａ载体的多克隆位点中,将构建的重组质粒导入病毒包装细胞ＰＡ３１７中,经Ｇ４１８筛选并扩增,以病毒液感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,测病毒滴度,选择出抗性克隆,进行免疫组织化学检测,表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析和３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测生物学活性。结果病毒滴度最高为１．４×１０５ＣＦＵ／ｍｌ;免疫荧光染色法和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实ＰＤＧＦ－ＡＡ的表达;抗性细胞条件培养基的细胞活性高达５１．２Ｕ／（１０６·ｄ）。结论供转导ＰＤＧＦ－Ａ基因的高滴度逆转录病毒得以制备,该基因获得有效表达,表达产物具有明显的致丝裂活性。     

血小板衍化内皮细胞生长因子原核表达载体的构建

目的 构建血小板衍化内皮细胞生长因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）的原核表达载体。方法 设计引物扩增ＰＤ－ＥＣＧＦ的ｃＤＮＡ,然后亚克隆入原核表达载体ｐＱＥ和ｐＱＥ－３２ａ,并转化入大肠杆菌ＪＭ１０９。结果 通过菌落原位杂交、ＰＣＲ和重组质粒酶切分析等方法,筛选出重组阳性克隆。结论 此重组质粒可用于原核表达等进一步研究。dir     

用双拷贝逆转录病毒载体转导入G—CSFcDNA的实验研究

为克服逆转录病毒中内部启动子对插入外源基因表达的干扰，将人Ｇ－ＣＳＦ（粒细胞集落刺激因子）ｃＤＮＡ插入双拷贝载体Ｎ２Ａ的３＇ＬＴＲＵ３区上的多克隆立点，酶切鉴定后将重组质粒用电击转导法转入Ｐｓｉ－２嗜单性包装细胞系，经Ｇ－４１８选择压力，两周后挑出阳性克隆，测定感染滴度后转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，选择挑出抗性克隆，测定Ｇ－ＣＳＦ表达量，最高达５３．３Ｕ／１０＾６细胞。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅ     

大肠癌上皮c-myc蛋白、表皮生长因子受体和增殖细胞核抗原的表达及其与预后意义

应用免疫组化ＬＳＡＢ法检测ｃ－ｍｙｃ、表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）和增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）对有随访资料的大肠癌的表达。结果提示：ｃ－ｍｙｃ阳性表达中，大肠癌（７０４９％）明显高于正常粘膜（２６６％，Ｐ＜０．０５）。正常大肠粘膜未发现ＥＧＦＲ阳性表达，而大肠癌有较高表达（７７０４％）。ＰＣＮＡ阳性表达中，大肠癌（４６４０±２６．５）％明显高于正常粘膜（１５１２±５．４４）％，Ｐ＜０．０５）。ＥＧＦＲ表达与大肠癌Ｄｕｋｅｓ分期有关（Ｐ＜０．０５）。ＰＣＮＡ表达与大肠癌分化程度及Ｄｕｋｅｓ分期有关（Ｐ＜０．０５）。大肠癌４年生存率ＥＧＦＲ和ＰＣＮＡ表达＞６５％组均明显低于＜２５％组（Ｐ＜０．０５），ＥＧＦＲ－ＬＩ和ＰＣＮＡ－ＬＩ与生存期均有明显负相关。结论表明：ｃ－ｍｙｃ、ＥＧＦＲ和ＰＣＮＡ表达与大肠癌的大肠癌细胞增殖有相关性。ＥＧＦＲ和ＰＣＮＡ表达与大肠癌的生存期均有明显负相关，该两项指标对大肠癌临床诊治和预后的评估有重要价值。     

EB病毒LMP与EGF自分泌在鼻咽癌细胞生长中的作用及其相互 …

以ＬＭＰ基因转染ＣＮＥ１细胞对象，用放射免疫分析（ＲＩＡ）和细胞增殖实验（ＭＴＴ）等方法，研究ＥＢ病毒ＬＭＰ和ＥＧＰ自分泌在高分化鼻咽细胞株ＣＮＥ１生长增殖中的作用和关系，结果示：从细胞培养液中检获ＥＧＦ；细胞可在血清培养液中生长，说明ＣＮＥ１细胞具有ＥＧＦ自分泌促生长功能，转染ＰＣＭＶα－ＬＭＰＤＮＡ的ＣＮＥ１细胞ＬＭＰ的ＰＣＲ和ＬＭＰ单抗免疫组化检测均为阳性，证明ＬＭＰ基因转染成功，ＥＧＦ自分     

内皮-平滑肌联合培养:细胞间相互作用对组织型纤溶酶原激活剂的影响

作者建立一个新的摹拟动脉壁结构的内皮和平滑肌细胞体外联合培养模型,并以此检测内皮、平滑肌细胞在合成和分泌组织型纤溶酶原激活物(t-PA)中的相互影响。结果表明,不同细胞组分的条件培养液(CM)中,t-PA活性有明显差异。内皮的CM中,t-PA活性最高,而平滑肌的CM中则最低。两种细胞联合培养时,培液的t-PA活性也明显比单纯内皮的降低。提示了细胞间的相互作用对血管壁溶栓机制的影响。     

心血管疾病基因治疗的基础研究Ⅱ．Pro－UK和t－pA基因的体外表达

构建了带有人的全长Ｐｒｏ－ＵＫ或ｔ－ｐＡ基因ｃＤＮＡ的逆转录病毒质粒ｐＮ２－ＣＭＶ－ＵＫ或ｐＮ２－ＣＭＶ－ｔＰＡ。重组质粒转染包装细胞ＰＡ３ｌ７后获得含假病毒的培养上清。用假病毒上清感染培养的血管平滑肌细胞（ＶｓＭＣ），经Ｇ４ｌ８筛选得到抗性集落。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，Ｐｒｏ－ＵＫ或ｔ－ｐＡ基因已整合到宿主细胞染色体。在转染的ＶＳＭＣ中，Ｐｒｏ－ＵＫ和ｔ－ｐＡ的含量分别为２６５ｎｇ／１０７细胞／２４小时和５．６ｎｇ／１０７细胞／２４小时。溶圈法测定结果证明，Ｐｒｏ－ＵＫ基因导入细胞后可以表达出有生物活性的尿激酶原。     

EXPERIMENTAL WORK AND RESEARCH

ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬＷＯＲＫＡＮＤＲＥＳＥＡＲＣＨＥｆｆｅｃｔｓｏｆＲｈｅｕｍｏｆｆｉｃｉｎａｌｅｏｎｔｈｅＲｅｎａｌＨｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙａｎｄＨｙｐｅｒｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＳｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ－ＩｎｄｕｃｅｄＤｉａｂｅｔｉｃ...     

双胸蚓溶栓酶制剂对家兔血浆t—PA与PAI活力的影响

从双胸蚓组织分离、提取的溶栓酶制剂含有纤溶酶类及纤溶酶原激活物,具有良好的溶解血栓作用。动物实验表明该制剂能使体内t-PA活力增加,但不影响PAI活力。     

脑血栓形成患者体外反搏后血浆t－PA，PAI，D－dimer的变化及意义

了解体外反搏治疗对脑血栓患者的疗效及作用机制。用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）和比色分析法分别测定了２０例脑血栓形成患者和１０例非脑血栓形成患者体外反搏前后血浆组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｓｕｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔ－ＰＡ）和纤溶酶原激活剂抑制物（ｐｌａｓｍｉｎｏｇａｃｔｉｖａｔｏｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＰＡＩ）活性及Ｄ－二聚体（Ｄ－ｄｉｍｅｒ）含量的变化。结果：检测到脑血栓形成患者在体外反博（ＥＣＰ）后，血浆ｔ－ＰＡ活性增高伴有Ｄ－ｄｉｍｅｒ含量增加；在非脑血栓形成患者有血浆ｔ－ｐＡ活性增高无Ｄ－ｄｉｍｅｒ含量变化。ＰＡＩ的活性于两组中均无变化。结论：体外反搏治疗后，脑血栓患者血浆中ｔ－ＰＡ水平升高，并可使纤维血块溶解。     

老年高血压病患者纤溶功能及血小板活化状态的改变

采用抗人活化血小板α颗粒膜蛋白（ＧＭＰ－１４０）单克隆抗体ＳＬ－５ｌ和１２５Ｉ－Ｓ１２以及单克隆酶联免疫法、发色底物法测定５８例老年高血压（ＥＨ）患者血浆ＧＭＰ－１４０、血栓素Ｂ２（ＴｘＢ２）、６酮－前列腺素Ｆ１α（６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α）浓度、组织型纤溶酶原激活物（ｔ－ＰＡ）含量及活性以及纤溶酶原激活抑制物（ＰＡＩ）活性，并与２０例健康人作对照。结果表明，ＧＭＰ－１４０、ＴｘＢ２、ＰＡＩ活性显著高于对照组，６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α、ｔ－ＰＡ显著低于对照组。将所得血浆各值与动态血压（ＡＢＰ）监测各指标作单相关分析，提示ＰＡＩ、ＧＭＰ－１４０、ＴｘＢ２与２４小时收缩压、舒张压、白昼收据压、舒张压呈显著正相关，６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α与２４小时收缩压、白昼收缩压呈显著负相关。     

银屑病病人血清表皮生长因子的变化及其意义

①目的探讨表皮生长因子（ＥＧＦ）与银屑病发病的关系。②方法采用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法对６４例银屑病病人和２４例健康成人的血清ＥＧＦ进行测定。③结果银屑病病人血清ＥＧＦ明显增高,与对照组相比较,差异具有显著性（ｔ＝４．３７,Ｐ＜０．０１）,且随银屑病病人皮损的加重,ＥＧＦ增高明显（Ｆ＝６．７９,ｑ＝３．４７～５．３８,Ｐ＜０．０５,０．０１）。④结论血清ＥＧＦ增高与银屑病的发病及皮损严重程度有密切关系     

慢性肺心病血浆纤溶活性的动态变化

对慢性肺心病患者血浆纤溶指标监测发现:与正常组相比,急性加重期t-PA含量,PAI活性明显升高,t-PA活性、t-PA比活性,活性型t-PA明显降低;t-PA含量分别与PaCO_2、PaO_2呈正、负相关;缓解期t-PA含量更高,PAI活性降低,t-PA活性回升到接近正常值水平.     

血清饥饿和表皮生长因子上调人肝癌细胞表皮生长因子受体的研究

目的探讨血清饥饿以及EGF对人肝癌细胞EGFR表达的影响。方法用免疫组化方法研究血清饥饿、5ng／mlEGF和25ng／EGF对人肝癌细胞EGFR表达的影响。结果撤血清培养组、5ng／mlEGF和25ng／mlEGF刺激组人肝癌细胞EGFR的表达阳性细胞分别为(5.66±0.86)％、(10.67±1.26)％和(16.83±1.66)％,与正常对照组(1.81±0.75)％相比较差异显著(P<0.01),EGF刺激组比血清饥饿组明显增高(P<0.01)、25ng／mlEGF组比5ng／mlEGF组增高(P<0.01)。结论血清饥饿和EGF能明显增强人肝癌EGFR的表达,且EGF上调EGFR表达的作用具有剂量依赖效应。     

化学发光剂标记纤维蛋白原测定组织型纤溶酶原激活剂

用EDC法将ABEI标记于Fg上,不影响Fg转变成F及F对t-PA的结合能力。ABEI-Fg固相后测定对F有结合能力和对Pg有激活活性的t-PA。用这个方法。t-PA在0.078…40IU/nì范围,浓度对数值与发光计数值呈直线正相关,灵敏度比溶解圈法高30倍以上。检测样品批内水平均变异系数6.63％,批间平均变异10.27％,样品中加入t-PA标准的平均回收率98.57％,样品液中加入40mM6—氨基已酸能抑制非特异蛋白水解酶对固相F-BBEI的非特异水解,不影响t-PA与F结合。